보고서 정보
주관연구기관 |
영남대학교 YeungNam University |
연구책임자 |
남두현
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참여연구자 |
송재경
,
유진철
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2003-10 |
과제시작연도 |
2002 |
주관부처 |
과학기술부 |
과제관리전문기관 |
한국과학재단 Korea Science and Engineering Foundtion |
등록번호 |
TRKO200900069851 |
과제고유번호 |
1350016147 |
사업명 |
목적기초연구사업 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
조합생합성.polyketide synthase.Deoxysugar 생합성.마클로라이드 항생물질.방선균 유전학.GERI-155.항생물질 생합성 유전자.Combinatorial biosynthesis.Polyketide synthase.Deoxysugar biosynthesis.Macrolide antibiotic.Streptomyces genetics.GERI-155.Antibiotic biosynthesis.
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초록
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본 연구에서는 국내 토양에서 선별한 Streptomyces sp. GERI-155에서 분리한 마클로라이드 항생물질 GERI-155의 생합성 유전자를 규명하여 새로운 마클로라이드 항생물질을 개발할 수 있는 토대를 마련하고자, GERI-155 생합성에 관여한 polyketide synthase (PKS) 유전자와 deoxysugar 생합성 효소를 포함하는 유전자 군의 분리 클론을 시도하였다.
우선 PKS 유전자의 cloning을 위해 ketosynthase (KS) domain 일부를 증폭하고, 한편으로 deoxysugar
본 연구에서는 국내 토양에서 선별한 Streptomyces sp. GERI-155에서 분리한 마클로라이드 항생물질 GERI-155의 생합성 유전자를 규명하여 새로운 마클로라이드 항생물질을 개발할 수 있는 토대를 마련하고자, GERI-155 생합성에 관여한 polyketide synthase (PKS) 유전자와 deoxysugar 생합성 효소를 포함하는 유전자 군의 분리 클론을 시도하였다.
우선 PKS 유전자의 cloning을 위해 ketosynthase (KS) domain 일부를 증폭하고, 한편으로 deoxysugar 생합성 유전자의 확보를 위해 dTDP-glucose dehydratase 유전자 단편을 증폭하여 두가지 probe를 마련하였다. 이 probe들을 이용하여 Streptomyces sp. GERI-155의 pOJ446 cosmid library를 screening 한 결과, PKS probe에 결합하는 pGK11 clone과 dTDP-glucose dehydratase probe와 결합하는 pGERI-5 clone을 얻을 수 있었지만, 두 probe에 공히 결합하는 clone은 얻지 못하였다.
pGK11 cosmid clone의 염기서열을 분석한 결과, 약 41.8 kb의 insert가 삽입되어져 있었고, 여기에는 25개의 ORF가 포함되어 있었다. 이 중 22.5 kb 에 달하는 4 module의 type I PKS 유전자를 발견할 수 있었으며, 모두 PKS 활성에 꼭 필요한 KS, AT 및 ACP domain을 지니고 있었다. 이 PKS module들을 GERI-155의 화학적 구조와 대비한 결과, macrolactone 생합성에 필요한 M(module) 2, M 3, M 4 및 M 5를 지령하는 유전자의 배열 순서와 거의 일치하였다. 이에 따라 pGK11 내의 type I PKS 유전자를 Streptomyces sp. GERI-155에서 gene disruption시켜 기능을 확인하기 위해, ORF 14의 DH domain을 대상으로 neomycin 저항성 유전자를 도입하여 불활성화시킨 다음, pKC1139 shuttle vector를 이용하여 Streptomyces sp. GERI-155 균주에 도입하였다. 이렇게 선발된 disruptant의 배양액에서는 항균력을 지닌 물질이 검출되지 않았으며, LC/ESI-MS spectrometer 분석에도 마클로라이드 항생물질 peak를 관찰할 수 없었다.
한편, deoxysugar 생합성 유전자를 지닌 pGERI-5의 염기 서열을 분석한 결과, 약 16.3kb의 염기 서열을 결정할 수 있었으며, 여기에는 기존의 deoxysugar 생합성 유전자들과 상동성이 높은 TDP-glucose-4,6-dehydratase 유전자, dTDP-glucose synthase 유전자 및 dTDP-deoxyglucose epimerase 유전자를 포함하여 13개의 ORF를 발견할 수 있었다.
이 유전자들의 기능을 확인하기 위해 각 유전자를 증폭한 후, 대장균 발현 운반체에 도입하여 발현 운반체를 구축한 다음, IPTG로 유전자 발현을 유도하여 예상 크기의 단백질을
생산할 수 있었으며, 이들은 재조합 대장균으로부터 여러 column chromatography 방법으로 정제할 수 있었다. 정제된 TDP-glucose-4,6-dehydratase 효소는 기질로 TDP-glucose를, 조효소로 NAD+를 이용함을 확인할 수 있었고, glucose-1-phosphate thymidylyltransferase(dTDP-D-glucose synthase) 효소는 전 반응에서 dTTP 와 D-glucose-1-phosphate 쌍을, 역 반응에서 dTDP-D-glucose 와 pyrophosphate 쌍을 기질로 활용함을 관찰할 수 있었다. 한편, dTDP-deoxyglucose epimerase 효소는 dTDP-4-keto-6-deoxyglucose를 기질로 하여 maltol을 생성함을 증명할 수 있었다.
