초록 ▼

연구의 목적 및 내용
본 연구는 기 연구된 뇌허혈시 아그마틴의 신경세포 보호효과 및 분화 조절 능력에 주안, 생체 내에서 아그마틴의 생성을 유도하는 알기닌탈탄소효소 (Arginine Decarboxylase, ADC) 유전자를 함유한벡터를 이용하여 아그마틴을 과량 생성하는 새로운 신기능 줄기세포주를 1차년도에 개발 하였으며, 2차년도에는 새로운 줄기세포주의 신경세포 보호 기능 강화 및 분화 조절 능력을 규명하고, 3차년도에는 기존의 세포치료기술의 한계점을 극복한 효과적인 세포치료법을 구축 하였음.
연구결과
● 제 1

연구의 목적 및 내용
본 연구는 기 연구된 뇌허혈시 아그마틴의 신경세포 보호효과 및 분화 조절 능력에 주안, 생체 내에서 아그마틴의 생성을 유도하는 알기닌탈탄소효소 (Arginine Decarboxylase, ADC) 유전자를 함유한벡터를 이용하여 아그마틴을 과량 생성하는 새로운 신기능 줄기세포주를 1차년도에 개발 하였으며, 2차년도에는 새로운 줄기세포주의 신경세포 보호 기능 강화 및 분화 조절 능력을 규명하고, 3차년도에는 기존의 세포치료기술의 한계점을 극복한 효과적인 세포치료법을 구축 하였음.
연구결과
● 제 1차년도: 새로운 ADC 발현 줄기세포주 개발
생체 내에서 자체적으로 아그마틴을 생성하는 ADC 과발현 SCR029 cell line, 신경줄기세포, SVZ & hippocampal neuroprogenitor 세포를 개발하여 ADC 유전자 발현 여부를 RT-PCR, ADC 항체를 이용해 일차적으로 확인. 또한, ADC 활성 검증. ADC과발현 세포로부터 과생산되는 아그마틴의 양을 HPLC를 이용하여 정량. 유전자도입 확인 후, ADC과발현 세포에서의 세포사 억제 및 기능 강화를 확인하기 위해, growth factor deprivation, serum 및 glucose deprivation등의 injury 후, MTT assay나 caspase 또는 LDH assay 등을 이용하여 세포사 조사. NOS 발현이나 BCL-2 & BCL-x 발현 조사를 통해 기능 강화 확인.
● 제 2차년도: 새로운 ADC 발현 줄기세포주의 특성 규명
ADC과발현 줄기세포주는 neurosphere의 크기는 감소시키고, 그 수는 증가시킴. 또한 neurosphere의 core부위에 존재하는 줄기세포의 세포사멸을 감소시켰으며, 세포주기 중 G2-M기에 있는 세포의 수가 증가. 이는 이는 ADC 과발현으로 인해 각 neurosphere 당 살아 있는 세포의 수가 증가되었고, 이로 인해 single cell suspension으로 만들었을 때도 많은 ES cells이 살아 있음을 의미함. 또한, ADC과발현 줄기세포주는 많은수가 미분화 상태임을 확인할 수 있었음. 그밖에 ADC과발현 줄기세포주의 경우 분화속도가 급격히 증가함을 확인함. 이는 실제세포치료시에 열악한 미세환경에 줄기세포 이식시 세포정착에 매우 유리할 것이라 생각. 마지막으로 ADC과발현 줄기세포주는 세포손상 특히 oxidative stress에 대해 정상세포에 비해 저항성이 강화되어 중추신경계 손상시 세포치료제로 유리하게 활용될 수 있다고 여겨짐.
● 제 3차년도: ADC 과발현 줄기세포의 세포치료기술확립
뇌허혈손상 모델에서 아그마틴과 신경줄기세포의 이식은 신경줄기세포의 paracrine effect와 agmatine의 신경보호효과가 합쳐져 효용증진 효과를 나타내어 신경기능회복을 나타내었고 또한, 척수손상모델에서 아그마틴의 처리는 신경교성반흔을 줄이고, 척수손상으로부터 신경세포를 보호하여 신경학적 기능회복을 도와준다고 여겨짐. 이를 통해 아그마틴의 세포치료 효용증진 효과를 확인 한 후, ADC과발현 줄기세포주를 뇌허혈 손상 동물모델에 이식하여 신경학적 운동기능 회복을 확인. 또한, 아그마틴 또는 ADC 유전자가 도입된 신경줄기세포를 이식한 실험군에서 신경전구 세포의 양이 증가 하였고, ADC 유전자가 도입된 신경줄기세포 이식한 실험군에서 신경교성반흔을 감소시켰음.
연구결과의 활용계획
본 연구결과를 통해 ADC-mNSCs의 중추신경계 질환의 세포치료 효과를 확인하였으며, 이를 통해 효율적인 세포치료법을 제안하였음. 본 과제의 성공적 수행을 통해 향후 추가되는 연구에서는 ADC gene이 도입된 인간 중간엽 줄기세포 또는 인간성체, 배아 신경줄기세포를 개발함으로써, 본 연구결과를 인간의 중추신경계 질환치료에 이용하기 위한 연구의 기반으로 삼고자 함.

