초록 ▼

◦세부과제명: IgG Fc 작성 및 발현연구
- 돼지 및 소의 간장, 비장세포 및 PK-15, MDBK 세포주로부터 총 RNA의 각각 분리
- 돼지 비장 또는 PK-15 및 소의 비장 또는 MDBK주에서 추출된 RNA로부터 각 transferrin receptor (TR)의 transmembrane (TM) 도메인을 코딩 유전자의 클로닝(2종: 돼지 pTR, 소 bTR )
- 돼지 및 소의 간장 세포로부터 RNA의 각각 분리후 소 및 돼지의 IgG1의 Fc유전자 클로닝(2종: 돼지 Fc, 소 Fc )
- 배양세

◦세부과제명: IgG Fc 작성 및 발현연구
- 돼지 및 소의 간장, 비장세포 및 PK-15, MDBK 세포주로부터 총 RNA의 각각 분리
- 돼지 비장 또는 PK-15 및 소의 비장 또는 MDBK주에서 추출된 RNA로부터 각 transferrin receptor (TR)의 transmembrane (TM) 도메인을 코딩 유전자의 클로닝(2종: 돼지 pTR, 소 bTR )
- 돼지 및 소의 간장 세포로부터 RNA의 각각 분리후 소 및 돼지의 IgG1의 Fc유전자 클로닝(2종: 돼지 Fc, 소 Fc )
- 배양세포에 대한 형질전환 효율을 형광현미경으로 바로 확인하기위한 마커 단백질로서 GFP를 사용하고자 GFP 유전자를 증폭, 클로닝하고 이를 포함하는 플라스미드(pBudGFP)를 제조
- pBudGFP를 이용하여 돼지 및 소의 각 TR 유전자, IgG의 Fc 도메인 유전자 및 GFP 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조: 돼지 pBGFP-pTR-Fc 및 pBGFP-pTR-dHFc 2종 및 소 pBGFP-bTR-Fc 1종
- 돼지 Fc 발현용 플라스미드를 Vero 세포주에 트랜스펙션하여 형질전환한 세포주 Vero-pIgGFc1 1종과 pBGFP-pTR-dHFc로 형질전환한 세포주 Vero-pIgGdHFc(1), Vero-pIgGdHFc(2) 및 Vero-pIgGdHFc(3) 3종을 선발
- 소 Fc 발현용 플라스미드를 Vero 세포주에 트랜스펙션하여 형질전환된 세포주 Vero-bIgGFc 1종을 선발
◦세부과제명: IgG Fc 작성 및 발현연구
- 돼지 Fc 발현 Vero 세포주(Vero/Fc)의 외피 Fc 발현 확인(비고정 세포 IFA법)
- Vero/Fc 발현 Fc 분자 western blot 분석 확인: 50 kD에 해당하는 Fc 분자 확인
- Gold 결합 protein A를 이용한 전자현미경법으로 Fc의 세포 및 바이러스 외피 발현 확인
- 소 Fc 발현 Vero 세포주 작성 및 FITC anti-bovine 항체를 이용한 IFA로 bFc의 발현 확인
- 작성된 bFc 발현 Vero 세포주에서 소유행열바이러스(BEFV)의 증식 및 Fc 함유여부 확인
- Fc 재조합 Retrovirus 이용 Fc 발현 세포주 작성 기법 확립
- Fc 재조합 Retrovirus 이용 Fc 발현 MDBK 세포주(MDBK/Fc) 작성 및 IFA 확인
- 면역세포 활성화 검증기법 확립: ELISPOT, CTL assay, FACS 및 T cell proliferation법
ｏ 세부과제명: 돼지 IgG Fc 매개 백신 개발연구
- Vero/Fc 이용 오제스키병 바이러스 증식 및 시험백신(Fc) 및 대조백신(IL2/βgal) 생산 완료
- 마우스 접종시험결과 T cell 증식능에서는 증식지수(stimulation Index:SI)가 두 백신에서 1.4-2.1범위로 나타났고 103.0 TCID50의 불활화 바이러스 감작한 경우에는 시험백신(Fc)이 대조백신에 비해 T cell 증식능이 높은 것을 확인
- 마우스 접종후 ELISPOT 시험결과 γ-IFN 분비능이 106.0-107.0 TCID50의 불활화 바이러스 감작한 경우 95% 신뢰수준에서 2배 이상 증가됨을 확인
- 마우스 접종후 체액성면역 측정결과 ELISA에서는 두 백신군 모두 접종횟수에 비례하는 높은 항체가를 나타냈고 3차접종 후 중화항체가는 시험백신(Fc)이 58.7로 대조백신의 20.4 보다 2배 이상 높게 나타났다.
- 마우스 면역 후 고역가(106.3 TCID50/ml) 공격접종시 시험백신(Fc)군이 폐사 개시시간이 다소 늦어짐을 확인
- 시험백신의 돼지접종 시험(자돈 15두) 완료
- 돼지 접종실험결과 T cell 증식능에서는 증식지수(stimulation Index:SI)가 두 백신에서 1.0-1.6범위로 나타났고 105.0-106.0 TCID50의 불활화 바이러스 감작한 경우에는 시험백신 (Fc)이 대조백신에 비해 T cell 증식능이 높은 것을 확인
- 돼지 접종실험결과 FACS분석에서 시험백신(Fc)은 CD4 및 CD8 세포에서 각각 24.4 및 6.0%로 대조백신의 21.3 및 5.4% 보다 γ-IFN 분비 유도능이 높았음
- 돼지 접종후 ELISPOT 시험결과에서도 시험백신(Fc)은 불활화바이러스 감작 시 γ-IFN 분비능이 106.0 및 107.0 TCID50의 불활화 바이러스 감작한 경우 각각 95% 및 99% 신뢰수준에서 2배 이상 증가됨을 확인되었고 106.0 및 107.0 TCID50의 live 바이러스 감작 시에서도 증가됨을 확인
- 체액면역의 경우도 2차접종후 시험백신(Fc) 및 대조백신(IL2/βgal)에 의한 중화항체가가 170배 및 100배로 나타나 Fc가 체액면역 활성화에 기여하는 것으로 확인됨
- 종합적으로 Fc 매개 백신은 접종 돼지의 T-세포 증식 및 면역세포의 γ-IFN 분비능을 증가시켜 세포매개 면역뿐만 아니라 체액면역의 활성화에도 기여함을 확인 할 수 있었음

