보고서 정보
주관연구기관 |
식품의약품안전평가원 |
연구책임자 |
홍충만
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참여연구자 |
정승태
,
홍성화
,
오일웅
,
박기대
,
김선희
,
최민정
,
권오석
,
김종환
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2009-12 |
과제시작연도 |
2009 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO201000012988 |
과제고유번호 |
1475004565 |
사업명 |
생물의약품 안전관리 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
동결보존.농도.부피.안정성.세포치료제.
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초록
▼
현재 개발 중인 세포치료제 중에는 최종 완제품을 동결하거나, 제조과정 (세포배양과정, 분화과정등) 중 에 동결과정을 거친 후 최종완제품을 생산하는 제품이 개발되고 있다. 그리고, 최종완제품의 농도, 충진부피를 변경하거나, 다수 규격의 제품을 동시에 개발하고자 하는 시도가 있어, 세포동결, 농도변화, 충진부피 변화에 따른 안정성에 대한 과학적 시험자료가 요구된다. 이에 본 연구에서는 세포치료제로 많이 연구, 개발되고 있는 사람 중간엽줄기세포를 이용하여 동결보존방법, 농도, 충진부피 등에 따른 중간엽줄기세포의 안정성에 대한 연구를 수행
현재 개발 중인 세포치료제 중에는 최종 완제품을 동결하거나, 제조과정 (세포배양과정, 분화과정등) 중 에 동결과정을 거친 후 최종완제품을 생산하는 제품이 개발되고 있다. 그리고, 최종완제품의 농도, 충진부피를 변경하거나, 다수 규격의 제품을 동시에 개발하고자 하는 시도가 있어, 세포동결, 농도변화, 충진부피 변화에 따른 안정성에 대한 과학적 시험자료가 요구된다. 이에 본 연구에서는 세포치료제로 많이 연구, 개발되고 있는 사람 중간엽줄기세포를 이용하여 동결보존방법, 농도, 충진부피 등에 따른 중간엽줄기세포의 안정성에 대한 연구를 수행하였다.
1. 동결보존안정성 검증
동결보존제 조성을 결정하기 위하여 예비실험을 수행한 결과, 일반적으로 사용하는 10%의 DMSO 보다 DMSO 5%에서 더 높은 세포생존율을 나타내었다. DMSO가 5% 포함된 조건에서 혈청이 첨가되면 세포생존율이 다소 높아지는 경향을 보이긴 하나 혈청을 포함하지 않는 조건에서도 90% 이상의 생존율을 나타내므로 이후 실험에서는 혈청을 사용하지 않았다. DMSO의 농도를 낮추는 대신sucrose와 trehalose를 cryoprotectants로 활용하여 다양한 동결보존제를 제조하였다. 동결기간별(2, 4,6주) 해동 후, 총세포수 및 세포생존율, 표면항원 분석 및 분화능의 변화유무를 관찰하였다. 동결기간에 따라 세포수 및 세포생존율은 큰 차이가 없으나 6주에는 양성 표면항원인 CD90과 CD105의 발현이 다소 줄어든 것으로 관찰되었다. 그러나 생존 세포를 이용하여 충분한 기간 동안 지방세포와 뼈세포로 분화를 유도한 결과, 동결기간에 관계없이 거의 모든 세포에서 분화가 유도되었다.
2. 세포농도 및 충진부피에 따른 저온저장 안정성 검증완제의약품의 형태로 제조된 세포를 다양한 세포농도별, 다양한 부피별로 준비하여 냉장고에 저온저장하면서 72시간까지의 안정성을 검증하였다. 보관 24시간까지는 90% 이상의 세포생존율을 나타내었으나 세포의 농도가 낮을수록, 충진부피가 클수록 48시간 이후의 세포생존율이 떨어지는 것으로 나타났다. 또한 모든 시료에서 CD105의 발현이 낮게 나타났고, 48시간째에 양성 표면항원이 특이적으로 크게 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 생존 세포를 이용하여 충분한 기간 동안 지방세포와 뼈세포로 분화를 유도한 결과, 동결기간에 관계없이 거의 모든 세포에서 분화가 유도되었다.
3. 결론
동결보존제 및 동결기간에 따른 세포의 안정성은 대체적으로 잘 유지되는 것으로 나타났다. 그러나 세포 농도별, 충진 부피별 안정성 실험에서는 세포생존율이 24시간까지는 잘 유지되나 48시간 이후에 떨어지기 시작하여 72시간째에는 저농도의 세포가 포함된 시료에서는 70% 이하로 관찰되기도 하였다. 세포의 표면항원 및 분화능도 동결보존 및 저온저장 기간에 관계없이 잘 유지되었다. 다만 보관 시간 이 지날수록 CD105의 발현 세포 비율이 떨어지는 경향을 보였다. CD105 발현 비율을 확인 마커로 활용하기 위해서는 좀 더 면밀한 관찰이 필요한 것으로 판단된다. CD105의 발현이 현저히 떨어진 6주 동결보관 세포군을 충분한 기간 분화시키면 거의 모든 세포가 분화됨에 따라, CD105 발현 세포 비율이 떨어지는 세포군을 분화시기별로 분화정도를 관찰하여야 할 것으로 판단된다.
Abstract
▼
Adipose tissue-derived Stem Cells(ADSCs) are utilized as a useful resource in many cell-based therapies. The ADSCs are often cryopreserved for future use but some cryoprotectants may have harmful influence on the stem cell quality such as stemness or viability. In this study, we investigated the inf
Adipose tissue-derived Stem Cells(ADSCs) are utilized as a useful resource in many cell-based therapies. The ADSCs are often cryopreserved for future use but some cryoprotectants may have harmful influence on the stem cell quality such as stemness or viability. In this study, we investigated the influence of cryoprotectants such as DMSO, FBS and disaccharides on cell quality. ADSCs were frozen with variable combinations of cryoprotectants. The cells were stored in liquid nitrogen for a given period. The cells were thawed and tested for viability with trypan blue, the proportion of ADSCs were determined by flow cytometry analysis and the multipotency of the cells was assessed by differentiation potential of the cells into osteocytes or adipocytes. In the preliminary study, FBS had no additional benefit on the cells and, thus, the use of cryopreservation solution with serum free and low oncentration of DMSO(5%) is suitable for cryopreservation of ADSCs used for cell-based therapy. From these data, we studied cell viability, MSC phenotype and differentiation potential as parameter of stability assessment. In result, there was no significant changes of viability, phenotype and representative CD marker according to our freezing condition/duration and concentration or volume of final products.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 자체연구개발과제 최종보고서 ... 2
- 요약문 ... 3
- Summary ... 4
- 목차 ... 5
- I 연구개발과제 연구결과 ... 6
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 6
- 제1절 연구개발과제의 목표 ... 6
- 제2절 연구개발과제의 필요성 ... 6
- 제2장 연구개발과제의 국내.외 연구개발 현황 ... 7
- 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과 ... 8
- 제1절. 중간엽줄기세포의 동결보존안정성 검증 ... 8
- 제2절. 중간엽줄기세포의 세포 수에 따른 저온저장안정성 검증 ... 19
- 제3절. 중간엽줄기세포의 충진 부피에 따른 저온저장안정성 검증 ... 24
- 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 27
- 1. 동결보존안정성 검증 ... 27
- 2. 세포농도 및 충진부피에 따른 저온저장안정성 검증 ... 27
- 3. 결론 ... 28
- 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 28
- 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ... 30
- 제1절 활용성과 ... 30
- 제2절 활용계획 ... 30
- 제7장 참고문헌 ... 32
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