보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
권성원
|
참여연구자 |
김근태
,
김대기
,
노시훈
,
주현경
,
최문영
,
홍순선
,
박정희
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2008-11 |
과제시작연도 |
2008 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO201000000393 |
과제고유번호 |
1475003876 |
사업명 |
안전성관리기반연구 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
내인성 대사체.생체시료.분석.표준작업수순서.endogenous metabolite.analysis.metabolic biomarker.biological sample.standard operation protocol.
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초록
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대사체학 연구에 있어서 생체시료 중에 존재하는 내인성대사체를 신속하고 정확하게 분석하는 분석법 확보는 매우 중요하다. 따라서 본 연구는 생체시료 (뇨, 혈청, 간) 중의 내인성대사체를 성분별 (당, 아미노산 및 지방산) 로 분석하기 위해 NMR, LC 및 GC의 분석기기를 이용한 분석방법을 개발하였으며, global profiling을 위한 내인성대사체 분석방법 SOP (표준작업수순서) 26 건을 작성하여 제시하였다. 1차적으로 생체시료의 적절한 시료 전처리 과정을 선정하기 위해, 전처리를 줄임과 동시에 효율적이면서 재현성있는 분석
대사체학 연구에 있어서 생체시료 중에 존재하는 내인성대사체를 신속하고 정확하게 분석하는 분석법 확보는 매우 중요하다. 따라서 본 연구는 생체시료 (뇨, 혈청, 간) 중의 내인성대사체를 성분별 (당, 아미노산 및 지방산) 로 분석하기 위해 NMR, LC 및 GC의 분석기기를 이용한 분석방법을 개발하였으며, global profiling을 위한 내인성대사체 분석방법 SOP (표준작업수순서) 26 건을 작성하여 제시하였다. 1차적으로 생체시료의 적절한 시료 전처리 과정을 선정하기 위해, 전처리를 줄임과 동시에 효율적이면서 재현성있는 분석기법 발굴을 시도하였다. 이를 위하여 다양한 종류의 용매를 사용하여 추출한 후 NMR, LC 및 GC의 분석결과를 비교하여 최적의 내인성대사체 추출조건을 확립하였으며, 뇨, 혈청, 간의 생체시료를 채취하는 방법을 다각적으로 검토하였다. 성분별 분석은 isotope $(^{13}C_6$ glucose,$\;^{13}C$ methyl-$D_3$ methionine 및$\;^{13}C$ palmitic acid) 의 spike test로써 실험 하였으며, 생체시료의 matrix에서의 추출 회수율로 용매 추출에 따른 재현성을 높이는 분석 기법을 발굴하였다. 특히 단당류, 아미노산, 지방산 그룹을 동시에 분석할 수 있는 동시분석법이 확보하기 위하여 새로이 HILIC 컬럼 등을 사용하여 대부분 극성인 내인성대사체를 분석하였다.
개발된 분석방법의 검증을 위하여, 내인성대사체 분석 조건을 확립하는데 positive control 로 작용 할 수 있는 분석대상 약물로써 acetaminophen을 선정하여 (확실히 간 독성을 유발될 것으로 예상되는 수준으로 투여용량 선정함; 1g . $kg^{-1}$ 복강투여) 생체시료 중의 내인성대사체를 NMR, LC 및 GC의 분석기기를 사용하여 확인하였다. 또한 변화가 일어난 내인성대사체를 통계적으로 검정하기 위하여 각 약물 대조군과 투여군의 데이터를 수집하여 R language를 이용하여 sliding window, Wilcoxon 순위합검정, plot analysis, 본페로니 검정 등의 수순을 통하여, 그룹 간의 통계적 유의성을 확인하였으며, 주성분 분석을 통해 주성분에 따른 통계적 분석을 실시하여, global 및 targeting metabolomics과 high-throughput 분석 시에 필연적으로 수반되는 poor and complex data의 질을 높였다.
이와 같이 제시된 본 연구의 결과로부터, 내인성대사체 분석법의 표준작업수순서 (SOP, standard operation protocol) 26건이 확립되어, 분석기기를 이용하여 생체시료 내의 내인성대사체 연추를 수행할 때 유용하게 활용될 것으로 예상되며 특히 대사체학 관련 연구의 초기 단계에 있는 일선 기관에서 본 연구에서 확립된 표준작업수순서를 충실히 참조할 경우, 효율적이면서 재현성있는 내인 성대사체 분석사업을 수행할 수 있을 것으로 판단된다.
Abstract
▼
Three analytical technique,$\;^1H$ nuclear magnetic spectrometry, liquid chromgtography and gas chromtograpy, were employed for the acquisition of endogenous metabolites in living organism such as urine, serum and liver tissue.
Isotope spike test was performed using $\;^{13}C_6$
Three analytical technique,$\;^1H$ nuclear magnetic spectrometry, liquid chromgtography and gas chromtograpy, were employed for the acquisition of endogenous metabolites in living organism such as urine, serum and liver tissue.
Isotope spike test was performed using $\;^{13}C_6$ glucose,$\;^{13}C$ methyl-$D_3$ methionine and$\;^{13}C$, palmitic acid to determine appropriate solvent extraction method for sugars, amino acids and fatty acids analysis.
Through the selected solvent extraction method, a standard operation protocol (SOP) for endogenous metabolites was established.
Acetaminophen selected as positive control drug was injected intraperitoneal (i.p.) injection 1 g/kg body weight. The concentration of acetaminophen, which is enough to reveal an acute liver injury, selected was based on previous studies.
Urine, serum and liver tissue in drug treated rats was extracted selected solvent extraction method. The spectral data collected from$\;^1H$ NMR, LC/MS and GC/MS was tested by R language to determine significant different. Also SAS package and Multi-Variate Statistical Package (MVSP) was performed for principal component analysis.
Therefore, the results of this study are expected to be useful in the endogenous metabolites analysis according to established standard operation protocol (SOP) for endogenous metabolites.
목차 Contents
- 용역연구개발과제 최종보고서...1
- 제출문...2
- 목차...3
- I. 연구개발결과 요약문...4
- 최종보고서 요약문...4
- Summary...6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표...8
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...10
- 1.3 국내.외 기술개발 현황...11
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...12
- 2.1 분석법 개발...12
- 2.2 LC/MS 분석...58
- 2.1.3 GC/MS 분석...91
- 2.2 개발된 분석법의 Application...166
- 2.3. 통계 분석...243
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...280
- 3.1 샘플수집방법, 내인성대사체 분석 및 통계분석 표준작업수순서 총 26종 제시...280
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...372
- 1. ¹H NMR을 이용한 내인성대사체 분석...372
- 2. LC/MS를 이용한 내인성대사체 분석...372
- 3. GC/MS를 이용한 내인성대사체 분석...373
- 4. 통계분석을 통한 테이터 해석...374
- 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...375
- 5.1 활용성과...375
- 5.2 활용계획...376
- 제6장 기타 주요변경사항 ...376
- 제7장 참고문헌 ...376
- 제8장 첨부서류 ...377
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