초록 ▼

- 소의 뇌 조직으로부터 N-cSMase λ를 정제하고, 1차원 SDS-PAGE와 2차원 전기영동법을 이용하여 68kDa의 단백질이 효소임을 알 수 있었음
- 분리, 정제된 단백질의 spot을 샘플로 하여 MALDI-TOF 분석을 한 결과 annexin VI으로 최종 동정됨
- Annexin VI에 특이적인 항체를 제조하여, N-SMase 활성이 면역침강됨으로써 annexin VI 가 N-SMase λ임을 확인하였음
- Annexin VI에 대한 antisense oligonucleotide를 제작하여, SH-SY

- 소의 뇌 조직으로부터 N-cSMase λ를 정제하고, 1차원 SDS-PAGE와 2차원 전기영동법을 이용하여 68kDa의 단백질이 효소임을 알 수 있었음
- 분리, 정제된 단백질의 spot을 샘플로 하여 MALDI-TOF 분석을 한 결과 annexin VI으로 최종 동정됨
- Annexin VI에 특이적인 항체를 제조하여, N-SMase 활성이 면역침강됨으로써 annexin VI 가 N-SMase λ임을 확인하였음
- Annexin VI에 대한 antisense oligonucleotide를 제작하여, SH-SY5Y human neuroblastoma cell에 처리한 결과, antisense를 처리한 세포에서 annexin VI의 단백질 양이 감소되는 것과 동시에 그 활성도 감소함을 관찰함
- 지금까지 N-SMase에 공통적으로 관찰되는 아미노산 motif인 "DXXXXK" motif가 annexin VI에 존재함으로써 최종적으로 본 annexin VI가 N-SMase λ임을 재삼 확인할 수 있었음
- Fas 수용체 활성화에 의한 세포 사멸 과정에 중성형 sphingomyelinase가 중요한 역할을 담당하고 있음을 RNAi를 통하여 증명하였음
- 세포내의 ceramide의 증가에 의해 활성 산소종의 증가가 일어나며 iNOS의 발현 증가 및 NO 생성량의 증가가 나타남을 증명함
- NO 증가에 의해 약물 대사 효소인 CYP3A4의 발현 저해가 발생하며 간이나 장에서의 염 증 시에 나타나는 약물 대사 효소 활성 저하의 작용 기전으로 판단됨
- 마우스 거식세포에서 ceramide에 의한 과도한 활성 산소종의 발생은 다시 NO 생성의 저하를 유발하며 반대로 NO의 증가는 ROS 생성을 억제하여 상호 조절하는 기전이 있는 것으로 판단됨
- Sphingosine 부위에 방향족 고리를 지니며, 아미드 결합을 thioureido기로 전환시키고, (2S,3R) 배열을 가진 새로운 ceramide 유도체 18종을 합성하였음
- Thioueido ceramide 유도체 중 알킬기의 길이가 C6이상인 화합물에서 높은 세포독성을 나타내어 항암제로서의 가능성을 보였음
- 합성한 화합물들의 암세포 종에 대한 세포독성 실험에서 특히 HT-29 colon cancer, Caki-2 renal cancer와 PC-3 prostate cancer에 대한 효과가 가장 높게 나타났음
- Ceramide 유도체의 세포내 기능을 검색하여 염증 유발 작용이 낮고 강한 세포 사멸을 유발하는 성분을 도출하였으며 차후에 유용 신약 후보 물질로 개발될 가능성이 있음

Abstract ▼

- Purification of a novel 68 kDa and Mg2+-independent cytosolic N-SMase $\lambda$ from the cytosolic fraction of bovine brain tissue by using one- and two-dimesional electrophoresis.
- Identification of the N-SMase $\lambda$ as annexin VI using 2-D gel and MALDI-TOF.
- Co

- Purification of a novel 68 kDa and Mg2+-independent cytosolic N-SMase $\lambda$ from the cytosolic fraction of bovine brain tissue by using one- and two-dimesional electrophoresis.
- Identification of the N-SMase $\lambda$ as annexin VI using 2-D gel and MALDI-TOF.
- Confirmation of the N-SMase $\lambda$ as annexin VI using immonoprecipitation method.
- Further confirmation of the N-SMase $\lambda$ as annexin VI using antisense oligonucleotides transfection into the SH-SY5Y cells
- Parallel decreases in the protein level and the N-SMase activity in the antisense-transfected cells.
- Presence in the amino acid sequence of annexin VI of the motif "DXXXXK" which is known as a common domain for the activity of N-SMase, further indicating that annexin VI is N-SMase $\lambda$.
- Determined that the neutral sphingomyelinase may be an important role in Fas-mediated apoptotic cell death by RNA interference.
- Increased level of ceramide by various stimuli induces ROS generation and iNOS and NO production.
- Enhanced NO generation suppresses cytochrome P4503A4 expression and this may be the mechanism of downregulation of drug metabolizing enzymes in inflammatory hepatitis.
- The crosstalk between ROS-mediated signal pathway and NO-mediated signal pathway may exist in cells.
- A ceramide analog which shows high apoptotic activity and low inflammatory response may be valuable as a new lead compound.
- Organic synthesis of eighteen ceramide derivatives of thioureido species of which the compounds containing more than C6-alkyl chains showed potent cytotoxic activity.

목차 Contents

• I. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• II. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• III. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...7
• 3. 결과 및 고찰...14
• 4. 결론...68
• 5. 인용문헌...70