초록 ▼

금속염 환원 세균인 Shewanella algae BrY와 Shewanella putrefaciens IR-1을 cyclic voltammetry test(CV test)를 통하여 선택된 전기화학활성 균주를 이용하여 미생물 연료전지를 운전하여 이들이 실제 전기를 생산하는 능력을 가지고 있는 균주인 것을 확인하였고, 산소가 전기화학활성에 미치는 영향을 파악하였다. 또한 배양시간의 전기화학활성에 대한 영향은 late exponential phase에서 가장 좋은 전기화학활성을 가졌으며, 균체의 농도가 높아질수록 전기화학활성 미생물의 전

금속염 환원 세균인 Shewanella algae BrY와 Shewanella putrefaciens IR-1을 cyclic voltammetry test(CV test)를 통하여 선택된 전기화학활성 균주를 이용하여 미생물 연료전지를 운전하여 이들이 실제 전기를 생산하는 능력을 가지고 있는 균주인 것을 확인하였고, 산소가 전기화학활성에 미치는 영향을 파악하였다. 또한 배양시간의 전기화학활성에 대한 영향은 late exponential phase에서 가장 좋은 전기화학활성을 가졌으며, 균체의 농도가 높아질수록 전기화학활성 미생물의 전기화학활성 반응은 증가하는 것으로 확인되었다. 전기화학활성 미생물에서 세포외막에 존재하는 cytochrome을 분리하기 위하여 EDTA를 처리하여 Shewanella algae BrY와 Shewanella putrefaciens IR-1의 세포외막에서 세포외막 단백질을 분리하였다. 이 실험을 통하여 S. putrefaciens IR-1은 heme group을 포함한 60 kDa와 70 kDa 두개의 단백질이 세포외막에 존재하고 있었으며, S. algae BrY의 경우는 65 kDa의 haeme group을 가진 단백질이 포함되어 있었다. NADH oxidase assav와 cytochrome spectrum 실험을 통하여 분리된 단백질은 세포외막에서 분리된 단백질이며, 이들 단백질은 c-type cytochrome을 포함하고 있는 것이 확인되었다. 생체 고분자를 이용한 산소 sensor의 개발을 위하여 전기화학활성 미생물인 Shewanella putrefaciens IR-1의 세포외막에서 분리된 세포외막단백질을 전극에 흡착시켜 CV test로 확인하였을 때 PHB에 의해 고정된 세포외막 단백질이 가장 좋은 반응을 보였으며, Poly-L-lysine (PLL)과 Glutaraldehyde (GA)에 의한 고정에서는 GA가 포함된 반응의 경우에 전기화학활성 반응이 나타나지 않거나 변성된 단백질에 의한 반응이 보이는 것으로 확인되었다. 세포외막 단백질들은 100 mM acetate buffer (pH 5)에서는 -300 mV에서 산화-환원 반응을 보였으며, 100 mM phosphate buffer (pH 7)에서는 -420 mV에서 산화-환원 반응을 보였다. 또한 전기화학활성 미생물의 세포외막에서 분리된 세포외막 단백질의 산소에 대한 반응성은 산소가 존재하는 조건에서는 세포외막 단백질이 산소에 전자를 전달해 주는 반응에 의해서 current peak가 증가하는 반응을 보였다.

Abstract ▼

(1) The isolation of EAB from microbial fuel cell run under diverse conditions, the selection of bacterial strains with high cell-surface cytochrome activity and the characterisation of this cell-surface proteins.
(2) The analysis of cytochrome from isolated EAB for electrochemical activity and n

(1) The isolation of EAB from microbial fuel cell run under diverse conditions, the selection of bacterial strains with high cell-surface cytochrome activity and the characterisation of this cell-surface proteins.
(2) The analysis of cytochrome from isolated EAB for electrochemical activity and nanoscale surface analysis.
(3) The construction and chracterization of artificial bilayer membrane containing the cell-surface cytochrome through nanoscale manipulation method and through nanoscale surface analysis method such as AFM and SNOM. The behavior of the artificial membrane according to oxygen concentration will be determined in therms of current generation or resistance change using electrochemical methods.

