초록 ▼

생물공학적인 방법으로 안전하게 GABA를 생산할 수 있는 공정을 개발하고자 하였다. 우선적으로 GRAS 미생물인 유산균을 대상으로 GABA 생산능을 검토하여 우수균주 Lb. brevis IFO를 선발하였다. GABA의 생산에는 NADH의 공급이 수반되어야 하므로 효소고정화에 의한 공정을 초기에 고려하였으나 생산성에 비하여 고가의 NADH의 공급과 재사용을 위한 적절한 방안이 없으므로 균체의 고정화에 의한 공정의 개발과 회수공정의 최적화에 초점을 맞추어 연구를 진행하였다. 기본 배지로는 GYP (Glucose, Yeast extrac

생물공학적인 방법으로 안전하게 GABA를 생산할 수 있는 공정을 개발하고자 하였다. 우선적으로 GRAS 미생물인 유산균을 대상으로 GABA 생산능을 검토하여 우수균주 Lb. brevis IFO를 선발하였다. GABA의 생산에는 NADH의 공급이 수반되어야 하므로 효소고정화에 의한 공정을 초기에 고려하였으나 생산성에 비하여 고가의 NADH의 공급과 재사용을 위한 적절한 방안이 없으므로 균체의 고정화에 의한 공정의 개발과 회수공정의 최적화에 초점을 맞추어 연구를 진행하였다. 기본 배지로는 GYP (Glucose, Yeast extract, Peptone)을 기본으로 하고 이의 최적 조건을 검토하였다. 탄소원으로는 glucose가 가장 생산성에 영향을 미쳤으며 ammonium sulfate를 lOmM 첨가하였을 때 생산성이 가장 우수하였다(약 48시 간 후에 5% MSG를 100% 전환함), Glucose의 농도는 0.6% 이상에서는 더 이상 생산성의 증가를 가져오지 않으므로 0.6%가 경저l적인 농도로 판단되었다. 그리고 세포를 파쇄 하였을 경우 보다는 전체 세포를 그대로 이용하였을 경우 GABA 생산률이 우수하였으며 배지의 pH를 4.0으로 낮추어 유지하였을 때 전환률이 우수하였다. 세포의 이용률과 연속공정의 개발을 위하여 균체를 고정화는 조건에 매하여 검토하였다. 고정 방법은 alginate bead에 균처l를 고정하는 방법을 사용하였으며 연속공장의 경우 column에 bead를 채워 생물전환을 시도하였을 경우 MSG를 GABA로 전환하는 공정에서 발생하는 C02 기포에 의하여 bead가 파괴되는 문제점을 유발하였다 따라서 column에 충진하는 대선 배양액에 bead를 첨가하고 stirring 하는 방식을 채택하였다. 고정화 균체에 의한 전환용 매체로는 pH를 4로 조정한 buffer 보다는 pH를 4로 조정한 배지를 이용하는 것이 전환률이 우수하였다. 즉 생물전환에는 균체뿐 아니라 에너지원의 공급이 필요함을 알 수 있었다. 또한 고정화하는 균체의 량과 매지 농도에 비례하여 생물전환이 일어남을 알 수 있었다. Bead의 제조시 포집되는 균체의 안정화에 기여하고자 다양한 안정제의 효과를 검토한 결과 isomalto-oligosaccharide를 0.6% 첨가하여 제조한 경우 10% 의 MSG를 48시간 후에 90% 이상 GABA로 전환할 수 았었다 생물전환에 대한 pH의 효과를 pH 3.5~4.5 구간에서 좀 더 세밀하게 검토한 결과 pH 3.7-3.7로 조절한 경우는 12시 간 이전에 bead의 용해가 일어나 균체가 용출되어 균체 재사용에 대한 문제점을 일으켰으며 pH4.0 이상에서는 문제가 발생하지 않았다. 온도의 경우는 최작 전환 온도구간이 32-34'C 로 설정되었으며 이 구간에서는 36시 간에 10% 의 MSG를 100% GABA로 전환하였다. 