1. 「산업기술의 유출방지 및 보호에 관한 법률」 제2조제2호에 따른 국가
핵심기술 관련 연구개발과제를 수행한 경우
2. 「소재ㆍ부품ㆍ장비산업 경쟁력강화를 위한 특별조치법」 제2조 제3호에
따른 핵심전략기술 관련 연구개발과제를 수행한 경우
3. 법 제21조제2항에 따라 보안과제로 분류된 연구개발과제를 수행한 경우
4. 연구개발기관의 장이 해당 연구개발성과에 대하여 지식재산권을 취득
하려는 경우
5. 외국의 정부ㆍ기관ㆍ단체와의 협정ㆍ조약ㆍ양해각서 등에 따라 해당
연구개발기관의 장이 비공개를 요청하는 경우
6. 「대ㆍ중소기업 상생협력 촉진에 관한 법률」 제24조의 2에 따라 중소
기업이 연구개발성과를 임치한 경우
7. 그 밖에 영업비밀 보호 등 정당한 사유가 있는 경우
※ 국가연구개발혁신법 시행령 (2022.1.1 시행)에 의해 추후 공개로 전환될
가능성은 있습니다.
과제관리기관과의 협의를 통하여 비공개 기한(3년)이 만료된 보고서를 공개로
전환할 수 있도록 계속적으로 관리되고 있으며, 현재 비공개 처리된 보고서의
열람이 어려운 점 양해 부탁드립니다.
III. 연구개발의 내용 및 범위 ○ Monacolin J 유도체(derivatives) 제조 −Monacolin J과 다양한 종류의 acyl-thioesters를 LovD(acyltransferase)와 반응시켜 다양한 ...
III. 연구개발의 내용 및 범위 ○ Monacolin J 유도체(derivatives) 제조 −Monacolin J과 다양한 종류의 acyl-thioesters를 LovD(acyltransferase)와 반응시켜 다양한 Monacolin J 유도체 제조 —Monacolin J derivatives 제조에 사용할 acyltransferase: Aspergillus terreus 유래 LovD 유전자를 대장균에 발현시켜 대량 분리하여 사용하거나 또는 LovD 유전자를 대장균에 발현시켜 whole-cell biocatalyst로 활용 [Gao et al., Chemistry & Biology, 2009]. —효소전환에 사용한 P450 효소: 미생물 Bacillus megaterium 유래 CYP102A1 및 B. subtilus 유래 CYP102A1와 CYP102A3 유전자를 대장균에 발현시켜 대량 분리하여 사용하거나 또는 이들 P450 유전자를 대장균에 발현시켜 whole-cell biocatalyst로 활용 −가장 안정한 화학결합인 C-H결합을 P450 효소의 산화반응으로 절단하고 반응성이 높은 hydroxyl group(-OH)을 첨가한 대사체를 대량생산함. 이러한 스타틴계 화합물의 대사체로부터 다양한 화학반응을 이용하여 유도체 및 대사체 라이브러리(chemical library)를 제조함 ■ in silico design: Molecular Modelling 및 Docking 방법론 ○ www.rcsb.org에 등록된 X-ray crystal 구조 활용 −X-ray 구조가 밝혀진 bacterial CYP102A1 구조 활용 ○ 특정 ligand/inhibitor에 대하여 charge를 포함한 parameter가 필요한 경우에 는 GAUSSIAN/GAMESS와 같은 quantum mechanics 프로그램을 사용. ○ In silico virtual screening을 위하여 대량의 similar compound를 얻을 필요가 있을 경우에는 database를 이용하여 얻거나 특정회사로부터 구입. ○ Receptor(P450)을 대상으로 docking 모의실험 및 그 결과에 대한 scoring 방법은 다음의 5가지 방법을 통합하거나 선택하여 적용. −Force field-based method : DOCK, GOLD, SIE, LIE. −Knowledge-based approaches : DrugScore, DFIRE, DDFT, PMF, BLEEP, ITScore, M-Score −Empirical scoring functions : X-Score, FlexX Score, VALIDATE, SCORE1 (LUDI), SCORE, Chem-Score, SMoG, GEMDOCK, SODOCK. −The parallel approachs (High-Throughput) : MM-PBSA. −General docking program (Rigid Body/HotPoint/Flexible docking) : Autodock, MCDOCK, SDDOCK, LibDock, FlexDOCK ○ 작성된 ligand(inhibitor)-receptor complex 구조에 대한 minimization, molecular dynamics 및 free energy 모의 실험은 CHARMM/AMBER/GROMOS 등을 이용하여 실행. ○ HMG-CoA reductase 구조 및 docking 모델 활용 −Statin계 고지혈증 치료제들은 HMG-CoA reductase과 특이적으로 결합하여 활성을 저해하는 것으로 알려져있기 때문에 본 연구에서 제조할 statin계 약물후보물질의 in silico design과 molecular docking에 활용 가능함. −그림: HMG-CoA reductase의 active site에 simvastatin/atorvastatin의 결합 상태를 나타내는 3차원 구조 ■ P450 genome library 제조 전략 −대상: Bacillus 유래 P450s 102A1, 102A2, 102A3 −방법: random mutagenesis, combinatorial mutagenesis 및 domain shuffling을 이용하며 여러 round를 통해서 원하는 특성을 갖는 P450 효소 개발 ■ LovD 및 P450 효소의 미생물 발현, 활성 측정기술, HTS system −대장균 및 고초균(Bacillus )에서 발현, 순수분리, 활성측정, 변이체 효소의 활성분석의 기술은 연구책임자가 이미 보유하고 있음. 따라서 P450 효소가 미생물에 발현되었을 때 필요한 효소 분석 기술이 확보된 상태이므로 쉽게 P450 유전자 확보 기술 및 HTS system을 활용한 초고속 탐색 기술 확립이 가능함. −대장균 시스템 및 고초균 고발현 시스템들은 총단백질 양의 20-50%까지 발현이 가능하고, 발현유도체가 불필요하며, 성장휴지기에서 고발현되므로 발현하기 어려운 단백질의 고발현에도 사용할 수 있고 발효 최적화를 통해 손쉽고 값싸게 탐색된 효소의 생산이 가능함. −효소의 발현 및 HTS system 접근 전략 ■ 고지혈증 치료 효과 검증: HMG-CoA reductase 활성 저해효과 측정 −실험 방법 (Procedure) HMG-CoA Reductase (HMGR) 활성저해효과를 실험함. HMG-CoA Reductase가 NADPH를 소모하는 것으로 활성을 측정 가능함. 1 ml sample 또는 0.25 ml에서 assay를 수행.