이상의 결과들을 종합하면, 본 연구에서 마클로라이드 항생물질인 GERI-155 생합성 유전자 뭉치를 PKS 유전자 부위와 deoxysugar 생합성 유전자 부위를 따로 분리 클론하였으며, 이 유전자들은 모두 GERI-155 생합성에 관여하는 유전자임을 입증하는데 성공하였다. 비록 이 두 유전자 군이 염색체 상에 떨어져 존재하지만, 이들 유전자를 이용하여 유전자 불활성화나 module 교체 등에 의해 새로운 마클로라이드 항생물질 창출하는데 충분히 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.
Abstract
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In order to generate a novel macrolide antibiotic by combinatorial biosynthesis, the biosynthetic gene cluster of GERI-155, especially for polyketide synthase (PKS) genes and deoxysugar biosynthetic genes, were cloned and characterized from the chromosomal DNA of its producer, Streptomyces sp. GERI-
In order to generate a novel macrolide antibiotic by combinatorial biosynthesis, the biosynthetic gene cluster of GERI-155, especially for polyketide synthase (PKS) genes and deoxysugar biosynthetic genes, were cloned and characterized from the chromosomal DNA of its producer, Streptomyces sp. GERI-155 which had been found in Korean soil.
In order to clone PKS gene, the ketosynthase (KS) probe was amplified from chromosomal DNA. On the other hand, dTDP-glucose dehydratase probe was also amplified for the cloning of deoxysugar biosynthesis genes. Using those probes, the pOJ446 cosmid library of Streptomyces sp. GERI-155 was screened, and two cosmid clones were isolated; one was pGK11 clone which bound with KS probe, and the other pGERI-5 clone which bound with dTDP-glucose dehydratase probe. However, any cosmid clone were not found which could bind with both probes simultaneously.
The nucleotide sequence analysis of pGK11 cosmid clone revealed a 41.8kb-long DNA composed of 25 ORFs. Among ORFs, 4 type I PKS modules were found in the middle part of the clone, which were encoded by 22.5 kb-long sequence. All PKS modules possessed KS, AT and ACP domains, which are minimally required for enzymatic activity. Compared with chemical structure of GERI-155, it was comfirmed that the arrangement of the cloned PKS modules was completely consistent with that M(module)
2, M 3, M 4 and M 5 modules for the synthesis of macrolactone moiety. In order to elucidate the biological function of the cloned type I PKS gene, DH domain of ORF14 was disrupted in Streptomyces sp. GERI-155. The amplified DH gene was inactivated by insertion of neomycin resistant gene, and transformed into Streptomyces sp. GERI-155 using pKC1139 shuttle vector. The selected disruptant did not produce any antibacterial substances in culture broth. In addition, any macrolide compounds was not detected in culture broth of disruptant by LC/ESI-MS spectrometer.
By the analysis of pGERI-5 cosmid clone having deoxysugar biosynthetic genes, a 16.3 kb-long DNA sequence was determined. Three major key genes for deoxysugar biosynthesis, TDP-glucose-4,6-dehydratase gene, dTDP-glucose synthase gene and dTDP-deoxyglucose epimerase gene, were found among 13 ORFs, and those sequences were highly homologous with other deoxysugar biosynthetic genes. In order to examine the enzyme activity, three genes were amplified and cloned in expression vectors of E. coli. When gene induction was attempted by IPTG, the production of distinctive proteins in recombinant E. coli was observed on SDS-PAGE. The produced enzymes were subjected to purification by several column chromatographic methods. The purified TDP-glucose-4,6-dehydratase utilized well TDP-glucose as a substrate and $NAD^+$ as a cofactor. The purified glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (dTDP-D-glucose synthase) could catalyze well the forward reaction with dTTP and D-glucose-1-phosphate, and the reverse reaction with dTDP-D-glucose and pyrophosphate. It was also found that maltol was produced from dTDP-4-keto- 6-deoxyglucose by the action of the purified dTDP-deoxyglucose epimerase.
In conclusion, the biosynthetic gene for macrolide antibiotic GERI-155 were cloned and characterized, even though PKS gene cluster and deoxysugar biosynthetic gene cluster were separately isolated. These results will make contribution in the creation of novel macrolide antiobiotics by combinatorial biosynthesis including gene disruption and/or module exchange.
