초록 ▼

본 과제는 식품공전상 등재되어 있는 황색 포도상구균, 장염 비브리오, 클로스트리듐 퍼프린젠스 등에 대한 Real-time PCR을 이용한 신속 검출법을 확립하고 식중독사고 발생 시 원인균의 신속 정확한 동정과 역학조사용 분석법을 확립하는 것을 목표로 한다.
연구내용 및 방법은 각각의 식중독균이 흔히 발견되는 식품군을 선발하여 가이드라인에 따라 식중독균을 해당 식품군(육류 또는 해산물)에 인위적으로 오염시켜 전체 샘플 (20개)중 일부 양성 일부 음성 샘플이 나오게 하여 통계적 비교를 가능하게 하였다. 접종량은 식품내에 기본적으

본 과제는 식품공전상 등재되어 있는 황색 포도상구균, 장염 비브리오, 클로스트리듐 퍼프린젠스 등에 대한 Real-time PCR을 이용한 신속 검출법을 확립하고 식중독사고 발생 시 원인균의 신속 정확한 동정과 역학조사용 분석법을 확립하는 것을 목표로 한다.
연구내용 및 방법은 각각의 식중독균이 흔히 발견되는 식품군을 선발하여 가이드라인에 따라 식중독균을 해당 식품군(육류 또는 해산물)에 인위적으로 오염시켜 전체 샘플 (20개)중 일부 양성 일부 음성 샘플이 나오게 하여 통계적 비교를 가능하게 하였다. 접종량은 식품내에 기본적으로 존재하는 Background flora의 양을 고려하여 결정되었다. 접종 후에는 4$^{\circ}C$에서 18-24시간 동안 안정화과정을 거쳐 자연적으로 오염된 식품과 같은 상태로 만들었다. 식품공전 미생물시험법인 배지법과 최적 real-time PCR 기법으로 인위적으로 오염시킨 식품에서 접종한 균을 검출 확인, 동정 후 두 방법에서 얻은 결과를 통계학적인 방법으로 비교하여 검증하였다.
위의 실험 결과 real-time PCR을 이용한 검출법은 Background flora가 적은 샘플에서는 유의차가 발견되지 않고 신속한 검출이 가능하여 황색 포도상구균, 장염 비브리오, 클로스트리듐 퍼프린젠스룰 검출하는 데에 매우 효과적이었고 식품공전법의 대체방법으로 사용하기에 적절할 것으로 나타났다.
Background flora가 많은 샘플의 경우 장염 비브리오, 클로스트리듐 퍼프린젠스는 두 방법이 차이 없이 효과적으로 검출 가능했으나 황생포도상구균은 식품공전법에서 황생포도상구균이 아닌 다른 coagulase 양성균이 검출 되었으며 이는 위양성의 가능성이 있으므로 coagulase test후에 추가적인 생화학적 확인시험이 필요하다고 사료된다. 따라서 본 팀에서는 multiplex real-time PCR을 개발하여 coagulase test 없이 독소를 생성하는 균만을 검출할 수 있도록 하여 식품공전법의 위양성 가능성을 줄이고 간편화하였다. 장염 비브리오의 경우에는 real-time PCR을 이용하여 독소 유전자를 검출함으로서 병원성 장염비브리오만을 검출 하고, 클로스트리듐 퍼프린젠스의 경우에는 real-time PCR을 통해 정성 뿐만 아니라 정량검출까지 할 수 있는 방법을 확립하였다. 더불어 식중독균 검출을 위한 Real-time PCR기법 매뉴얼도 확립하였다. 본 과제의 연구결과를 적극 활용하여 real-time PCR을 이용한 식중독사고 원인식품, 오염원, 원인균의 신속명확한 규명으로 식품안전 관리의 효율성을 증가시킬 것이며 식품공전 미생물시험법의 최신화를 통한 첨단신속검사법의 활용이 확대될 것을 기대한다. 또한, 본 연구에서 확립된 “식중독균 검출을 위한 Real-time PCR기법 매뉴얼”을 일선 검사자들이 적극 활용하여 검사의 신속성, 정확성을 제고 할 것으로 평가된다.

Abstract ▼

Real-Time PCR assays for the detection of Staphylococcus aureus, vibrio parahaemolyticus, and Clostridium perfringenes were validated for their performance as an alternative method by comparing to Korean Food Code Bacterial Analysis Manual (KOBAM) methods. A wide variety of food groups was used incl

Real-Time PCR assays for the detection of Staphylococcus aureus, vibrio parahaemolyticus, and Clostridium perfringenes were validated for their performance as an alternative method by comparing to Korean Food Code Bacterial Analysis Manual (KOBAM) methods. A wide variety of food groups was used including pork, raw salmon, green radish sprouts, sausage, and ground beef, vegetable salad as food matrixes. Bulk samples of each food were inoculated with Salmonella spp. and divided into 20 samples. The percent of positive samples detected by culture method and real-time PCR were statistically analyzed. The levels of background flora in each food sample were calculated. The real-Time assays were equivalent with or better than the KOBAM method especially in case of those food groups that have high level of background natural microflora. We strongly recommend that the real-time PCR assays be a potential alternative method and a rapid screening method to the KOBAM for the detection of Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, and Clostridium perfringenes in Korean food groups that presumably could be a vehicle for each of the foodborne pathogens. In addition, Staphylococcus aureus producing toxin could be detected by multiplex real-time PCR targeting femA and coa gene. Moreover, in case of Vibrio parahaemolyticus, pathogenic Vibrio parahaemolyticus producing thermostable haemolysin could be simply detected by real-time PCR. In addition. the quantitative analysis of Clostridium perfringenes will be enable by real-time PCR. In colclusion, the real-time PCR assay required only 27 h (24 h for enrichment; 1 h for DNA extraction, 2 h for real-time PCR) in this study, while the culture method required 5 or more days. These advantages of real-time PCR contribute to its wide application for the detection of pathogens in food samples.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 최종보고서 요약문 ...4
• Summary ...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 제 1절 총괄연구개발과제의 목표 ...8
• 제 2절 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...12
• 제 3절 국내.외 기술개발 현황 ...13
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...17
• 제 1절 공통적으로 사용된 Real-time PCR방법 및 결과 분석 방법 ...17
• 제 2절 황색포도상구균의 연구방법 ...18
• 제 3절 장염 비브리오의 연구방법 ...21
• 제 4절 클로스트리듐 퍼프린젠스의 연구방법 ...23
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...25
• 제 1절 황색 포도상구균의 연구결과 ...25
• 제 2절 장염비브리오의 연구결과 ...41
• 제 3절 클로스트리듐 퍼프린젠스의 연구결과 ...50
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...58
• 제 1절 황색 포도상구균의 연구결과 고찰 및 결론 ...58
• 제 2절 장염비브리오의 연구결과 고찰 및 결론 ...59
• 제 3절 클로스트리듐 퍼프린젠스의 연구결과 고찰 및 결론 ...60
• 제 4절 식중독균 검출을 위한 Real-time PCR 기법 매뉴얼 ...62
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...73
• 제 1절 활용성과 ...73
• 5.2 활용계획 ...74
• 제6장 기타 중요변경사항 ...75
• 제7장 참고문헌 ...76
• 제8장 첨부서류 ...79