Abstract ▼

In the present study we established a stable cell line expressing bovine Fc on the purpose of virus cultivation for the production of vaccine with enhanced inducing activities of immune response against bovine viral diseases.
Bovine Fc molecule of bovine IgG containing hinge, CH2 and CH3 domains

In the present study we established a stable cell line expressing bovine Fc on the purpose of virus cultivation for the production of vaccine with enhanced inducing activities of immune response against bovine viral diseases.
Bovine Fc molecule of bovine IgG containing hinge, CH2 and CH3 domains and membrane transferrin receptor were amplified by PCR and cloned into pBudGFP, a plasmid vector for mammalian expression. Vero cells were transfected with vector construct and selected with Zeocin. Vero cells expressing bovine Fc were characterized with western blotting and immunofluorescence assay and expression level of Fc was confirmed by ELISA. Finally, bovine ephemeral fever virus (BEFV) was cultivated in established cell line and Fc presence on viral envelope was determined by reinfection to naïve vero cells.
48 hours after the transfection, green fluorescence were observed in manipulated vero cells. Transfectant cells were selected with 1mg/ml of Zeocin until the colony which is able to be isolated was formed. Clones highly expressing bovine IgG Fc were chosen by ELISA. From the chosen cell lines, ~50kDa bovine Fc domain was confirmed by western blotting and location of Fc domain both in cytoplasm and on the surface were characterized by FA. We performed virus reinfection to confirm the production of virus harboring Fc molecule by propagation from the established cell line. Presence of Fc molecule in naïve vero cells reinfected with BEFV cultivated from these cell lines was detected.
In the present study, Fc domain of bovine IgG was cloned and expressed in Vero cells. Stable cell line was established and ~50kDa Fc domain was detected in cytoplasm and the cell surface as well. Virus reinfection assay results implied viral particles gained Fc molecules by the cultivation in the cell lines expressing bovine Fc.

목차 Contents

• 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 3
• 1. 연구배경 ... 3
• 2. 연구최종목표 ... 4
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구방법 및 전략 ... 6
• Ⅲ. 연구결과 ... 7
• 가. 제1세부과제명: IgG Fc 작성 및 발현연구 ... 7
• 나. 제2세부과제명: 돼지 IgG Fc 매개 백신 개발연구 ... 22
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 26
• Ⅴ. 고 찰 ... 27
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 28
• Ⅶ. 참고문헌 ... 29
• Ⅹ. 영문초록 ... 29