초록 ▼

목적: 본 연구과제는 난치성 신경계질환의 치료 방법을 개발하기 위한 전략을 체계적으로 확립하기 위함이다. 인위적 고안압 유도에 의한 허혈성 망막모델에서 세포사멸 (cell death)은 glutamate에 의한 excitotoxicity로 보고 되어 있으며, 이러한 망막 신경세포 사멸은 세포질과 미토콘드리아의 팽창을 수반하는 전형적인 necrosis와 세포질의 수축 및 핵염색질의 응축으로 나타나는 programmed cell death 또는 apoptosis라고 불리는 세포사 기전이 혼재하여 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 신경

목적: 본 연구과제는 난치성 신경계질환의 치료 방법을 개발하기 위한 전략을 체계적으로 확립하기 위함이다. 인위적 고안압 유도에 의한 허혈성 망막모델에서 세포사멸 (cell death)은 glutamate에 의한 excitotoxicity로 보고 되어 있으며, 이러한 망막 신경세포 사멸은 세포질과 미토콘드리아의 팽창을 수반하는 전형적인 necrosis와 세포질의 수축 및 핵염색질의 응축으로 나타나는 programmed cell death 또는 apoptosis라고 불리는 세포사 기전이 혼재하여 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 신경계질환의 원인이 신경독성요인 등에 의해 신경세포가 퇴화할 때 세포의 구조변화를 관찰하여 apoptosis와 necrosis로 분류하고, 그 특성을 규명하는 것이다. 이를 토대로허혈성 망막 모델에서 apoptosis 세포사를 조직학적, 세포 생물학적. 문자생물학적인 수준에서의 연구를 바탕으로 신경세포의 다양한 현상의 기전을 좀 더 종합적으로 설명할 수 있는 새로운 틀을 마련하고, 신경세포 사멸의 방어 전략을 확립하는데 관한 기초정보를 얻기 위하여 계획되었다.
연구방법: 허혈을 유도하기 위해 실험쥐들은 케타민(Ketamine hydrochloride 15 mg/kg 체중)과 유한럼푼(Xylazine 85 mg/kg 체중)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후, stereotaxic frame에 고정하고 평형염액(Balanced salt solution bottle)이 들어있는 수혈장치를 이용한다. 먼저 봉합사를 사용하여 안구를 고정한 후 압력이 수축기 혈압이상(120 mmHg)으로 되도록 수혈병을 들어올려 높이를 유지한 다음 끝에 연결된 30 G 주사침을 오른쪽 안전방(anterior chamber)에 삽입한다. 이 과정 이후, 검안경을 이용하여 망막의 혈류가 차단되는 것을 확인하고 60분 동안 허혈 상태를 유지한 후, 주사침을 제거하여 혈류를 재관류시킨다. 허혈을 유도한 오른쪽 눈에 betaxolol을 점안하였는데, 허혈을 유도하기 1시간 전에 두 방울 (약 100 ul)을 점안하였고 허혈 유발 후 각각의 재관류 시간에 따라 매 12시간 마다 두 방울씩을 점안하였다. 실험군과 대조군에서 얻은 망막조직의 손상정도는 image analyzer를 이용하여 통계분석 하였으며, 각각의 특이한 세포표적 항체를 이용하여 immunohistochemistry 방법을 수행하여 조직내의 단백질 발현정도 및 위치를 확인하였다.
연구결과: 정상 망막은 외과립층. 외망상층. 내과립층, 내맘상층, 신경절세포층 등 5층으로 잘 조직화된 층상구조를 이루고 있었다. 허혈을 유도한 실험군에서는 재관류 후 시간이 경과함에 따라 망막의 두께는 점차 감소되었으며, 4주 후에는 망막의 두께가 정상군에 비하여 약 75％까지 감소하였다. 허혈 처리와 더불어 허혈 전후에 신경보호제 betaxolol을 처리한 처리군에서는 전체적으로 망막의 각 세포층의 두께와 층별 세포수가 허혈 처리군에 비하여 정상군의 약 70％ 수준으로 유지되었다. 이러한 결과는 betaxolol이 허혈-재관류로 인하여 야기되는 망막 신경세포의 손상을 보호하는 방어효과가 있음을 알 수 있었다. 망막에는 cholinergic amacrine cell와 GABAergic amacrine cell이 존재하며. 이들 세포는 anti-ChAT 및 anti-GABA 항체에 의하여 특이적으로 염색되는 것으로 알려져 있다. 허혈-재관류 후 ChAT 및 GABA 면역 반응성 세포의 영향은 재관류 3일째부터 정상군에 비하며 면역 반응성 세포가 줄어든 망상을 보이고 내망상층에 존재하는 band도 거의 소실된 모습을 보였다. 한편 Betaxolol 처리군에서는 내망상층의 면역 반응성 band의 손상은 조금 있어나 정상군과 거의 유사한 양상으로 염색되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 betaxolol이 망막 신경세포를 어느 정도 보호하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.허혈-재관류 후 망막에서는 nNOA, eNOS 및 iNOS 면역 반응은 정상군에 비하여 망?은 허혈-재관류에 따른 신경세포 손상에 NOS가 관여하고 있다는 사실을 알 수 있었다. 한편 betaxolol 처리군에서는 NOS 면역 반응이 정상군의 수준과 커다란 차이 없이 거의 유사한 양상으로 염색되었다. 이상에서 보았을 때, 허혈-재관류을 유도한 망막조직에서 NOS의 발현이 현저히 증가하여 망막신경세포에 영향을 미치고 있는 것을 관찰할 수 있었으며, betaxolol 처리군에서는 NOS 발현의 정도를 억제하여 신경세포를 어느 정도 보호하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