목차 Contents

• 제 1 장 서론 ... 26
• 제 1 절 금속염 환원 세균 ... 26
• 제 2 절 금속염 환원 세균의 전지대사 ... 27
• 제 3 절 미생물 연료전지 ... 28
• 제 4 절 전기화학활성 미생물 ... 29
• 제 5 절 Cyclic voltammetry ... 30
• 제 2 장 국내외 연구 동향 및 기술개발 현황 ... 32
• 제 1 절 미생물 여료전지의 국내외 연구 동향 및 기술 개발 현황 ... 32
• 제 2 절 금속염 환원 세균의 연구 동향 ... 35
• 제 3 절 금속염 환원 세균의 연구 동향 ... 39
• 제 4 절 Nanotechnology를 이용한 바이오 센서의 연구 동향 및 기술개발 현황 ... 41
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 44
• 제 1 절 실험 방법 ... 44
• 1. Baterial Strains ... 44
• 2. 배지 및 배지 조건 ... 47
• 3. 미생물 연료전지의 운전 ... 50
• 4. Atomic Force Microscope를 사용한 세포 표면 및 막단백질의 관찰 ... 51
• 5. 미생물 연료전지에서 철환원 세균의 분리 동정 ... 53
• 5.1 미생물의 분리 ... 53
• 5.2 미생물의 배양 ... 53
• 6. 발효기의 운전 ... 58
• 7. C-type cytochrome의 spectral analysis ... 58
• 8. 세포외막 단백질의 분리정체 ... 59
• 8.1 철환원 세균의 세포외막 단백질의 분리 ... 59
• 8.2 NADH oxidase assay ... 60
• 8.3 SDS-PAGE 및 Gel 염색과 건조 ... 61
• 8.4 C-type cytochrome의 분리 ... 62
• 9. Cyclic voltammetry test (CV test) ... 62
• 9.1 균체를 이용한 CV test ... 62
• 9.2 EDTA를 처리한 균체의 CV test ... 63
• 9.3 전기화학활성 미생물에서 분리한 막단백질의 CV test ... 63
• 9.4 Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) film에 의해 고정된 막단백질의 CV test ... 67
• 9.5 Lipid에 의해 고정된 막단백질의 CV test ... 67
• 9.6 Poly-L-lysine과 glutaraldehyde에 의해 고정된 막단백질의 CV test ... 68
• 제 2 절 미생물 연료전지에서 철환원 세균의 분리 및 동정 ... 69
• 1. Electron acceptor에 따른 genomic DNA 추출 결과 ... 69
• 1.1 Nitrate를 electron acceptor로 사용 ... 70
• 1.2 Fe(III)-pyrophosphate와 Fe(III)-citrate를 electron acceptor로 사용 ... 72
• 2. Clone의 homology 분석 ... 75
• 3. 결론 ... 77
• 제 3 절 금속염 환원 세균의 전기화학활성 ... 78
• 1. Cyclic voltametry test ... 78
• 2. 금속염 환원 세균의 CV test ... 80
• 3. 전기화학활성 단백질체 정제를 위한 균주 선택 ... 81
• 4. 결론 ... 83
• 제 4 절 미생물 연료전지의 운전 ... 85
• 1. 미생물 연료전지의 운전 ... 85
• 2. 결론 ... 87
• 제 5 절 전기화학활성에 영향을 미치는 요소 ... 88
• 1. 산소에 대한 영향 ... 88
• 2. 배양시간에 따른 전기화학활성의 영향 ... 90
• 3. CV test에서 균체 농도에 대한 산화-환원 peak의 영향 ... 91
• 4. 결론 ... 92
• 제 6 절 세포외막 단백질의 분리 ... 93
• 1. 세포외막단백질의 분리 방법의 선택 ... 93
• 2. EDTA를 사용한 Shewanella algae BrY ATCC 51181와 Shewanella putrefaciens IR-1의 세포외막 단백질의 분리 ... 94
• 3. NADH oxidase assay ... 96
• 4. 세포외막 단백질의 cytochrome spectrum ... 96
• 5. S. putrefaciens IR-1 세포외막 단백질에서의 c-type cytochrome 의 분리정체 ... 98
• 6. S. oneidensis MR-1의 돌연변이 균주를 이용한 세포외막 단백질과 전기화학활성 ... 100
• 7. 결론 ... 101
• 제 7 절 Atomic Force Micoscope (AMF)를 사용한 균체 및 막단백질의 관찰 ... 102