생물전환 과정 중 (pH4.2, 34'C, 48시 간 반응)에서 생균수의 변화를 측정한 결과 bead 내의 Lb. brevis IFO 의 숫자는 일정하게 유지되어 매우 안정화 되어 있음을 알 수 있었다. 이 조건에서 bead의 재사용 횟수틀 검토한 결과 5회 부 터 약간의 bead 용해가 열어남을 알수 있었으며 이에 대한 보완이 필요하였다. 생산된 GABA의 효과적인 회수를 위하여 MSG와 GABA의 pI를 고려하여 pH를 4로 조절하고 양이온 교환수지(Amberlite 200)를 사용하여 정제하고자 하였다 NaCI 이 나 NaOH를 이용할 경우 GABA만을 정제할 수 있었으나 최종 제품에 salt가 함유되는 문저l점이 았으며 이를 제거하기 위한 방안을 강구하고 있다. 이상의 공정을 scale•up 조건에서 확인하고 공정을 개선하기 위하여 우선 50L 발효조에서 재현하여 보았디. pH를 4.0으로 고정하고 10% 의 MSG를 첨가한 조건에서 48시 간 후에 약 75%가 전환되었으며 발효 후 손쉽게 반응액과 bead를 분리하여 재사용 할 수 있었다. 그라나 일부 bead가 파손되는 현상이 발생하였다 이는 발효조의 impeller 크기와 rpm의 변화에 대한 고찰이 펼요힘을 시사 하였다. 이렇게 얻은 생물전환 배양액을 분무간조를 통하여 건조한 결과 60% 이상의 GABA를 함유하는 시재품을 얻을 수 있었다 이는 현재까지 발표된 GABA 농도 중에서 가장 높은 수준에 해당하는 것이다, 생물잔환 GABA의 산업적얀 적용(식품·소재)을 용이하게 하기 위하여 식품용 배지(두유, 유청, 우유)를 대상으로 생물전환능을 검토한 결과 1% 의 MSG 첨가 후 Lb. brevis IFO로 발효한 결과 대부분의 MSG가 GABA로 전환됨을 확인하였다. 이는 선발 균을 이용하여 곧바로 발효에 적용하여 최소 가공공정을 통한 GABA 함유 원료를 생산할 수 있는 가능성을 보여주는 것이다.
형질전환을 통한 GABA 생산능을 부여하기 위한 연구의 일환으로 기존에 개발되어 있던 비피더스용 발현벡터에 쌀에서 유래한 GAD 유전 자를 도입하는 연구를 수행하였다. 즉 GABA 생산능이 거의 없는 비피더스 균주(MG1)에 대하여 형질전환을 시도한 결과 모균주에 비하여 약 2배의 GABA 생산능이 향상된 형질전환제를 얻을 수 있었으며 C-terminal에 대한 변형을 가한 결과 더욱 높은 GABA 생산능과 높은 MSG 농도에서의 성장능을 보여 유전자 연구에 의한 새로운 균주의 개발에 대한 가능성을 제시하였다. 현재까지의 GABA 생산에 관한 보고를 살펴보면 최근 파마바이오에서 GAD 의 활성의 높은 유산균 ( Lactobacillu s hilgardii K- 3) 을 김치에서 분리해내 GABA 함 량을 높인 유산균 발효엑스 ‘Pmma GABA20' 을 개발하였으며 일본 신주(信州)대학농학부 연구팀은 현미(玄米)l백 g당 8mg 정도 함유되어 있는 GABA 를 발아(發芽)시키면서 3백 mg 이상 증가시키는 결과를 얻은 것이 가장 높은 수치였으나 본 연구를 통하여 최종 정제를 하지 않은 상태에서도 약 60% 의 GABA 함유 원료를 생산할 수 있었으며 이온교환수지법을 통하여 손쉽게 GABA 를 정제할 수 있는 공정을 개발하였다. 또한 생산성은 낮지만 형질전환에 의하여 이미 그 생리활성이 우수한 프로바이오틱스 유산균이 비피더스를 GABA 생산용 균주로 개발 할 수 있는 가능성을 보여주었다.

