초록 ▼

대사체학 연구 분야에서 약물 및 식품 섭취로 인하여 발생하는 기전 등을 연구하기 위하여 생체 시료 중에 존재하는 내인성 대사체를 신속하고 정확하게 분석하는 기법을 확립하여야 한다. 따라서 본 연구는 기 개발된 내인성 대사체 분석방법을 검증하고, 한층 더 향상된 기법을 제시함으로써 대사체 연구분야의 표준작업지침서 (SOP)을 작성하여 제시하고자 한다. 기기 선정에서는 핵자기공명 (NMR), 기체 크로마토그래피/질량분석기기 (GC/MS)를 선정하여 기 개발된 분석법을 선택하여 검증하였다. 이에 더불어서 본 연구에서는 보다 high re

대사체학 연구 분야에서 약물 및 식품 섭취로 인하여 발생하는 기전 등을 연구하기 위하여 생체 시료 중에 존재하는 내인성 대사체를 신속하고 정확하게 분석하는 기법을 확립하여야 한다. 따라서 본 연구는 기 개발된 내인성 대사체 분석방법을 검증하고, 한층 더 향상된 기법을 제시함으로써 대사체 연구분야의 표준작업지침서 (SOP)을 작성하여 제시하고자 한다. 기기 선정에서는 핵자기공명 (NMR), 기체 크로마토그래피/질량분석기기 (GC/MS)를 선정하여 기 개발된 분석법을 선택하여 검증하였다. 이에 더불어서 본 연구에서는 보다 high resolution mass measurement가 가능한 LC/TOFMS 의 장비를 이용하여서 뇨, 혈청의 생체시료를 대상으로 아미노산, 당 및 지방산 내인성 대사체 분석법을 확립하였다. 각 실험은 분석방법과 분석기기를 특성에 맞게 선택하여 실시하여 분석기기의 장단점의 특성을 상호보완하여 수행하는 것이 이상적이다.기 개발된 내인성 대사체 분석방법 중 시료 전처리 과정을 더욱 간소화하고 동시에 효율적이면서 재현성있는 분석기법 발굴을 시도하였다. NMR 전처리의 경우, 기존 방법인 아미노산, 당,지방산 분석시 solvents를 사용하여 추출한 전처리 방법이 아닌 raw urine 및 serum에 buffer를 첨가하여 분석하는 방법을 선택함으로써 alanine외 아미노산, 당, 지방산 등 30종 이상의 대사체를 발견할 수 있었다. GC/MS의 전처리의 경우, 필요한 샘플량을 줄이는 실험과정을 수행하여 적은 양으로도 24종 이상의 많은 대사체를 발견할 수 있었다. 기존의 방법보다 간소화된 방법을 사용하여 더 많은 종류의 내인성 대사체를 판별하고 감도도 높은 방안을 모색할 수 있었다. LC/TOFMS의 경우 아미노산, 당, 지방산 각각의 물질 특성에 맞게 컬럼, 이동상의 용매 조건, fragment energy, collision energy 등을 조절하면서 22종 이상의 대사체를 탐색하는 최적의 조건을 확립하였다. NMR, GC/MS, LC/TOFMS에서 습득한 데이터들은 METLIN 등의 프로그램을 이용하여 구조 및 분자량을 파악하였고, 전처리 변수들간의 상호 연관성 등을 알아보기 위하여 Principal Component Analysis (PCA) 알고리즘 등의 다변량 통계분석을 이용하여서 수행하였다. 본 연구결과와 관련하여 내인성 대사체 분석법 표준작업지침서 10건을 확립하였으며, 관련기관 연구자들에게 제공함으로써 첨단분석기기를 이용하여 내인성 대사체를 분석할 때 활용할 것으로 예상되며, 효율적이며 재현성 있는 대사체 분석사업을 수행할 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼

Metabolomics aims at the comprehensive, qualitative and quantitative analysis of wide arrays of metabolites in biological samples. It has shown particular promise in the area of toxicology and drug development, functional genomics, system biology and clinical diagnosis. In this study, analytical tec

Metabolomics aims at the comprehensive, qualitative and quantitative analysis of wide arrays of metabolites in biological samples. It has shown particular promise in the area of toxicology and drug development, functional genomics, system biology and clinical diagnosis. In this study, analytical technique of 1H nuclear magnetic spectrometry (NMR) and Gas chromatography/Mass Spectrometry (GC/MS) was validated and upgraded rather than the procedures of previous organization for the acquisition of endogeous metabolites. In case of LC/MS analysis, MS instrument with high resolution mass measurement, such as time-of-flight (TOF) were employed. Urine and serum were extracted by selected solvent extration method. In case of NMR analysis, we found more than 30 metabolites performed not by using solvent extraction (previous method) but by raw urine and serum obtaining buffer (current method). In case of GC/MS analysis, we could acquired more than 24 metabolites, developed the previous methods by using more little amount of samples. We determined the optimized LC/TOFMS system and selected appropriated columns, mobile phases, fragment energy and collision energy, which could search more than 22 metabolites. The spectral data collected from 1H NMR, GC/MS and LC/TOFMS was testd by METLIN program to determine each metabolites. Also Multi-Variate Statisticl Package and PCA algorithm were performed for principal component analysis. Through the selected solvent extraction method, a standard operation protocol (SOP) for endogenous metabolites was validated. Therefore, the results of this study are expected to be useful in the endogenous metabolite fields according to validated SOP for endogenous metabolites.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 표지 ... 2
• 요약문 ... 4
• Summary ... 5
• 목차 ... 6
• I. 연구개발과제 연구결과 ... 7
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 7
• 제1절 연구개발과제의 필요성 ... 7
• 제2절 연구개발과제의 목표 ... 7
• 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 8
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 13
• 제1절 연구수행 내용 ... 13
• 제2절 생체시료 준비 ... 13
• 제3절 NMR analysis for endogenous metabolites ... 15
• 제4절 GC/MS analysis for endogenous metabolites ... 30
• 제5절 LC/TOFMSanalysis for endogenous metabolites ... 75
• 제6절 통계처리 방법 ... 109
• 제7절 표준작업지침서 제공 ... 112
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 135
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 140
• 제1절 목표 달성도 ... 140
• 제2절 관련분야 기여도 ... 140
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 141
• 제1절 활용성과 ... 141
• 제2절 활용계획 ... 141
• 제7장 참고문헌 ... 143