보고서 정보
주관연구기관 |
울산대학교 University of Ulsan |
연구책임자 |
김영미
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2002-05 |
과제시작연도 |
2002 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO200400000511 |
과제고유번호 |
1460002368 |
사업명 |
보건의료기술개발사업 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
인슐린저항증.지방대사.PPAR.LDLR.insulin resistance.lipid metabolism.PPAR.LDLR.
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초록
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지방에 의해 유발되는 인슐린저항증과 동맥경화의 발병에 동시에 관여하는 인자를 탐색하고, 인자들의 작용 기전을 연구하기 위해, 고지방식이 rat 모델을 만들고, 적출한 간 조직에서 인슐린저항증 관련 유전자 및 염증관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 또한 LDL receptor의 promoter를 luciferase에 연결한 construct를 이용하여 PPAR-gamma coactivator (PGC-1) 및 $PPAR-{\gamma}$에 의한 LDL receptor 및 CYP7A1의 발현조절 기전을 규명하였다.
지방에 의해 유발되는 인슐린저항증과 동맥경화의 발병에 동시에 관여하는 인자를 탐색하고, 인자들의 작용 기전을 연구하기 위해, 고지방식이 rat 모델을 만들고, 적출한 간 조직에서 인슐린저항증 관련 유전자 및 염증관련 유전자의 발현양상을 조사하였다. 또한 LDL receptor의 promoter를 luciferase에 연결한 construct를 이용하여 PPAR-gamma coactivator (PGC-1) 및 $PPAR-{\gamma}$에 의한 LDL receptor 및 CYP7A1의 발현조절 기전을 규명하였다.
Sprague Dawley계 웅성 랫드 (250g)를 사용한 실험군은 정상군(N), 정상+17β-ethinyl estradiol (EE) (10mg/kg, sc, 4일간) 처리군(NE), 고지방 식이(분말 사료, 2% 콜레스테롤, 5% lard oil, 0.3% cholic acid, 0.1% 6-propyl-2-thiouracil, ad. libitum, 40일간) 처리군(H) 고지방식이+EE (HE) 처리군 등 총 4군으로 나누었다. 고지방식이로 혈중 콜레스테롤 농도는 약 600㎎/dl로 증가하였으며, estrogen의 처리에 의해 정상화되었다.
이들 rat 모델의 간에서 분리한 total RNA을 이용하여 RT-PCR을 실시하여 PGC-1과 UCP-2의 발현을 조사한 결과 두 유전자 모두 고지방식이를 실시한 군 (H와 HE)에서 대조군에 비해 2배가량 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 그런데 HE group에서는 혈중 콜레스테롤이 정상화되었는데도, 계속 증가하였으므로 이들 유전자의 발현증가는 혈중 콜레스테롤이 아닌 다른 알려지지 않은 인자에 의해 증가하는 것으로 보인다.
흥미 있게도 이들 유전자의 발현 profile이 혈중 nitric oxide (NO)의 양과 비례적으로 증가하는 것으로 나타났다. extracellular cholesterol의 처리 또는 NO가 PGC-1의 유전자 발현에 영향을 주는지를 보기 위해 HepG2 cell을 SNAP 또는 25-OH cholesterol로 처리한 후 PGC-1의 mRNA level을 RT-PCR로 측정하였다. NO donor 인 SNAP ($500 {\mu}M$)을 처리하였을 때 PGC-1의 발현이 약 2배 증가하였으며, 마찬가지로 NO의 발생을 유도하는 것으로 알려진 cytokine mixture ($TNF-{\alpha}$ (40ng/m1), IFN-γ (100units/ml) & LPS (100ng/m1))에 의해서도 약 2.5배 증가하였다. 따라서 in vivo에서 나타난 결과와 일치하게 PGC-1의 발현은 NO에 의해 유도되었음을 알 수 있었다.
그밖에 고지방에 의해 유도되는 인슐린 저항증과 밀접한 관련성을 보이는 mitochondrial DNA(mtDNA)의 양과 mtDNA에 의해 encode되는 cytochrome C oxidase subunit Ⅲ (COXⅢ), mtDNA replication 과 transcription에 중요한 mitochondrial transcription factor A (mtTFA)의 발현도 조사하였다. mtDNA와 mtTFA는 이들 H군에서 거의 변화하지 않았으며, COXⅢ 도 발현변화가 거의 없었다. 그러나 mtDNA copy수, mtTFA와 COXⅢ의 mRNA는 estrogen 투여에 의해 증가하였다.
고지방식이 모델에서 혈중 NO의 증가가 iNOS의 발현이 유도된 때문인지를 확인하기 위해, rat liver에서 iNOS의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 정상식이군에서는 iNOS의 발현이 거의 보이지 않는 반면, 고지방 식이군에서 iNOS의 발현이 유도되었으며, estrogen의 투여는 iNOS의 발현을 저해하지 않았다.
Plasma LDL을 hepatocyte 내로 uptake 하기 위해 필요한 LDL receptor를 knock-ovt 한 mouse (LDLR-/-)를 고지방식이로 처리한 후, 간 조직?한 in vitro로 HepG2 cell과 RAW264.7 cell을 oxLDL과 25-OH cholesterol로 처리하였을 때, iNOS의 발현이 증가하였다. 이 결과는 고지방 식이에 의한 혈중 콜레스테롤의 증가가 iNOS의 발현을 유도하고, 그 결과 나타나는 혈중 NO의 증가가 PGC-1의 발현을 유도함으로써 인슐린 저항증의 발병에 관여할 수 있다는 하나의 가능성을 보여준다.