Abstract ▼

Purpose&contents
Agmatine has been shown to have neuroprotective effect and ability to modulate differentiation of neural stem cells in various neuronal disease model. In this project, we intend to develop new neural stem cells that produce excessive amount of agmatine, using viral vector contain

Purpose&contents
Agmatine has been shown to have neuroprotective effect and ability to modulate differentiation of neural stem cells in various neuronal disease model. In this project, we intend to develop new neural stem cells that produce excessive amount of agmatine, using viral vector containing arginine decarboxylase (ADC) gene which induces the production of agmatine endogenously. By demonstrating neuroprotective effect and ability to modulate differentiation in these newly developed neural stem cells, we plan to build more effective cell therapy technique overcoming the limitations that current techniques have.
Result
The 1^st year : Developing new ADC-expressing neural stem cells.
Neuro-stem cell and SVZ & hippocampal neuroprogenitor cell to know ADC gene expression by RT-PCR, ADC antibody at first. Also, ADC activity confirmation, the amount of agmatine from ADC over-expressed cell by HPLC. After gene transduction confirmation, we researched cell death by using MTT assay, caspase, LDH assay for confirming enriched function and cell death inhibition on ADC over-expressed cell after serum and glucose deprivation injury. Function reinforcement is confirmed by expression of NOS and BCL-2 & BCL-.x.
The 2^nd year : Defining the characteristic of the newly developed ADC-expressing neural stem cells.
ADC over-expressed stem cells reduced neurosphere’s size and increased its amount. Also, It declined cell death of stem cells that existed on neurosphere’s core region and increased the amount of cells on G2-M phase in cell cycle. Alive cells per each neurosphere are increased by ADC over-expression. It meant lots of neural stem cells also live when we made it single cell suspension. Also, we confirmed that amounts of ADC over-expression stem cells were still undifferentiated state in culture media. Moreover, in case of ADC over-expressed stem cells in differentiation media condition, we confirmed that rate of differentiation increased rapidly. This result showed the advantage of cell settle when stem cells transplanted microenvironment for clinical cell therapy. Finally, ADC over-expression stem cells is advantaged used as cells therapy when CNS was damaged, because ADC over-expression stem cells is stronger than normal cells on damaged cells especially to oxidative stress.
The 3^nd year : Establishment of new cell therapy technique using ADC-overexpressing neural stem cells in various neural disease model.
After MCAO injury, we confirmed the recovery of neurological motor function recovery cause of agmatine and neural stem cells affected synergic effect on the ischemia. Also, in model of spinal cord injury treat of agmatine reduce glia scar formation and help neurological functional recovery as protection of neuron from spinal cord injury. For the reason, we investigated the effect of ADC-NSCs transplantation on the MCAO injury, we treated ADC-NSCs transplantation at 1week after MCAO injury, confirmed the recovery of neurological motor function and amounts of DCX+cells are highly appeared in ADC over-expression stem cell transplantation group. Moreover, we confirmed the temporal glia scar formation at 2weeks in ADC-NSCs transplantation group, 4weeks after MCAO, glia scar formation decreased in penumbra region.
This results suggested when ADC-NSCs transplantation for clinical stroke, its useful tool for stem cell therapy with out agmatine daily treatment.
Expected Contribution
We confirmed the therapeutic tool for CNS disease by ADC-NSCs transplantation, suggested novel stem cell therapy. After our research goals based on this project, we will be development of ADC gene integration in Human mesenchymal stem cells, human adult stem cells or human embryonic stem cells.

목차 Contents

• 중견연구자지원사업(핵심연구) 최종보고서 ... 1
• 목차 ... 2
• 연구계획 요약문 ... 3
• 연구결과 요약문 ... 4
• 한글요약문 ... 4
• SUMMARY ... 5
• 연구내용 및 결과 ... 6
• 1. 연구개발과제의 개요 ... 6
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 15
• 4. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 43
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 46
• 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 47
• 7. 주관연구책임자 대표적 연구실적 ... 48
• 8. 참고문헌 ... 48
• 9. 연구성과 ... 49
• 10. 기타사항 ... 60
• 대표연구성과 ... 61