초록 ▼

본 연구의 목적은 TCDD(다이옥신)의 독성효과를 볼 수 있는 in silico 독성평가시스템을 개발하고 TCDD의 세포 내 독성 메커니즘을 규명하는데 있다. 이를 위해 이미 전년도 과제에서 대규모의 마이크로어레이 실험을 수행하여 TCDD관련 신호전달경로에 대한 수학적 모델을 세운바 있다. 금년도 과제에서는 전년도 과제에서 얻은 마이크로어레이 데이터를 분석하고 단백질 정량실험을 통하여 수학적 모델을 보완, 확장하였다. 마이크로어레이 데이터를 분석하기 위해 군집화 기법과 gene set enrichment analysis를 사용하였으

본 연구의 목적은 TCDD(다이옥신)의 독성효과를 볼 수 있는 in silico 독성평가시스템을 개발하고 TCDD의 세포 내 독성 메커니즘을 규명하는데 있다. 이를 위해 이미 전년도 과제에서 대규모의 마이크로어레이 실험을 수행하여 TCDD관련 신호전달경로에 대한 수학적 모델을 세운바 있다. 금년도 과제에서는 전년도 과제에서 얻은 마이크로어레이 데이터를 분석하고 단백질 정량실험을 통하여 수학적 모델을 보완, 확장하였다. 마이크로어레이 데이터를 분석하기 위해 군집화 기법과 gene set enrichment analysis를 사용하였으며 이를 통해 p53과 HIF-1alpha라는 전사인자가 TCDD에 의해 영향을 받는다는 것을 발견하였다. 이 두 가지 전사인자는 TCDD와 강하게 결합하는 AhR과 crosstalk이 있다는 사실이 밝혀져 있는데 전년도 과제에서 수행한 마이크로어레이 실험의 분석결과에서 이를 확인할 수 있었다. 본 연구팀에서는 TCDD의 세포내효과를 시뮬레이션하기 위하여 여러 문헌정보를 이용하여 미분방정식을 기반으로 한 수학적 모델을 수립하였고 단백질 정량실험 데이터를 이용하여 모델의 파라메터를 추정하였다. 이렇게 수립된 수학적 모델을 이용하여 TCDD가 p53과 HIF-1alpha에 미치는 영향에 대해 시뮬레이션 연구를 수행하여 “TCDD가 DNA damage 하에서 p53의 역할을 감소시키고 hypoxia(저산소증) 상황에서 HIF-1alpha의 역할을 감소시킨다.”라는 가설을 제시하였다. 또한 TCDD의 독성 메커니즘을 규명하기 위하여 발암기전을 중심으로 여러 분자생물학적 실험을 수행하였다. 구체적으로 TCDD에 의한 활성산소 종(ROS) 생성, survival pathway와 apoptosis pathway의 변화를 관찰하는 실험을 수행하였으며 TCDD에 의한 암세포 형질전환 여부도 실험하였다. 마지막으로 위에서 수립한 수학적 모델에서 TCDD 농도와 DNA damage 상황 그리고 hypoxia 상황에 의해 변하는 독성관련분자의 양을 사용자가 쉽게 관찰할 수 있도록 graphical user interface 기반의 프로그램을 개발하였다. 이런 일련의 연구과정이 TCDD의 세포 내 독성 메커니즘뿐 아니라 다른 독성의 메커니즘을 규명하는 여러 연구에 유용하게 사용될 것이다.

Abstract ▼

The purpose of this project is to study the intra-cellular toxic mechanism of TCDD and to develop an 'in-silico toxicity evaluation system' based on biochemical experiments. An initial mathematical model was built in the previous project based on microarray experimental data. This project is actuall

