초록 ▼

본 연구과제는 뇌 시상하부 시신경교차상핵 (SCN)을 주 모델 시스템으로 생체시계의 조절 메카니즘을 규명하고 신경호르몬 혹은 새로운 조절인자를 탐색하여 새로운 유전자 발현 제어기술을 개발하여 유전자 치료 등 타 기술에 응용할 수 있는 기반확립을 목표로 수행되었다. 주요 연구 결과는 다음과 같다. 1. 일주기성 신경호르몬의 실시간 유전자 발현 측정기술 확립을 위해서 1) 칼슘 증가 및 인산화/탈인산화 효소의 영향에 의한 일주기 유전자 mPer1 발현을 RNase protection assay로서 실시간 발현을 규명하였으며, 2) SE

본 연구과제는 뇌 시상하부 시신경교차상핵 (SCN)을 주 모델 시스템으로 생체시계의 조절 메카니즘을 규명하고 신경호르몬 혹은 새로운 조절인자를 탐색하여 새로운 유전자 발현 제어기술을 개발하여 유전자 치료 등 타 기술에 응용할 수 있는 기반확립을 목표로 수행되었다. 주요 연구 결과는 다음과 같다. 1. 일주기성 신경호르몬의 실시간 유전자 발현 측정기술 확립을 위해서 1) 칼슘 증가 및 인산화/탈인산화 효소의 영향에 의한 일주기 유전자 mPer1 발현을 RNase protection assay로서 실시간 발현을 규명하였으며, 2) SEAP reporter를 이용한 GT1 세포주에서 GnRH 프로모터의 활성을 측정하였다. 3) 세포내 생리활성물질 및 유전자 발현 측정에 FRET을 적용하여 표적 mRNA 측정의 효율을 확인하였으며, 또한 YFP 유사체 YFTins, Caspase3의 활성측정을 위한 DEVDins 등 4종 이상의 바이오센서와 유사체를 개발하였다. 2. 1) 실시간 발현측정을 위한 리포트 시스템인 tetracydine 조절유전자 (TRE)를 생체시계 조절인자 측정용 리포터 M34-luc에 적용하여 CLOCK-BMAL1의 기능분석을 성공적으로 수행하였으며, 2) 세포내에서의 실시간 발현측정을 위해 GFP 형광단백질을 표지한 일주기 유전자 리포터 시스템을 구축하였다. 또한 3) SCN, Retina, GT1 cDNA library를 구축함으로써 일주기 유전자 발현을 조절하는 인자를 탐색할 수 있는 발판을 마련하였다. 3. 1) 생체시계 생리활성 측정을 위한 실험 모델 연구의 일환으로 in vitro 모델로 SCN 기원세포주인 SCN2.2에서의 NMDA 수용체의 아형태의 특이적 발현양상 확인 및 송과선 기원 세포주인 PGT${\beta}$ 배양을 구축함과 동시에 멜라토닌 수용체의 발현을 통해서 NAT-luc 리포트의 활성에 제한됨을 확인하였다. 2) 또한 GFP가 결합된 일주기 유전자에 대한 재조합 Adenovirus를 통해 신경세포인 GT1, GH3, SCN2.2에서의 유전자 도입 효율성을 향상시킴으로써 세포에서 일주기 단백질의 세포내 분포를 확인 했을 뿐만 아니라, 차후 일주기상 유전자 돌연변이 모델을 적용할 수 있는 기반을 구축하였다. 2) 곤충세포에서 일주기 유전자의 세포내 발현 및 위치변화 측정법을 확립함으로써 생체시계 유전자의 세포내 분포에 영향을 주는 새로운 신물질을 스크리닝할 수 있는 가능성을 시사하였다. 이외에 일주기성을 분석할 수 있는 Real-time RT-PCR 측정기술을 적용하여 실시간 발현 측정법을 정립하였다. 4. 1) 일주기 유전자에 대한 adenovirus를 제작하여 세포내 유전자 도입을 향상시켰으며, SCN2.2 세포주에서 일주기 단백질들의 세포내 분포를 확인하였다. 이상의 연구결과는 생체시계 유전자 발현제의 분자기작을 규명하는 것은 물론 생체리듬을 이용한 바이오센서 개발, 유전자치료 등에 활용할 수 있다고 사료된다.

