초록 ▼

당뇨병 환자가 전 인구의 8% 이상이고, 심혈관계, 신경계 질환 등의 다양하고 심각한 합병증을 동반하며 그 치료가 어렵다. 치료가 어렵기 때문에 장차 당뇨병이 발병할 가능성이 있는 잠재적인 환자를 조기진단 함으로써 예방적인 조치가 가능하리라 생각되었다. oligonucleotide chip은 유전자에 돌연변이나 염기차이 이상에 따른 질병 검사 및 병원성 미생물 검사에 이용할 수 있는 대단히 효과적인 방법이다. 본 연구에서도 당뇨병과 관련된 인자의 돌연변이 부위에서 돌연변이의 비율이 높으면 당뇨병에 걸릴 확률이 높은 것으로 진단할 수

당뇨병 환자가 전 인구의 8% 이상이고, 심혈관계, 신경계 질환 등의 다양하고 심각한 합병증을 동반하며 그 치료가 어렵다. 치료가 어렵기 때문에 장차 당뇨병이 발병할 가능성이 있는 잠재적인 환자를 조기진단 함으로써 예방적인 조치가 가능하리라 생각되었다. oligonucleotide chip은 유전자에 돌연변이나 염기차이 이상에 따른 질병 검사 및 병원성 미생물 검사에 이용할 수 있는 대단히 효과적인 방법이다. 본 연구에서도 당뇨병과 관련된 인자의 돌연변이 부위에서 돌연변이의 비율이 높으면 당뇨병에 걸릴 확률이 높은 것으로 진단할 수 있으며 이것은 당뇨병 조기진단 kit로서 유용하게 쓰일 수 있다.
따라서 본 연구는 최근 주목받고 있는 functional genomics approach에 따라 본 연구단이 보유하고 있는 다양한 당뇨질환 임상검체를 이용하여 당뇨병 관련 유전자 염기배열 순서를 비교 분석하여 이를 이용한 제 2형 당뇨병 진단용 DNA chip을 개발하고자 하였다. 현재까지 당뇨병과 관련된 많은 인자들의 프로모터에서 돌연변이가 보고되었다. 당뇨병의 유발 원인과 밀접하게 연관이 있는 Hexokinase Ⅱ(HK Ⅱ), Hepatocyte Nuclear Factor 3beta(HNF3b), Glucokinase(GCK), Glycogen synthase(GS) 그리고 Glucose transporter type 2(GLUT2)를 선정하였으며 HK Ⅱ -1159, HNF3b -213, GCK -30, GS -250 그리고 GlUT2 -44의 돌연변이에 해당하는 부위를 17mer의 올리고를 합성하여 silylated slidednl에 붙여주었다. 정상인과 제 2형 당뇨병 환자의 혈액에서 genomic DNA를 분리한 후 PCR을 하였다. 40℃에서 hybridization을 수행한 결과 normal 상태에서 hybridization이 된 것을 확인할 수 있었다. oligonucleotide chip의 경우, 한 base의 돌연변이를 15-25mer oligonucleotide probe으로 확인해야 하므로, 특이적인 반응 조건을 잡기가 까다롭다. 따라서 시험적으로 고착시킨 probe들을 allele 특이적으로 결합시키어 선별적으로 구분하기 위해서는 chip에 고정된 probe의 디자인이 중요하며 그 크기, 염기 유사체의 도입, Hybridization 용액의 조성, Hybridization의 조건, Washing 조건 등이 중요한데, 약 150∼300base pair 정도의 각 유전자의 PCR 산물을 많이 생산하였고 probe와 유전자 PCR 산물간의 결합 정도를 조절하기 위하여 각기 여러 조합으로 변환된 probe set에 대하여 조사하였다.
현재 mutation과 관련하여 그 부위의 돌연변이 여부를 확인하고 결과의 신빙성을 더해주기 위해 sequencing을 하며 계속적인 연구가 진행중이다. 성공적으로 chip이 만들어지면 향후 10년안에 당뇨병 조기 진단 kit의 상용화가 가능하여 고부가 가치의 수익을 얻을 수 있을 것이다.

Abstract ▼

The incidence of type 2 diabetes (NIDDM) is more than 8% among general population. Longstanding diabetes causes serious complications in the CNS, peripheral nervous as well as cardiovascular system. Thus, development of an early diagnostic method to detect late onset diabetes is critical in managing

The incidence of type 2 diabetes (NIDDM) is more than 8% among general population. Longstanding diabetes causes serious complications in the CNS, peripheral nervous as well as cardiovascular system. Thus, development of an early diagnostic method to detect late onset diabetes is critical in managing the disease, because early detection well help prevent the early occurrence of the disease. To this end, we have attempted to develop an early diagnostic method to predict the occurrence of NIDDM using oligonucleotide chip.
Oligonucleotide chip is a newly developed technique detecting a single base changes in the genome. Because NIDDM in known to be a multigenetic disease, and, in fact, many mutations in the diabetes related genes are reported, we hvae dopted the known mutations to diabetes related genes are reported, we have adopted the known mutations to design a oligonucleotide chip. Based on this genetic data, we have designed oligonucleotides that can detect mutations in the hexokinase Ⅱ(HK Ⅱ), hepatocyte nuclear factor 3 beta(HNF3b), glucokinase(GCK), glycogen synthase(GS) and glucose transporter type2(GLUT2) which are well known o be diabetes-related genes. We have synthesized 17 base pair oligonucleotides including mutation site of HKII at -1159, HNF3b at -213, GCK at -30, GS at -250 and GlUT2 at -44 as probes DNA. Probe DNAs were spotted onto known positions on a silylated slide(Cell Associates) by Nano plotter(GeSIM). The concentration of probe DNA was 0.5 μM. The genomic DNA of both normal and NIDDM patients were amplified by PCR in the presence of Cy3 and Cy-5 labeled dCTP. The sizes of amplified DNA from both group ranges between 119 ∼ 300 base pair. The hybridization patterns were compared with two different positions in the sequence. In this study, we were able to set up a condition that allows specific binding of normal or mutant probes. Currently, we are screening mutations in the PCR amplified genomes of normal and NIDDM patients using the oligonucleotide chip.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...7
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 2,총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...7
• 1) 염기배열 순서가 다른 부위를 인식할 수 있는 oligonucleotide 합성...8
• 2) 제2형 당뇨병의 진단을 위한 DNA(oligonucleotide chip)개발(version 1.0)...9
• 3) Target DNA 준비...9
• 4) Target DNA 와 Probe의 Hybridization...10
• 5) Scanning and Data Analysis...11
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...12
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...14
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...18
• 6.첨부서류...18
• 7.참고문헌...19