The purpose of this project is to study the intra-cellular toxic mechanism of TCDD and to develop an 'in-silico toxicity evaluation system' based on biochemical experiments. An initial mathematical model was built in the previous project based on microarray experimental data. This project is actually a sequel of the previous work and we continued to analyze the genomic data of the previous project. In addition, we have carried out RT-PCR and western blot experiments to further complement the previous work. In this project, we found that two transcription factors, p53 and HIF-1alpha, are primarily affected by TCDD through clustering analysis and gene set enrichment analysis. It was reported that these two transcription factors have crosstalks with AhR, a most significant binding partner of TCDD. Throughout this project, we have surveyed a lot of databases and papers to further update the proposed mathematical model and used our own experimental data (western blot and RT-PCR experiments) to estimate the kinetic parameters of the model. By simulating this revised model, we have investigated how the concentration profile of p53 changes and how the HIF-1alpha and AhR are interlinked with each other along with the change of DNA damage, hypoxia status and TCDD intake. From these invetigations, we postulated that TCDD reduces the activity of p53 and HIF1-alpha under DNA damage and hypoxia, respectively. We also conducted several molecular biological experiments to examine tumorigenesis effect of TCDD. In particular, we took measurements of ROS generation, the change of survival and apoptosis pathway, and tumour transformation of cells by TCDD. Finally, we have developed a graphical user interface program to facilitate the evaluation of toxicity effects at a molecular level. These systems toxicological studies can help us to have a system level understanding on the TCDD toxicity.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 국문요약문 ...4
• 영문요약문 ...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...8
• 1.3 국내?외 기술개발 현황 ...9
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...10
• 2.1 마이크로어레이 데이터 분석 ...10
• 2.2 TCDD 가 영향을 미치는 신호전달경로 ...11
• 2.3 수학적 모델링 및 시뮬레이션 ...12
• 2.4 Graphical user interface에 기반한 TES ...14
• 2.5 세포배양 ...15
• 2.6 TCDD의 처리 ...15
• 2.7 HepG2 세포 성장에 대한 TCDD의 효과 분석 ...15
• 2.8 TCDD의 세포내 및 핵내 이동 과정 ...15
• 2.9 핵 내에서 TCDD와 DRE 결합 및 전사 조절 기전 ...15
• 2.10 TCDD에 의한 ROS 발생 측정 ...16
• 2.11 TCDD에 의한 survival pathway의 변화 ...16
• 2.12 TCDD에 의한 Apoptotic pathway의 변화 ...16
• 2.13 TCDD에 의한 암세포 형질전환 (cellular transformation) ...16
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...18
• 3.1 마이크로어레이 데이터 분석결과 ...18
• 3.2 수학적 모델링 및 시뮬레이션 ...19
• 3.3 TES ...20
• 3.4 세포배양 ...21
• 3.5 TCDD의 처리 ...21
• 3.6 HepG2 세포 성장에 대한 TCDD의 효과 분석 ...21
• 3.7 TCDD에 의한 AhR과 p53의 세포내 및 핵내 이동 과정 ...21
• 3.8 핵 내에서 TCDD와 DRE 결합 및 전사 조절 기전 ...22
• 3.9 TCDD에 의한 ROS 발생 측정 ...23
• 3.10 TCDD에 의한 survival pathway의 변화 ...24
• 3.11 TCDD에 의한 Apoptotic pathway의 변화 ...24
• 3.12 TCDD에 의한 암세포 형질전환 ...28
• 3.13 1단계 연구에서 도출된 TCDD-반응 유전자의 분자 유전학적 검증 ...29
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...30
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...31
• 5.1 활용성과 ...31
• 5.2 활용계획 ...32
• 제6장 기타 중요 변경사항 ...33
• 제7장 참고문헌 ...34
• 제8장 첨부서류 ...35
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과...36
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...37
• 1.1 세부연구개발과제의 목표 ...37
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ...37
• 1.3 국내?외 기술개발 현황 ...38
• 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...39
• 2.1 마이크로어레이 데이터 분석 ...39
• 2.2 TCDD 가 영향을 미치는 신호전달경로 ...43
• 2.3 수학적 모델링 및 시뮬레이션 ...45
• 2.4 Graphical user interface에 기반한 TES ...53
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...57
• 3.1 마이크로어레이 데이터 분석결과 ...57
• 3.2 수학적 모델링 및 시뮬레이션 ...69
• 3.3 TES ...73
• 제4장 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...77
• 제5장 제1세부연구개발과제의 연구성과 ...78
• 5.1 활용성과 ...78
• 5.2 활용계획 ...80
• 제6장 기타 중요변경사항 ...81
• 제7장 참고문헌 ...82
• 제8장 첨부서류 ...83
• III. 제2세부연구개발과제 연구결과 ...84
• 제1장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...85
• 1.1 세부연구개발과제의 목표 ...85
• 1.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ...86
• 1.3 국내?외 기술개발 현황 ...87
• 제2장 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...88
• 2.1 세포배양 ...88
• 2.2 TCDD의 처리 ...88
• 2.3 HepG2 세포 성장에 대한 TCDD의 효과 분석 ...88
• 2.4 TCDD의 세포내 및 핵내 이동 과정 ...88
• 2.5 핵 내에서 TCDD와 DRE 결합 및 전사 조절 기전 ...88
• 2.6 TCDD에 의한 ROS 발생 측정 ...88
• 2.7 TCDD에 의한 survival pathway의 변화 ...88
• 2.8 TCDD에 의한 Apoptotic pathway의 변화 ...89
• 2.9 TCDD에 의한 암세포 형질전환 (cellular transformation) ...89
• 제3장 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...91
• 3.1 세포배양 ...91
• 3.2 TCDD의 처리 ...91
• 3.3 HepG2 세포 성장에 대한 TCDD의 효과 분석 ...91
• 3.4 TCDD에 의한 AhR과 p53의 세포내 및 핵내 이동 과정 ...91
• 3.5 핵 내에서 TCDD와 DRE 결합 및 전사 조절 기전 ...92
• 3.6 TCDD에 의한 ROS 발생 측정 ...93
• 3.7 TCDD에 의한 survival pathway의 변화 ...94
• 3.8 TCDD에 의한 Apoptotic pathway의 변화 ...96
• 3.9 TCDD에 의한 암세포 형질전환 ...99
• 3.10 1단계 연구에서 도출된 TCDD-반응 유전자의 분자 유전학적 검증 ...100
• 제4장 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...103
• 제5장 제2세부연구개발과제의 연구성과 ...104
• 5.1 활용성과 ...104
• 5.2 활용계획 ...105
• 제6장 기타 중요 변경사항 ...106
• 제7장 참고문헌 ...107
• 제8장 첨부서류 ...108