Abstract ▼
1. Generation of engineered enzyme with human P450 enzymes Recently, the Food and Drug Administration (FDA) modified its standa...
1. Generation of engineered enzyme with human P450 enzymes Recently, the Food and Drug Administration (FDA) modified its standards for evaluating drug toxicity, particularly with regard to the toxicity of drug metabolites. In February 2008, the FDA issued the Guidance for Industry:Safety Testing of Drug Metabolites. According to this guidance, any human drug metabolites“. formed at greater than 10 percent of parent drug systemic exposure at steady state” should be subject to separate safety testing, that is, by synthesis and administration to test animals The issue of human metabolites in safety testing (MIST) has presented a challenge at the early stages of drug development for the pharmaceutical industry. Some metabolites of concern can be prepared by chemical methods, but the others may not be easily prepared by the chemical methods. In the later cases, human liver microsomes, heterologously expressed human enzymes in bacteria, and purified human enzymes might be good candidates for biocatalysts to prepare human drug metabolites. However, they have several weaknesses such as low catalytic activisity and low stability for the industrial use to prepare the metabolites. Bacterial P450 BM3 mutants can be used to produce the metabolites of human P450-catalyzed reactions. We found other advantages of using mutants of P450 BM3 (CYP102A1) from Bacillusmegaterium insteadofhumanP450enzymes. Goal of our research is "Development of Drug Leads for Hyperlipidemia from Statin Derivatives using Engineered bacterial cytochrome P450 (P450 or CYP) enzymes." To achieve the goal, the following specific aims will be performed: molecular evolution of bacterial P450 enzyme genomics, development of HTS system for P450 activities and expression, generation of engineered enzymes, whole-cell biocatalysts, design and generation of human drug metabolites and their derivatives. To achieve the specific aims, molecular evolution of bacterial P450 genomics and developments of HTS systems for P450 expression, catalytic activities, and ligand binding are essential. 2. Generation of statin metabolites and their derivatives by bacterial P450 enzymes and other enzymes for enzymatic modification In this study we are trying to generation of human metabolites of statin drugs at first and then will try to make several derivatives of those statin metabolites. The target for our study includes Monacolin J, atorvastatin, simvastatin, fluvastatin and lovastatin. Production of derivatives of the statins metabolites will result in generation of chemical library of statin derivatives. Using HTS system for the evaluation of statin chemicals on the inhibitory effect on the HMG CoA reductase activity. 