수지상세포치료제는 현재까지 불치병으로 알려져 있는 종양과 다양한 면역질환의 유력한 치료 후 보군이며 향후 여러 연구자에 의해 개발된 다양한 치료제의 본격 임상 적용이 기대되고 있다. 그럼에도 불구하고 아직까지 수지상세포치료제의 제조방법과 성상 등에 대한 비교 연구가 부족하여 적절한 수지상세포치료제의 가이드라인이 아직 만들어지지 못했으며, 이는 향후 수지상세포치료제의 임상 적용에 걸림돌로 작용할 것으로 예상된다. 따라서 본 연구자는 안전하고 효율적인 수지상세포치료제의 개발 및 임상적용을 위한 가이드라인을 제시하고자 본 연구를 수행하였
수지상세포치료제는 현재까지 불치병으로 알려져 있는 종양과 다양한 면역질환의 유력한 치료 후 보군이며 향후 여러 연구자에 의해 개발된 다양한 치료제의 본격 임상 적용이 기대되고 있다. 그럼에도 불구하고 아직까지 수지상세포치료제의 제조방법과 성상 등에 대한 비교 연구가 부족하여 적절한 수지상세포치료제의 가이드라인이 아직 만들어지지 못했으며, 이는 향후 수지상세포치료제의 임상 적용에 걸림돌로 작용할 것으로 예상된다. 따라서 본 연구자는 안전하고 효율적인 수지상세포치료제의 개발 및 임상적용을 위한 가이드라인을 제시하고자 본 연구를 수행하였다. 마우스 골수세포로부터 얻은 수지상세포를 항원, 항원+cocktail (항-CD40항체+TNF-α+IL-1β), LPS로 각각 8시간, 24시간, 48시간 동안 자극하여 수지상세포의 표면항원 (CD40, CD80, CD86, MHC class II, CCR7) 발현정도, 수지상세포의 세포질내 및 세포 배양액의 사이토카인 (IL-12, IFN-γ, IL-10) 분비, 수지상세포의 자극에 의한 T 세포의 증식반응 및 IFN-γ 생성 정도를 측정하였다. 또한 악성흑색종이 유발된 마우스를 각 실험군 (8시간과 48시간 군)의 수지상세포로 치료하여 임상적 유효성을 확인하고자 하였다. 이 후 in vitro에서 측정한 수지상세포치료제의 기능적 특성과 in vivo 결과의 연관성을 비교하여, 수지상세포치료제의 기준규격 설정을 위한 biomarker를 설정하고자 하였으며 면역치료 후 DTH 유도 정도와 종양 특이적 T 세포 증식 및 IFN-γ 생성 정도를 측정하여 수지상세포치료제의 유효성 평가를 위한 표준 시험법으로 설정하고자 하였다. 1) 종양항원이외에 수지상세포의 성숙을 유도하는 자극 인자에 따라서는 수지상세포의 IL-12 생성이 면역치료 효과를 증가시켰다. 반면 표면항원 증가나 수지상세포에 의해 자극된 T 세포의 IFN-γ 분비는 면역치료 효과와 관련이 없었다. 2) 수지상세포를 이용한 면역 치료시 DTH 반응과 ELISA 및 ELISPOT을 이용한 종양 특이적 T 세포의 생체외 IFN-γ 생성이 증가할수록 면역치료 효과가 증가하였다. 이상의 결과로, 수지상세포의 IL-12 생성이 수지상세포치료제의 임상적 유효성을 결정하는 중요한 biomarker로 생각된다. 또한 수지상세포를 이용한 면역 치료시 DTH 반응과 ELISA 및 ELISPOT을 이용한 종양 특이적 T 세포의 생체외 IFN-γ 생성 측정이 유효성 평가를 위한 표준시험법으로 이용될 수 있으리라 생각된다.
