1. 지질과산화 저해물질 생산 미생물 및 천연물자원의 확보 지질과산화 저해물질의 탐색원으로 이용하기 위하여 토양방선균,곰팡이,담자균류 및 약용식물 등을 채집하여 분류,확보하고 추출물을 조제하였다. 2. 신규 지질과산화 저해물질 생산균주 및 천연물 탐색 지질과산화 저해활성 물질 탐색계로서 rat liver microsome을 이용한 $Fe^2+$/ascorbate 반응계 및 뇌신경세포 보호작용을 규명하기 위하여 mouse cortical primary cell culture 시스템과 neuro
1. 지질과산화 저해물질 생산 미생물 및 천연물자원의 확보 지질과산화 저해물질의 탐색원으로 이용하기 위하여 토양방선균,곰팡이,담자균류 및 약용식물 등을 채집하여 분류,확보하고 추출물을 조제하였다. 2. 신규 지질과산화 저해물질 생산균주 및 천연물 탐색 지질과산화 저해활성 물질 탐색계로서 rat liver microsome을 이용한 $Fe^2+$/ascorbate 반응계 및 뇌신경세포 보호작용을 규명하기 위하여 mouse cortical primary cell culture 시스템과 neurohybridoma인 N18-RE-105 cell culture 시스템을 이 용한 glutamate 독성억제 활성 측정계를 확립하고,확보된 탐색자원 추출물을 이용하여 지질과산화 저해활성 및 glutamate에 의하여 유도된 뇌신경세포 사멸 제어활성을 측정하여 활성이 우수한 탐색자원을 선발,확보하였다. 3. 지질과산화 저해물질 생산균주의 미생물학적 특성조사 선발균주를 대상으로 배양적,형태적,생리적 특성 등 미생물학적 특성을 조사하였으며, 광학현미경 및 전자현미경 사진을 통하여 생산균주의 분류,동정연구를 수행하였다. 4. 신규 지질과산화 저해물질 및 뇌신경세포 보호물질의 추출 및 정제 미생물 배양액 및 천연물 자원으로부터 스크리닝 과정에 의하여 지질과산화 저해활성 및 뇌신경세포 보호활성 물질 생산자원을 확보하고 이들로부터 지질과산화 저해물질 및 뇌신경세포 보호물질을 분리 정제하기 위하여 hexane, chloroform, ethyl acetate butanol등을 이용한 유기용매추출, sihca gel, Sephadex-LHZO 등의 수지를 이용한 column chromatography, preparative TLC 및 HPLC 등의 각종 분리.정제기술을 이용 활성물질을 순수 분리하였다. 5. 활성물질의 물리화학적 특성조사 및 화학구조 분석 순수하게 분리 정제된 지질과산화 저해물질들에 대하여 각종 물리화학적 특성을 조사하였다.즉 FAB 및 ESI mass 분석에 의하여 분자량을 결정하고 high resolution mass 분석에 의하여 분자식을 결정하였다.또한 IR Spectrum 분석에 의하여 functional group 을 밝혔으며 UV spectrum 분석에 의하여 chromophore를 규명하였다.화학구조의 규명을 위하여 ID-NMR로서 $1^H$,$12^C$, DEPT등을 측정하였으며 $1^H$-$1^H$ COSY, HMQC, HMBC, NOESY등을 비롯한 다양한 ZD- NMR spectrum을 측정하였다. 6. 신규 화합물들의 약리효능 검색을 위한 생물활성 연구 창출된 신규 지질과산화 저해물질의 생물활성을 규명하기 위하여 쥐의 간 microsome을 분리하고 이를 지질원으로 하여 지질과산화 저해활성을 측정하였으며 뇌신경세포 보호물질의 생물활성을 측정하기 위하여 mouse corticai cell을 초대 배양하거나 신경 세포주인 N18- RE-105 cell을 이용하였으며 흥분성 독성물질로는 L-glutamate,AMPA 혹은 kainate를 처리하였다. 7. 신규 화합물들의 작용기전의 규명 신규 화합물들의 작용기전을 규명하기 위하여 $N_2$와 $CO_2$의 이중 가스 주입이 가능한 $CO_2$ incubator (Forma)를 이용하여 세포를 배양하였으며 $O_2$의 농도를 1% 로 낮추면서 동시에 $CO_2$를 공급하여 체내에서 생성되는 hypoxia 상태와 유사한 조건하에 세포를 배양하였다.Hypoxia 및 TNF/actinomycin D에 의한 세포사멸은 trypan blue exclusion 방법으로 죽은 세포를 counting하여 결정하고 apototic pathway에 관련된 caspase 활성은 각 caspase에 대한 기질을 이용하여 정량적으로 분석하였다.TRAIL에 의한 cell viability 는 crtstal violet으로 염색하여 spectrophotometry analysis를 하였다. 8. 신규 화합물들에 의한 apoptosis 조절기전 분석 세포사멸을 차단하는 화합물의 작용원리를 분석하기 위하여 세포사멸과정에 관련된 단백질의 인산화 및 발현정 도를 분석 하였으며 AKT/PKB의 인산화를 phospho-AKT antibody를 이용하여 분석하고,세포사멸과정에서 미토콘드리아에서 세포질로 이동하는 cytochrome c와 apoptosis를 차단하는 bcl-2의 양적변화를 Westem blot으로 분석하였다. 9. 뇌신경세포 보호 지질과산화 저해화합물들의 in vivo 활성 평가 뇌신경세포 보호 지질과산화 저해화합물들의 in vivo 활성을 평가하기 위하여 체중 55-70 g의 Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) 을 사용하였다.각 실험동물은 허혈 유발 30 분전 또는 30분후에 vehicle 및 화합물을 복강주사하였다.