초록 ▼

복어의 장기에 존재하는 테트로도톡신은 인간과 동물에게 신경마비를 일으키는 독소이다. 테트로도톡신은 신경세포의 내외부에 Na+의 흡수와 배출을 억제시킴으로서 신경근육의 마비를 일으킨다. 테트로도톡신에 의한 중독사건은 복어를 식재료로서 사용하는 한국, 대만, 일본, 중국 등과 같은 아시아지역에서 빈번히 발생하므로 테트로도톡신의 분석은 복어에 의한 중독에 대한 안전관리에 매우 중요하다. 현재 복어독의 표준 시험법은 다른 나라들과 마찬가지로 마우스를 이용한 동물시험법으로 설정되어 있다. 그러나, 살아있는 동물에게 고통을 주는 동물실험의 규

복어의 장기에 존재하는 테트로도톡신은 인간과 동물에게 신경마비를 일으키는 독소이다. 테트로도톡신은 신경세포의 내외부에 Na+의 흡수와 배출을 억제시킴으로서 신경근육의 마비를 일으킨다. 테트로도톡신에 의한 중독사건은 복어를 식재료로서 사용하는 한국, 대만, 일본, 중국 등과 같은 아시아지역에서 빈번히 발생하므로 테트로도톡신의 분석은 복어에 의한 중독에 대한 안전관리에 매우 중요하다. 현재 복어독의 표준 시험법은 다른 나라들과 마찬가지로 마우스를 이용한 동물시험법으로 설정되어 있다. 그러나, 살아있는 동물에게 고통을 주는 동물실험의 규제 확대로 인해 기기분석시험법으로의 개선이 요구되고 있다. 또한, 동물시험법의 감도나 정밀성 및 정확성의 한계로 최근에 동물시험법을 대체할 수 있는 시험법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 가장 유망한 대안으로 제시되고 있는 LC/MS/MS 시험법을 개발하고 시험법 유효성 검증을 위해 AOAC밸리데이션 가이드라인에 따라 밸리데이션을 수행하였다. LC/MS/MS시험법은 시료에서 테트로도톡신을 추출한 후 SPE(Solid phase extraction) 정제칼럼을 이용하여 정제하고 양이온 모드에서 MRM(multiple reaction monitoring)방법으로 분석하는 시험법으로서 밸리데이션 결과 검출한계(LOD)는 부위에 따라 0.03∼0.08 ug/g이었고, 정량한계(LOQ)는 0.10 ~ 0.25 ug/g이었다. 검량선의 상관계수($r^2$)는 0.9986 ∼ 0.9997이고, 회수율은 80.9% ~ 103.0%이었으며 상대표준편차(RSD)는 4.3% ~ 13.0%로서 적합한 시험법임을 확인하였다. 복어 검체의 부위별로 기기분석시험법과 동물시험법으로 분석을 실시하였으며, 이 분석값들의 상관관계를 분석한 결과, 상관계수는 0.95이상으로서 좋은 상관성을 나타내었다. 본 연구결과는 동물시험법을 LC/MS/MS 시험법으로 대체함으로서 TTX의 분석 효율성을 높일 수 있음을 보여주고 있다.

Abstract ▼

Tetrodotoxin(TTX) found in a number of organisms including puffer fish is an important xenobiotic that causes neurotoxicity in humans and animals. The mechanism of toxicity is known as its high affinity to block voltage-gated sodium channels which transport Na+ between the exterior and interior of c

Tetrodotoxin(TTX) found in a number of organisms including puffer fish is an important xenobiotic that causes neurotoxicity in humans and animals. The mechanism of toxicity is known as its high affinity to block voltage-gated sodium channels which transport Na+ between the exterior and interior of cells. Tetrodotoxin poisoning is sporadically reported in Korea, Taiwan, and Japan. Thus, the testing TTX to ensure the safety of seafood consumed is important in these countries. The current standard for testing TTX in foodstuffs is the mouse bioassay (MBA) in Korea as in many other countries. However, this test suffers from potential ethical concerns over the use of live animals. In addition, the mouse bioassay does not test for a specific toxin thus a sample resulting in mouse incapacitation would need further confirmatory testing to determine the exact source toxin (e.g., TTX, STX, brevotoxin, etc.). Furthermore, though the time of death is proportional to toxicity in this assay, the dynamic range for this proportional relationship is small thus many samples must be diluted and new mice be injected to yield a result that falls within the quantitative dynamic range. Therefore, in recent years, there have been many efforts in this field to develop alternative assays. High performance liquid chromatography (HPLC) coupled with mass spectrometry (MS) has been emerged as one of the most promising options. A LC-MS-MS method involves solid-phase extraction (SPE) and followed by analysis using an electrospray in the positive ionization mode and multiple reactions monitoring (MRM). To adopt LC-MS-MS method as alternative standard for testing TTX, we performed a validation study for the quantification of TTX in puffer fish according to AOAC method validation guideline. This LC-MS-MS method showed good sensitivity as limits of detection(LOD) of 0.03 ~ 0.08 ug/g and limits of quantification(LOQ) of 0.10 ~ 0.25 ug/g. The linearity($r^2$) of tetrodotoxin were 0.9986 ~ 0.9997, the recovery were 80.9 ~ 103.0% and the relative standard deviations(RSD) were 4.3 ~ 13.0%. The correlation coefficient between the mouse bioassay and LC/MS/MS method was higher than 0.95. Our results suggests that LC/MS/MS method could be replaced by mouse bioassay, improving efficiency of performance for TTX analysis.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서...1
• 표지...2
• 요약문...4
• Summary...5
• 목차...6
• 제1장 연구개발과제의 개요...7
• 제 1절 연구개발과제의 목표...8
• 제 2절 연구과제개발의 필요성...12
• 제2장 연구개발과제의 국내ㆍ외 연구개발 현황...13
• 제 1절 복어독의 독성연구...15
• 제 2절 복어독의 분석연구...17
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과...18
• 제 1절 연구수행 내용...18
• 제 2절 연구수행 결과...26
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...50
• 제 1절 복어 중 복어독 동물실험 결과...50
• 제 2절 복어 중 복어독 기기분석 결과...50
• 제 3절 동물실험과 기기분석 상관성 고찰...50
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...52
• 제 1절 목표달성도...52
• 제 2절 관련분야에 기여도...52
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획...53
• 제 1절 활용성과...53
• 제 2절 활용계획...54
• 제7장 참고문헌...55
• 제8장 첨부서류...58