Abstract▼
Dendritic cell-based therapy becomes a strong candidate for the treatment of incurable cancers and various autoimmune diseases, and has been applied to human trials by a number of investigators. Nevertheless, the proper guideline of dendritic cell vaccines does not exist owing to the lack of the com
Dendritic cell-based therapy becomes a strong candidate for the treatment of incurable cancers and various autoimmune diseases, and has been applied to human trials by a number of investigators. Nevertheless, the proper guideline of dendritic cell vaccines does not exist owing to the lack of the comparative studies on the generation and characteristics of dendritic cell vaccines. The absence of the guideline is also an obstacle to clinical trials of dendritic cell immunotherapy. So we conducted this study in order to develop a guideline for the development and clinical trials of safe and effective dendritic cell vaccines. We prepared mouse bone marrow-derived dendritic cells and stimulated dendritic cells with Ag only, Ag+cocktail (anti-CD40 Ab+TNF-a+IL-1β), Ag+LPS during 8 hours, 24 hours and 48 hours respectively. And we evaluated the surface marker (CD40, CD80, CD86, MHC class II, CCR7) expression, T cell proliferation, cytokine (IL-12, IFN-γ, IL-10) production by dendritic cells, the production of IFN-γ by CD8(+) T cells. Also mice with melanoma were treated by stimulated dendritic cells with Ag only, Ag+cocktail (anti-CD40 Ab+TNF-a+IL-1β), Ag+LPS during 8 hours and 48 hours respectively. By means of matching the functional characteristics of dendritic cell vaccine and the clinical efficacy of dendritic cell vaccine, we intend to find biomarkers for the standardization of dendritic cell vaccines and establish the standard test for evaluating the clinical efficacy of dendritic cell vaccines in terms of DTH, tumor Ag-specific T cell proliferation, the production of IFN-γ by T cells. 1) The production of IL-12 from dendritic cells stimulated by tumor antigen or maturation cytokine cocktail improves the clinical efficacy of dendritic cell vaccines. But neither surface marker expression nor the production of IFN-γ from stimulated T cells was associated with the clinical efficacy. 2) The clinical efficacy of dendritic cell vaccines was associated with DTH response and the production of IFN-γ by stimulated T cells measured by ELISA and ELISPOT. In conclusion, we think that the production of IL-12 from stimulated dendritic cells can be an important biomarkers of dendritic cell vaccines in terms of clinical efficacy. And it seems that both DTH response and production of IFN-γ by tumor Ag-specific T cells can be used as a standardidized tests for evaluating the clinical efficacy of dendritc cell vaccines.
목차 Contents
표지 ...1
연구결과보고서 ...2
제출문 ...3
목차 ...4
I. 연구결과보고서 요약문 ...5
한글요약문 ...5
영문요약문 ...6
II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...7
제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...7
1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...7
1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...10
1.3 국내.외 기술개발 현황 ...12
제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...14
2.1 수지상세포의 배양 ...14
2.2 Biomarker 후보군 설정을 위한 수지상세포의 기능적 특성 조사 (in vitro) ...14
2.3 마우스 악성흑색종을 대상으로 한 면역치료 (in vivo) ...16
2.4 수지상세포치료제의 임상적 유효성 평가 및 유발된 면역반응 측정 ...16
2.5 수지상세포치료제의 기준규격 설정에 필요한 biomarker 및 수지상세포치료제의 유효성을 객관적으로 검증할 수 있는 표준시험법 개발 ...17
제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...18
3.1 수지상세포의 배양 및 표면항원 발현 ...18
3.2 종양항원과 항-CD40 항체 처리 순서가 미치는 영향 조사 ...18
3.3 성숙인자의 추가: LPS 또는 TNF-α와 IL-1β ...18
3.4 수지상세포의 intracytoplasmic cytokine 변화 ...19
3.5 수지상세포에서 분비하는 cytokine 확인 ...21
3.6 수지상세포에 의해 자극된 T 세포의 증식반응 (MLR) ...22
3.7 수지상세포에 의해 자극된 T세포에서 분비된 cytokine 측정 ...22
3.8 종양의 크기 변화 계측 ...22
3.9 마우스의 생존율 변화 ...24
3.10 DTH 변화 ...25
3.11 수지상세포치료 후 T 세포 증식 반응 ...26
3.12 수지상세포치료 후 T 세포에서 분비된 cytokine 측정...26
3.13 IL-12와 수지상세포치료제의 임상적 유효성의 상관관계 ...27
제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...29
제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...31
5.1 활용성과 ...31
5.2 활용계획 ...31
제6장 기타 중요변경사항 ...33
6.1 2차년도 연구개발 목표 ...33
6.2 Cytometric Bead Array (CBA)를 이용한 수지상세포의 염증성 cytokine 확인 ...33
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