연구의 목적 및 내용 본 연구의 목표는 식물호르몬 Abscisic acid (ABA, 앱시스산)의 생합성 유전자 AtNCED3의 발현 조절 기구를 탐색하는 것이다. ABA는 종자의 발아와 식물의 성장을 조절하는 주요 호르몬으로 ...
연구의 목적 및 내용 본 연구의 목표는 식물호르몬 Abscisic acid (ABA, 앱시스산)의 생합성 유전자 AtNCED3의 발현 조절 기구를 탐색하는 것이다. ABA는 종자의 발아와 식물의 성장을 조절하는 주요 호르몬으로 특히 가뭄이나 고염분과 같은 환경스트레스에 대한 식물체의 적응반응을 조절하여 식물의 성장과 생산성에 큰 영향을 미친다. 식물체 내에서 ABA는 환경스트레스에 의해 합성이 유도되며 관련 생합성효소들이 밝혀져 있다. 그러나 이들 효소들을 암호화하고 있는 유전자의 발현조절 기구는 알려져 있지 않다. 본 과제에서는 ABA 생합성 경로에서 속도조절단계를 촉매하는 효소 NCED3를 암호화하고 있는 AtNCED3 유전자의 발현 조절 기구 탐색의 일환으로 프로모터 분석을 수행하고자 하였다. 연구결과 1) AtNCED3 프로모터 분석 - AtNCED3 유전자의 유도발현 양상 조사 (가뭄, 고염분, 고삼투질, ABA) : RT-PCR 수행 - AtNCED3 promoter-GUS construct를 이용한 프로모터 활성 탐색 : Histochemical GUS assay를 수행하여 promoter 활성 확인 - Promoter deletion study를 통한 DNA 조절요소 동정 : 2.6 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 0,5 kb promoter construct를 제작하고 활성을 조사하여 조절요소 부위 탐색 2) In vitro protein-binding study - AtNCED3 basal promoter 부위에 존재하는 ABA response element (ABRE) 확인 - EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)를 수행하여 ABRE 결합단백질 동정 3) 조절요소결합 전사인자 유전자 분리 - ABRE를 포함한 one-hybrid reporter 제작 : HIS3, LacZ double reporter system - One-hybrid screen 수행 : ~2,000,000 yeast transformants screen - Positive clone 분리 : ~65 positive clone 분리 - Positive clone 분석 : 염기서열 분석 및 유전자 동정 (bZIP class 전사인자 확인) 연구결과의 활용계획 본 연구를 통하여 AtNCED3의 프로모터 활성에 필요한 조절요소의 위치가 대략적으로 확인되었다. 이 들 결과는 추후 좀 더 세밀한 deletion 및 기타의 mutational study를 통하여 조절요소를 정밀하게 조사하는데 유용하게 사용될 것이다. Protein-DNA interaction study와 One-hybrid screen 결과 AtNCED3 promoter에 존재하는 ABRE를 확인하고 여기에 결합하는 전사인자를 확인하였다. 이 결과를 토대로 이들 전사인자가 ABA 합성 조절에 관여하는지 탐색하고자 하는 후속실험을 수행하고자 함.
Abstract ▼
Purpose& contents The goal of the proposed study is to decipher the regulatory mechanism of AtNCED3 gene to better understand t...
Purpose& contents The goal of the proposed study is to decipher the regulatory mechanism of AtNCED3 gene to better understand the biosynthetic mechanism of the phytohormone abscisic acid (ABA). ABA is a major hormone that regulate seed germination and plant growth. In particular, ABA affects plant growth by mediating adaptive responses to abiotic stresses such as drought and high salinity. ABA synthesis in plants is induced by abiotic stresses and its biosynthetic enzymes are known. However, it is not known how the genes encoding the enzymes are regulated. In this study, we will identify regulatory elements necessary for the ABA- and stress-inducible expression of AtNCED3 gene. Result 1) AtNCED3 promoter analysis - Investigated stress-induction pattern of AtNCED3 gene expression: RT-PCR - Investigated promoter activity utilizing 2.6 kb promoter-GUS construct: Histochemical GUS assay - Promoter deletion anlysis to identify cis-regulatory elements: tested four deletion constructs (2.6 kb. 1.5 kb, 1.0 kb, 0.5 kb) 2) In vitro protein-binding study - Identified an ABA response element (ABRE) within the basal promoter region - Identified ABRE-binding nuclear protein by electrophoretic mobility shift assay 3) Isolation of the genes encoding the proteins interacting with the ABRE - Prepared One-hybrid reporter construct containing the ABRE - Carried out one-hybrid screen: 2,000,000 transformants screened - Isolated positive clones: 65 clones were isolated - Positive clones were sequenced and their identity was determined: bZIP class proteins Expected Contribution the AtNCED3 gene by serial deletion study of the 5' flanking seqence. The result will be used to identify regulatory elements by fine deletion and other mutational studies in the future. We also idenfied an ABA response element within the basal promoter region of AtNCED3 and showed that a nuclear protein binds the element. By susequent study, we isolated genes encoding the proteins. In the future, we will investigate the role of these transcription factors in the regulation of AtNCED3 gene.