대조군으로는 sham-operated 군을 사용하였으며,대조약물로는 ebselen을 사용하였다.실험동물은 각 군마다 20 마리를 배정하였다.허혈 유발 4 일 후 각 실험군을 pentobarbitai sodium으로 심마취한 후 좌심실을 통하여 0.85% saiine을 이용, 혈액을 세척한 다음, 4% paraforfnaidehyde를 이용하여 관류 고정하였다.고정이 끝난 gerbil은 신속히 뇌를 적출한 후 동일 고정액에 4-6 시간 후고정 한 후 30% sucrose in PBS 용액으로 24 시간 세척한 후 OCT compound를 이용하여 포매하여 냉동박절기로 30$\muM$두께의 조직절펀을 제작하였다.각 조직절펀에서 살아있는 세포를 확인하기 위해 cresyl violet 염색을 수행하였다.그 후 각 실험동물의 해마 (hippocampus)를 대상으로 하여 digital camera가 부착 되어 있는 현미경을 이용하여 200배로 사진촬영을 하였다.이 후 Optimas 6.5 프로그램을 사용하여 A1 영역의 신경세포의 수를 계수하여 vehicle 투여군에 대한 One-way ANOVA test를 수행하여 유의성을 검증하였다.
Abstract▼
Oxygen 15 indispensible for life and acts as the terminal oxidant in respiration. The oxygen molecule is very stable in the ground state, but it can converted to the reactive oxygen Species such as superoxide anion ($O_2^-$), hydroxyl radical ( · OH), hydrogen peroxide ($H_2O_2$
Oxygen 15 indispensible for life and acts as the terminal oxidant in respiration. The oxygen molecule is very stable in the ground state, but it can converted to the reactive oxygen Species such as superoxide anion ($O_2^-$), hydroxyl radical ( · OH), hydrogen peroxide ($H_2O_2$) and signlet oxygen (1^O_2$) under certain physical and chemical conditions. Reactive oxygen species are toxic enough to cause cell injury by destruction of cell components (DNA, proteins, lipids, sugars, etc.). This oxidative damage has long been known to be a risk factor for the degenerative processes and closely related to a lot of diseases such as cancer, aging, ischemia, inflammation, rheumatoid arthritis, diabetes, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, brain/nervous system disorder, etc.. Reactive oxygen species are continuously produced in living cells by various enzymatic reactions, metabolisms, or in response to xenobiotics. However, living cells have well-developed antioxidant defense systems to protect themselves from oxidative damage. These include low molecular-weight antioxidants and antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD), cataiase, glutathione peroxidase. Therefore, it is well established that the lipid peroxidation inhibitors with antioxidative activity and free radicai scavenging activity are good in protection and therapeutic means against diseases caused by oxidative damage.
목차 Contents
제 1 장 서론...29
제 2 장 국내외 기술개발 현황...32
제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과...38
제 1 절 신규 뇌신경세포 보호물질 neuroprotein A, B 및 compestain...38
제 2절 신규 뇌신경세포 보호 지질과산화 저해물질 curtisian A,B,C 및 D...75
제 3절 신규 지질과산화 저해물질 benzastatin H 및 I...127
제 4절 신규 acetylcholinesterase 저해물질 quinolactacin A1 과 A2...138
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