Abstract ▼

The present study aims to elucidate the molecular mechanism underlying the biological clock-regulated genetic network and to search for neurohormone/neurotransmitter or novel clock gene and regulatory elements in the model of suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus. Furthermore, this platform te

The present study aims to elucidate the molecular mechanism underlying the biological clock-regulated genetic network and to search for neurohormone/neurotransmitter or novel clock gene and regulatory elements in the model of suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus. Furthermore, this platform technique is able to develop clock-motivated gene therapy vector system and chronogenetherapy model system by genetic manipulation that allows the circadian expression of target genes at a specific time of a day: Firstly, we attempted to develop several novel techniques to monitor gene expression in a real-time manner by examining the cytoplasmic influx of Ca$^{+2}$ and activation of PKA, which were closely involved in induction of circadian clock gene (mPer1). GnRH promoter activity was measured the activity of GnRH promoter using a SEAP (secreted alkaline phosphatase)-based technique to monitor GnRH secretion and expression simultaneously in GnRH-producing GT1 cell line. we succeeded in application of FRET (fluorescence resonance energy transfer) technology to measuring target mRNA and developed several YFP analogues such as YFPins and DEVDins for analysis of caspase3 activity. Accordingly, these tools provided possibility for real-time analysis of physiological activity of intracellular molecules and gene expression in a single cell level. Secondly, to construct the reporter system for real-time measurement, we measured transcription activity of CLOCK:BMALl heterodimer using M34-Luciferase reporter system, which contains a promoter with luciferase tagged clock-controlled cis-element (E-box) and is inserted TRE (tetracycline response element) sequence as a inducible factor to control the expression. Moreover, we prepared the SCN, retina and GT1 cDNA library to search a novel gene that regulates the circadian clock genes. Thirdly, to generate in vivo and in vitro model for the measurement of the physiological activity of circadian clock, we verified specific expression pattern of NMDA isotypes in SCN2.2 cell line originated from SCN and confirmed the restriction of NAT-luc reporter activity in pineal gland immortalized cell line, PGTB. Also the efficiency of gene delivery was improved into neuronal cell lines such as GTl, GH3 and SCN2.2 using GFP-tagged clock adenovirus and then imaged specific-distribution of clock proteins in the cell lines. Promotion of exogeneous gene delivery by clock adenovirus could be applied for restoration of the mutant model for circadian gene and for chronogenetherapy. In addition, we provide a potential tool to screen new molecules that could be expected to influence the cellular expression and distribution in the insect cell, SF2l and real-time RT-PCR was set up for analysis of circadian rhythmicity. Taken Together, the present study contributes not only elucidation of molecular feedback mechanism of biological clock genes but also application of chronogenetherapy and biosensor for study of circadian rhythms in the future.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• 목차...6
• SUMMARY...7
• CONTENTS...8
• 제1장 연구개발과제의 개요...9
• 1. 연구개발의 개요...9
• 2. 연구개발의 필요성...9
• 제2장 국내외 기술개발 현황...13
• 1. 국외현황...13
• 2. 국내현황...16
• 3. 앞으로의 전망...17
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...18
• 1. 연구방법 및 내용...18
• 1) 1단계 1차년도 연구방법 및 내용...18
• 2) 1단계 2차년도 연구방법 및 내용...19
• 3) 2단계 1차년도 연구방법 및 내용...20
• 4) 2단계 2차년도 연구방법 및 내용...22
• 2. 연구수행 결과...23
• 1) 1단계 1년차 연구내용 및 결과...23
• 2) 1단계 2차년도 연구내용 및 결과...24
• 3) 2단계 1년차 연구내용 및 결과...26
• 4) 2단계 2년차 연구내용 및 결과...30
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...55
• 1. 1단계 목표 달성도...55
• 2. 2단계 목표 달성도...58
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...60
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...64
• 제7장 참고문헌...66