초록 ▼

본 연구에서는 알파, 베타, 감마를 포함하는 모든 허피스바이러스에 보존되어있는 alkaline exonuclease(AE)에 대해 항허피스바이러스제 신규 분자 타겟으로서의 타당성을 검증하고자 alkaline exonuclease 상동체의 구조를 기반으로 하는 분자 표적 비교연구, 감마허피스 바이러스 AE의 기능 연구 및 구조-기능 상관관계 분석 연구를 수행하였음. 감마허피스바이러스 AE 상동체들(ORF37)은 잘 보존된 DNase 활성뿐 아니라 세포내 mRNA을 분해시키는 숙주억제 기능을 추가적으로 나타냈으며 ORF37 결손바이러스

본 연구에서는 알파, 베타, 감마를 포함하는 모든 허피스바이러스에 보존되어있는 alkaline exonuclease(AE)에 대해 항허피스바이러스제 신규 분자 타겟으로서의 타당성을 검증하고자 alkaline exonuclease 상동체의 구조를 기반으로 하는 분자 표적 비교연구, 감마허피스 바이러스 AE의 기능 연구 및 구조-기능 상관관계 분석 연구를 수행하였음. 감마허피스바이러스 AE 상동체들(ORF37)은 잘 보존된 DNase 활성뿐 아니라 세포내 mRNA을 분해시키는 숙주억제 기능을 추가적으로 나타냈으며 ORF37 결손바이러스는 전혀 증식할 수 없었음. ORF37의 두 기능을 나누어 구조-기능 상관관계를 분석하기 위해 AE 기능 또는 숙주억제 기능을 하나씩만 가진 돌연변이 잔기에 대해 제작한 바이러스는 그 증식이 급격히 감소했고 plaque size도 매우 작은 약독화된 성장을 in vitro 세포배양과 in vivo 마우스 감염 모두에서 유사하게 보였음. AE의 활성의 저해하는 후보물질을 발굴하기 위한 스크리닝 시스템을 구축하고 화합물을 스크리닝하여 다수의 후보물질을 확보하였음. 본 과제의 연구결과를 통해 감마허피스바이러스 ORF37이 갖는 신규 분자타겟으로서의 타당성을 검증하였음

Abstract ▼

Herpesviruses are known to establish lifelong persistent infection due to its latency and reactivation. Current antiviral drugs against herpesviruses are all developed to target viral DNA polymerase and drug resistant mutants have been reported more often in immunocompromised hosts, so that it is ur

Herpesviruses are known to establish lifelong persistent infection due to its latency and reactivation. Current antiviral drugs against herpesviruses are all developed to target viral DNA polymerase and drug resistant mutants have been reported more often in immunocompromised hosts, so that it is urgent to identify a new antiviral drug target. The DNase/alkaline exonuclease (AE) genes are conserved in all members of the herpesvirus subfamilies and required for efficient virus replication. Here, we set to validate whether a viral alkaline exonuclease may be a novel antiviral drug target against herpesviruses by characterizing individual functional contribution of MHV-68 ORF37 in the context of virus replication in vitro and in vivo. The AE homologs of gammaherpesviruses such as Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus SOX, Epstein-Barr virus BGLF5 and murine gammaherpesvirus 68 (MHV-68) ORF37, are shown to have an additional function to induce host shutoff (HS) by promoting the decay of mRNAs. MHV-68 ORF37 in ibited host gene expression in transfected cells and the recombinant ORF37 protein expressed in E. coli with high purity (rORF37) exhibited the exonuclease activity. The rORF37 protein also harbored an RNase activity in the presence of Mn2+ and Mg2+. In order to determine the functional importance of ORF37 during virus replication, we have constructed BACmids for an ORF37 STOP, an AE- or an HS-defective mutant and their corresponding marker rescue (MR) viruses. Transfection of an MHV-68 ORF37 STOP BACmid showed highly attenuated viral DNA replication and gene expression with no infectious virion production, while its marker rescue (MR) completely restored the growth defects, demonstrating that ORF37 plays an essential role in virus replication and can be an antiviral target. Next, we employed site-directed and random mutagenesis of MHV-68 ORF37 to generate AE- and HS-defective mutants, respectively. ORF37 mutants which led to the loss of only a single function were localized in both the nucleus and the cytop asm, similar to the wild-type. Both reconstituted AE- and HS- defective mutant viruses were replication-competent, but manifested highly attenuated in vitro growth with the smaller size of plaques, whereas their MRs replicated normally. These mutations also had effects on in vivo replication in mice. We also established an AE inhibitor screening system, screened approximately 3,200 chemical compounds, and obtained eight hits which reproducibly inhibit the AE activity in a dose-dependent manner, but not the host DNase activity. Our results suggest that both exonuclease and host shutoff activities of the virion-associated ORF37 protein are required for efficient in vitro and in vivo virus replication of MHV-68, therefore serving as a novel antiviral target.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• 목차 ... 10
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 11
• 1절. 연구개발의 필요성 ... 11
• 2절. 연구개발의 목표 및 내용 ... 14
• 제 장 국내외 기술개발 현황 ... 15
• 1절. 지금까지의 연구개발 현황 ... 15
• 2절. 앞으로의 전망 ... 19
• 제3장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 21
• 1절. 연구개발의 최종 목표 ... 21
• 2절. 연차별 연구개발 목표 및 내용 (선정당시 목표 대비) ... 21
• 3절. 연구수행 내용 및 결과 ... 22
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 88
• 1절. 연구개발의 최종목표 ... 88
• 2절. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 88
• 3절. 계획대비 달성도(선정시 제시된 연구목표) ... 88
• 4절. 세부 연구목표 가중치 부여 ... 90
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 91
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학 기술정보 ... 92
• 제7장 참고문헌 ... 93