• 1. S. putrefaciens IR-1의 세포표면 관찰 ... 102
• 2. EDTA처리에 의해 분리된 세포외막 단백질의 관찰 ... 106
• 3. 결론 ... 107
• 제 8 절 S. putrefaciens IR-1에서 분리된 세포 외막 단백질의 전기화학활성 ... 108
• 1. 세포외막 단백질의 CV test ... 108
• 1.1 EDTA를 처리한 균체의 CV test ... 108
• 1.2 세포 외막 단백질의 CV test ... 110
• 1.3 결론 ... 112
• 2. Pyrolytic graphite electrode에 세포 외막 단백질의 고정 ... 112
• 2.1 Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) film에 의해 고정된 112세포 외막 단백질의 CV test ... 113
• 2.2 Lipid ( 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphaochline monohydrate, DPPC)에 의해 고정된 세포 외막 단백질의 CV test ... 115
• 2.3 Poly-L-lysine (PLL)과 Glutaraldehyde (GA)에 의해서 고정된 세포 외막 단백질의 CV test ... 117
• 2.4 결론 ... 121
• 3. 세포 외막 단백질의 산소에 대한 반응 ... 122
• 3.1 EDTA를 처리한 균체의 산소에 대한 반응 ... 123
• 3.2 세포 외막 단백질의 산소에 대한 반응 ... 123
• 3.3 Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) film에 의해 고정된 세포 외막 단백질의 산소에 대한 반응 ... 127
• 3.4 Lipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphaocholine monohydrate, DPPC)에 의해 고정된 세포 외막 단백질의 산소에 대한 반응 ... 129
• 3.5 Poly-L-lysine (PLL)과 Glutaraldehyde (GA)에 의해서 고정된 세포 외막 단백질의 산소에 대한 반응 ... 131
• 3.6 결론 ... 135
• 4. 결론 ... 136
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외 기여도 ... 138
• 제 1 절 1차년도 연구개발 목표 및 달성도 ... 139
• 1. 연구개발 목표 수행방법(국제공동연구) ... 139
• 2. 연구개발 목표 수행방법 (국제공동연구) ... 139
• 2.1 연구수행시 이론적 근거 ... 139
• 2.2 실험적 접근방법 ... 141
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 141
• 3.1 연구내용 ... 141
• 3.2 연구결과 ... 142
• 3.2.1 미생물 연료전지에서 철환원 세균의 분리 및 동정 ... 142
• 3.2.2 금속염 환원 세균의 전기화학활성 ... 142
• 3.3 연구실적 ... 144
• 4. 목표 달성도에 대한 자체평가 ... 144
• 제 2 절 2차년도 연구개발 목표 및 달성도 ... 145
• 1. 연구개발목표 ... 145
• 2. 연구범위 및 연구 수행방법 ... 145
• 3. 연구 수행 내용 및 겨과 ... 145
• 3.1 연구 수행 내용 ... 146
• 3.2 연구 결과 ... 146
• 3.2.1 전기화학활성과 금속염 환원세균 ... 146
• 3.2.2 미생물 연료전지의 운전 ... 146
• 3.2.3 전기화학활성에 영향을 미치는 요소 ... 147
• 3.2.4 세포외막단백질의 분리 ... 148
• 3.2.5 putrefaciens IR-1 세포외막 단백질에서의 c-type cytochrome의 분리정제 ... 149
• 3.2.6 S. oneidensis MR-1의 돌연변이 균주를 이용한 세포외막 단백질과 전기화학활성 ... 149
• 3.3 연구실적 ... 150
• 3.3.1 국내외 전문 학술지 ... 150
• 3.3.2 학술발표 ... 150
• 3.3.3 양기관간 교류 실적 ... 151
• 4. 목표 달서도에 대한 자체평가 ... 151
• 제 3 절 3차년도 연구개발 목표 및 달성도 ... 152
• 1. 연구개발목표 ... 152
• 2. 연구범위 및 연구수행방법 ... 152
• 3. 연구 수행 내용 및 결과 ... 152
• 3.1 연구실적 ... 153
• 3.2 연구교류실적 ... 154
• 4. 목표 달성도에 대한 자체평가 ... 154
• 제 5 장 연구개발 결과의 활용계획 ... 156
• 제 6 장 참고문헌 ... 158