역으로 PGC-1의 발현이 cholesterol의 대사에 미치는 영향을 규명하기 위하여, PGC-1이 LDL receptor의 발현에 미치는 영향을 LDL receptor의 promoter study를 통해 규명하였다. 그 결과 PGC-1의 ectopic expression은 세포내 cholesterol의 변화와는 무관하게 LDL receptor의 발현을 억제하였으며, 이 때 LDL receptor promoter에 존재하는 SRE-1와는 무관하게 발현 억제를 보여 주었다. PGC-1의 억제 기능에 중요한 LDL receptor promoter 부위는 -927에서 -650 구간이었다. 본래 PGC-1은 adipocyte 의 분화에 관여하는 coactivator로 알려져 있는데, 흥미있게도 본 결과에서는 일종의 repressor역할을 하는 것으로 관찰되었다.
또한 cholesterol을 bile acid 로 전환하는 중요한 효소인 CYP7A1의 발현에 관한 PGC-1의 영향을 CYP7A1 promoter-luciferase construe를 사용하여 조사하였을 때, PGC-1의 과발현은 CYP7A1의 발현을 증가시켰으며, $HNF-4{\alpha}$가 존재할 때 synergistic 하게 더욱 증가하였다. 이때 또 다른 orphan receptor인 SHP는 FTF, $HNF-4{\alpha}$, PGC-1등의 activator틀에 의한 활성증가를 강하게 억제하였다. SHP의 발현은 oxLDL에 의해 감소함을 본 연구자는 이미 보고한 바 있는데, 이 결과는 세포내 콜레스테롤 대사에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 LDL receptor와 CYP7A1의 유전자 발현을 콜레스테롤의 존재와는 무관하게 조절할 수 있으며 이때 PGC-1이 관여함을 증명하였다. 최근 PGC-1이 당뇨와 gluconeogenesis에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었지만, 아직 지질대사와는 연관되어 별다르게 보고된 사실이 없으며 본 연구의 결과는 지질대사와 PGC-1, 그리고 인슐린저항증을 연결하여 이해할 수 있는 실마리를 제공해줄 것으로 생각된다.
Abstract
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We investigated the factors that are involved in both insulin resistance development and atherogenesis. In high fat-induced insulin resistance rat model, we searched the factor(s) or gene(s) that might be responsible for evoked the insulin resistance by analysing the gene expressions and their regul
We investigated the factors that are involved in both insulin resistance development and atherogenesis. In high fat-induced insulin resistance rat model, we searched the factor(s) or gene(s) that might be responsible for evoked the insulin resistance by analysing the gene expressions and their regulation of cholesterol- and glucose- homeostasis metabolism. Four groups of rats were established; SD rats with saline (N), SD rats treated with 17a- ethynyl estradiol (NE), SD rats fed with high-fat diet (HF), and SD rats fed with high-fat diet and treated with 17a-ethynyl estradiol (HE).
The high-fat diet also increased plasma nitric oxide (NO) concentrations up to 5 fold, and induced iNOS mRNA expression in liver. Treatment with estrogen for 4 days failed to reduce iNOS expressions as well as aortic contractility, although it improved lipid profiles. In cultured HepG2 or murine macrophage RAW264.7 cells, the 3 day-treatment with either 25-hydroxycholesterol or 7-ketocholesterol induced iNOS mRNA expression, as determined by RT-PCR. Our data, implying that the chronic exposure of hepatocytes and macrophage cells to high concentration of cholesterol or oxysterols may induce iNOS expression and subsequent synthesis of NO.
Interestingly, the hepatic expressions of $PPAR-{\gamma}$ coactivator-1 (PGC-1) and uncoulping protein-2 (UCP-2) were increased 2-fold in H and HE groups compared with the normal diet groups (N and NE), and highly correlated with plasma NO level. The treatment of NO donor, SNAP on HepG2 cells increased the PGC-1 mRNA expression, suggesting that the increase of PGC-1 expression in rat liver might be a result from the enhancement of plasma NO. In contrast, mitochondrial DNA (mtDNA) content, mtDNA encoded cytochrome c oxidase subunit Ⅲ (COXⅢ), and mitochondrial transcription factor A (mtTFA) were not altered by high fat-diet. From this data we hypothesized that in vivo mtDNA, COXⅢ, and mtTFA were rather stimulated by PGC-1 to compensate the mitochondrial functions that might be impaired by NO. Since the increased PGC-1 expression were reported in several diabetes and insulin resistance models, high fat diet>NO increase>PGC-1 induction pathway might be responsible for high fat diet-induced insulin resistance mechanism.
We also found that PGC-1 repressed LDL receptor transactivation in a sterol-independent manner. The LDL receptor promoter region between -927-650 was critical for PGC-1-mediated repression. PGC-1 was involved in coactivation of CYP7A1 promoter which was a rate limiting enzyme of bile acid synthesis. These results demonstrated that PGC-1 might be an important component to link between insulin resistance and lipid metabolism in many aspects. The detailed mechanism would be the next project.
목차 Contents
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...11
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...24
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...25
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...26
- 6. 첨부서류...27
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