목차 Contents
- Ⅰ. 연구계획 요약문...5
- 1. 국문요약문 ...5
- Ⅱ. 연구결과 요약문...6
- 1. 국문요약문 ...6
- 2. 영문요약문 ...7
- Ⅲ. 연구내용...8
- 1. 서론 ...8
- I. 항생물질과 생합성 유전자 ...8
- II. 마클로라이드 항생물질의 생합성 유전자 ...9
- 1) PKS (Type I) 유전자 ...10
- 2) Deoxysugar 생합성 유전자 ...11
- III. 생합성 유전자의 조합을 통한 신규 항생물질 ...11
- IV. 본 연구과제의 목적 ...14
- V. 연구과제의 중요성과 기대 효과 ...14
- VI. 연구의 범위 ...15
- 2. 연구방법 및 이론 ...16
- I. 균주, 배양 및 운반체 ...16
- II. 항생물질 추출 및 항균 역가 측정 ...16
- III. Polymerase chain reaction (PCR)에 의한 유전자 증폭 ...16
- IV. DNA 염기서열 결정 ...17
- V. 염색체 DNA의 분리 및 cosmid library의 구축 ...17
- VI. Probe labelling 및 Southern hybridization ...18
- VII. 재조합 유전자의 발현 유도 및 발현 단백질의 분리 정제 ...18
- VIII. Subcloning ...19
- IX. Gene disruption에 의한 항생물질 생합성 유전자의 규명...19
- X. Column chromatography를 이용한 단백질의 분리 정제 ...20
- XI. 단백질의 분자량 측정 ...20
- XII. 효소 활성 측정 ...21
- XIII. LC/MS를 이용한 발효산물 검출 ...21
- 3. 결과 및 고찰 ...22
- I. Streptomyces sp. GERI-155 균주의 GERI-155 생산 발효조건 조사 및 분리정제 ...22
- 1. 배양시간, pH, 성장곡선에 따른 항생물질 생산 ...22
- 2. 배양액 내 항생물질 GERI-155의 pH에 대한 안정성 및 용매 이행성 ...22
- 3. 흡착제에 대한 흡착성 및 탈착성 ...23
- 4. 균체 및 배양여액으로부터 GERI-155의 분리정제 ...24
- II. Macrolactone (aglycon)을 지령하는 PKS 유전자 군의 염기서열 분석 및 확인 ...25
- 1. Macrolactone (aglycon)을 지령하는 PKS 유전자를 함유한 클론 선별 ...25
- 2. Macrolactone (aglycon)을 지령하는 PKS 유전자 클론의 염기 서열 결정 ...30
- 1) pGK48 clone의 염기서열 분석 ...30
- 2) pGK11 clone의 염기서열 분석 ...31
- 3. Macrolactone (aglycon)을 지령하는 PKS 유전자의 서열비교 분석 ...42
- 4. Macrolactone (aglycon)을 지령하는 PKS 유전자의 추가 확보 ...52
- 1) Cosmid library로부터 새로운 PKS clone 선별 ...52
- 2) Chromosome walking을 통한 새로운 clone의 선별 ...53
- 5. Gene disruption을 통한 PKS 유전자의 기능 확인 ...55
- 1) Gene disruption을 위한 운반체 구축 ...55
- 2) Gene disruption 된 Streptomyces sp. GERI-155에서의 항생물질 생산능 검정 ...56
- III. Deoxysugar 생합성 유전자의 분리 및 염기서열 분석 ...58
- 1. dTDP-glucose 4,6-dehydratase DNA probe의 제작 ...58
- 2. Deoxysugar 생합성 유전자의 분리 ...59
- 3. dTDP-glucose synthase DNA probe의 제작 및 deoxysugar 생합성 유전자의 새로운 분리 ...60
- 4. Deoxysugar 생합성 유전자의 염기서열 분석 ...62
- 5. Deoxysugar 생합성 유전자의 서열 비교 분석 ...68
- 1) dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase (ORF10, GerE) 유전자의 서열 비교 분석 ...68
- 2) Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (dTDP-Dglucose synthase, ORF9, GerD) 유전자의 서열 비교 분석...69
- 3) dTDP-deoxyglucose epimerase (ORF8, GerF) 유전자의 서열 비교 분석 ...69
- 6. dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase (GerE) 유전자의효소 활성 측정 ...70
- 1) GerE 유전자의 발현 운반체 제조...70
- 2) GerE (dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase) 유전자의 대장균 내 발현 및 분리 정제 ...70
- 3) dTDP-glucose 4,6-dehydratase 의 효소활성 측정 ...73
- 7. Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (dTDP-Dglucose synthase, ORF 9, GerD) 유전자의 효소 활성 측정 ...74
- 1) GerD 유전자의 발현 운반체 제조 ...74
- 2) GerD (dTDP-D-glucose synthase) 유전자의 대장균 내 발현 및 분리 정제 ...74
- 3) Glucose-1-phosphate thymidylyltrasferase 효소 활성 측정 ...77
- 8. dTDP-deoxyglucose epimerase (ORF 8, GerF) 유전자의효소 활성 측정 ...78
- 1) GerF 유전자의 발현 운반체 제조...78
- 2) GerF (dTDP-deoxyglucose epimerase)의 대장균 내 발현 및 분리 정제 ...78
- 3) dTDP-deoxyglucose epimerase의 효소 활성 측정 ...80
- 4. 결론 ...81
- 5. 인용문헌 ...84
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