Abstract ▼

The objective of this project was to develop a biotechnological process for the production of GABA using lactic acid bacteria. Firstly, a food grade bacteria with high activity of converting MSG to GABA was screened among lactic acid bacteria and identified as Lb. brevis IFO. For the optimal product

The objective of this project was to develop a biotechnological process for the production of GABA using lactic acid bacteria. Firstly, a food grade bacteria with high activity of converting MSG to GABA was screened among lactic acid bacteria and identified as Lb. brevis IFO. For the optimal production of GABA, the general incubating conditions were optimized for C- and N-sources, pH, temperature etc. The result showed that the optimal concentration of glucose and ammonium sulfate was 0.69<, and lOmM, respectively. And the pH of the reaction medium was controlled to be 4.0 and the temperature was maintained 32-34"(: for the maximal conversion. The intactness and viablility of the cell was necessary for the normal conversion of 1\1SG. The stability of entrapped bacteria was improved by adding O.(j96 of Isornalto-olizosaccharide to the bead. When the reaction medium was maintained at pH 3.7-3.7, the beads began to be degraded after 12 hours but no problem had occurred when the pl-l was controlled above 4.0. The viability of the entrapped cell at pH4.2, 34℃ maintained for 48 hours without decreasing and the beads were reused 5 times without losing activity. For the efficient recovery of the produced GABA, Ion exchange chromatography was applied considerting pl value of GADA and MSG. The buffer was controlled to be pH 4.0 and NaCl or NaOH was applied to elute GABA from cation exchange resin (Amberlite 200). The above condition was applied to 50L pilot fermenter system and tested for the scale up.
More than 70% of initial MSG(10% w/v) was converted into GABA after 48 hours when incubated at pH4.2, 34℃ maintained and the converted product was easily isolated from the bead. We can obtained sample product containing more than 60% of GABA by spray drying of the reaction medium without purifying GABA. The isolated LAB was also applied for the fermentation of milk, soymilk and whey containing MSG (1% w/v) and showed good conversion rate which result shows that the LAB can be used for the production of functional food containing GABA. To develop a Bifidobacterium strain with enhanced ability of GABA production, we cloned a GAD gene derived from rice into Bifidobacterium-E. coli shuttle vector pBES2 and transformed Bifidobacterium longun by electroporation. The transformed Biiidobacterium strain expressing the foreign rice GAD protein has higher GAD activity compared with untransformed Bifidobacterium counter part. By culturing the strains in MRS medium containing 1% monosodium glutamate(MSG), the levels of GABA produced in the transformed Bifidobacterium longun by electroporation. The transformed Bifidobacterium strains expressing the foreign rice GAD protein has higher Gad activity compared with untransformed Bifidobacterium counter part. By culturing the strains in MRS medium containing 1% monosodium glutamate(MSG), the levels of GABA prosuced in the transformed and untransformed strains were 315 nmol/㎖ and 45 nmol/㎖, respectively. In 3% MSG conditions, the levels of GABA in the transformed and untransformed were 1,008 nmol/㎖ and 11 nmol/㎖, respectively. Likewise, transformed Bifidobacterium maintained normal growth rate in spite of the condition of high-concentration MSG. However, the growth of untransformed Bifidobacterium was remarkably retarded. As a consequence, Bifidobacterium has been transformed to have GABA producing activity from high MSG concentration by introducing plant GAD gene.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 4
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 16
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 41
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함) ... 43
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 45
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 63
• 7. 참여연구원 편성표(총괄) ... 64
• 8. 첨부서류 ... 66