Abstract ▼

This study was conducted to identify the mechanism involved in neuronal cell death after transient ischemia. Like other areas of the central nervous system, the retina is highly vulnerable to ischemic-induced injury. Ischemia was induced in the rat retina by raising the intraocular pressure above th

This study was conducted to identify the mechanism involved in neuronal cell death after transient ischemia. Like other areas of the central nervous system, the retina is highly vulnerable to ischemic-induced injury. Ischemia was induced in the rat retina by raising the intraocular pressure above the systolic blood pressure for 60 min. The results are as follows:
1. After ischemia/reperfusion, the thickness of the retinal layers and the immunoreactivities of choline acetyltransferase (ChAT), ${\gamma}$-amino butyric acid (GABA) and tyrosine hydroxylase (TH) were examined. After a reperfusion period of 7 days, the thickness of both the inner plexiform layer and inner nuclear layer was much decreased. Moreover, the ChAT and TH immunoreactivity had almost completely disappeared in the retinas after 7 days, while GABA immunoreactivity remained for 28 days.
2. Histological examination demonstrated protective effects of betaxolol on ischemic-induced retinal damage, which was more substantial in the inner retinal layer. When two drops of betaxolol, once before ischemic injury and twice daily for 28 days after ischemia, were continuously administered, the reductions in the retinal ChAT, GABA and TH immuroreactivities were significantly attenuated.
3. Ater ischemia/reperfusion, the number of nNOS immunoreactive cells increased in both the ganglion cell layer and the inner nuclear layer compared to the control retinas. However, when experiments were carried out on animals that had been treated with betaxolol twice daily after ischemia/reperfusion, the number of nNOS immunoreactive cells decreased compared to the untreated ischemic retinas.
4. After ischemia/reperfusion, the intensity of eNOS immunoreactivity increased in both retinal vessels and the ganglion cell layer compared with controls. However, when experiments were carried out on animals that had been treated with betaxolol after ischemia/reperfusion, the intensity of eNOS immunoreactivity decreased compared to the untreated ischemic retinas.
5. These results suggest that an increase in nNOS and eNOS expression could be associated with the degenerative changes in the ischemic retina, and that betaxolol treatment appears to protect retinal tissue from ischemic damage.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...24
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...28
• 7. 첨부서류...34