옥수수 가공식품중에서 유전자재조합 옥수수의 포함여부(정성) 및 함유량(정량)을 파악하기 위하여 옥수수의 내인성유전자인 SSIIb gene영역과 유전자재조합 검출용 CaMV 유래의 35S-promoter 영역, Nos terminator 영역, Mon810-specific 영역에서 80~94bp 크기의 primer와 probe를 설계하였다. 새롭게 설계·제작한 primer의 유효성시험을 실시한 결과, annealing 온도 $55^{\circ}C$ 혹은 $60^{\circ}C$에서 DNA 기질농
옥수수 가공식품중에서 유전자재조합 옥수수의 포함여부(정성) 및 함유량(정량)을 파악하기 위하여 옥수수의 내인성유전자인 SSIIb gene영역과 유전자재조합 검출용 CaMV 유래의 35S-promoter 영역, Nos terminator 영역, Mon810-specific 영역에서 80~94bp 크기의 primer와 probe를 설계하였다. 새롭게 설계·제작한 primer의 유효성시험을 실시한 결과, annealing 온도 $55^{\circ}C$ 혹은 $60^{\circ}C$에서 DNA 기질농도 50 ng, $MgCl_2$1.5mM의 조건에서 특이적 증폭산물을 관찰할 수 있었다. 또한, 이들 primer를 이용한 민감도 (sensitivity)시험을 수행한 결과 프라이머의 사이즈가 작을 수록 민감도가 높았으며 DNA 최저 검출수준은 5 pg 이었다. (81bp amplicon 기준). Hubner 등(2001)이 제시한 200ng의 옥수수DNA가 약 36,000copy일 경우 GMO함량 0.1%인 0.2ng에서는 약 36copy이며 이론적으로 정량가능한 검출수준(LOQ)을 약 0.1%, 정성검출 한계(LOD)를 0.05%인 것으로 제시한 것을 볼때 본 연구에서 설계·제작한 primer로 PCR검출한 결과가 10-40배 이상 감도가 높은 것으로 판단된다. 가공모델을 통한 유전자손상여부 및 손상된 유전자의 검출 능력을 조사하기 위하여 유전자재조합 옥수수를 가압증자처리($100^{\circ}C$, 0.6kgf/m$^2$; $121^{\circ}C$, 1.0 kgf/m$^2$, $129^{\circ}C$, 1.6kgf/m$^2$)한 결과, 5분이상 가압증자처리하는 경우 intact DNA의 대부분이 분해된 것으로 관찰되었다. PCR 정성분석을 수행한 결과, 내인성유전자인 SSIIb(81bp)는 intact DNA가 대부분 분해된 시료에서도 검출되었으나, 35S promoter(81bp)는 15분이상 처리한 시료에서는 검출되지 않거나 검출강도가 매우 낮았다. 시중 유통되고 있는 옥수수가공품(국산 27종, 수입산 24종)에서 재조합유전자를 검출한 결과, 작은 크기의 primer981bp)를 이용한 경우 검출능이 우수했다. 본 연구에서 제작한 primer/probe를 이용하여 GM-옥수수에서 추출한 genomic DNA 농도별로 real-time PCR 실험결과, 특이적인 증폭결과를 얻었다. 가공식품에서의 PCR정량가능성을 탐색하기 위하여 정량검출용 primer 및 probe의 유효성시험을 위한 plasmid를 설계·제작하고 정량 PCR 증폭효율을 검토하였다. 기존의 상용 plasmid에서 검출할 수 있는 amplicon의 크기(100bp 전후)와 본 연구에서 제작한 81bp의 Primer/probe를 이용한 정량검출한계(LOQ)를 비교하였다.
Abstract▼
To determine the genetically modified organism(GMO) in processed maize-derived foods, the following analytical methods were established, and validatation tests were conducted. 1. Construction of novel primer/probe and PCR optimization: ten sets of primer and probes(amplicon size: 81 to 101bp) for
To determine the genetically modified organism(GMO) in processed maize-derived foods, the following analytical methods were established, and validatation tests were conducted. 1. Construction of novel primer/probe and PCR optimization: ten sets of primer and probes(amplicon size: 81 to 101bp) for the qualitative and quantitative detection of GMO in processed maize-derived foods were designed based on zSSIIb, p35S, tNOS and Mon810-specific gene, and confirmed the specificities by qualitative PCR and real-time PCR by use of genomic DNA samples derived from Mon810 maize. 2. Construction of reference molecules: plasmid DNAs were constructed by tandem integration as following: the pUC19 plasmid includes PCR products amplified from the PCR systems for zSSIIb, p35S, tNOS and Mon810 maize line. The linearity of standard curves were confirmed by using six levels of conc.(20, 200, 2000, 20000 and 200000 copies) of hybrid molecules. The calculated R2 values of the standard corves ranged from 0.999-1.000. As the result of repeatability test, the RDS values were <10% in most cases except low conc.(20, 200 copies) of p35S. 3. Sensitivity test of novel primer/probe sets: the detection limit was as low as 5pg of the starting template DNA concentration, indicating that the sensitivity tested with novel designed primer/probe sets was 40 fold higher than with commercially available ones. 4. Processing effects: Model process under high temperature and pressure conditions (100℃-0.6kgf/m$^2$, 121℃-1.0kgf/m$^2$, 129℃-1.6kgf/m$^2$) were conducted to test the detectibility of the degraded DNAs. After 5 min. treatment, intact DNAs were completely degraded into the smaller fragment, and 81bp amplicons derived from transgene(p35S) were not detected after 15 min treatment. 5. Monitoring the transgene with novel designed primer/probe sets: the processed maize-derived foods(domestic 27 items and imported 24 items) randomly purchased from the markets were used to test the PCR efficiency with novel designed primer/probe sets. PCR products (81bp in amplicon size) derived from GM-labeled imported products were all detected.
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