3. Evaluation system by in vitro and in vivo assays With statin derivatives inhibitory effect of statin derivatives on the HMG-CoA reductase will be examined. If the statin derivative shows inhibitory effect on that enzyme activity, this can be a candidate for the hyperlipidemia. For those with in vitro activity, in vivo experiments with animal model will be done. 4. Systems to use drug metabolites for the drug and lead diversification To set up a general system for the drug and lead diversification with human statin metabolites, analysis and separation of metabolites of drugs and lead compounds should be performed. For the generation and analysis of combinational chemical library, statin drugs such as Monacolin J, atorvastatin, simvastatin, fluvastatin and lovastatin will be used. For the analysis of metabolite derivatives, mass production and separation of drug metabolites and lead compounds are required. For this specific aim, engineering bacterial P450 enzymes will be develped by using directed evolution and computational modeling.
![Figure. Isolated chromosomal DNA from E.coli BL21(DE3) [A], PCR product of bioH [B], and bioH in pET28a(+) vector](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_43_image_1.jpg "Figure. Isolated chromosomal DNA from E.coli BL21(DE3) [A], PCR product of bioH [B], and bioH in pET28a(+) vector")
![Figure. Isolated chromosomal DNA from A. terreus [A], PCR product of LovD [B], and LovD in pCW vector](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_48_image_8.jpg "Figure. Isolated chromosomal DNA from A. terreus [A], PCR product of LovD [B], and LovD in pCW vector")
![Figure. Transacylation activity of LovD with bytyryl-CoA at 320 nm [A], butyryl-CoA at 238 nm [B], acetoacetyl-CoA at 320 nm [C], and acetoacetyl-CoA at 238 nm [D]](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_49_image_10.jpg "Figure. Transacylation activity of LovD with bytyryl-CoA at 320 nm [A], butyryl-CoA at 238 nm [B], acetoacetyl-CoA at 320 nm [C], and acetoacetyl-CoA at 238 nm [D]")
![Figure. HPLC chromatograms of atorvastatin metabolites by CYP3A4 [A], CYP102A1 BM3 M#16 [B], BM3 M#17 [C], and BM3 M#16V2 [D]](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_51_image_12.jpg "Figure. HPLC chromatograms of atorvastatin metabolites by CYP3A4 [A], CYP102A1 BM3 M#16 [B], BM3 M#17 [C], and BM3 M#16V2 [D]")
![Figure. LC-MS profile of atorvastatin metabolites by human CYP3A4 [A] and CYP102A1 BM3 M#16V2 [B]](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_52_image_13.jpg "Figure. LC-MS profile of atorvastatin metabolites by human CYP3A4 [A] and CYP102A1 BM3 M#16V2 [B]")
![Fig 11. HPLC chromatograms of Monacolin J metabolites by CYP102A1 M16V3 [A], BM3 mutant A1 [B], B1 [C], and BM3 B4 [D]](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_61_image_26.jpg "Fig 11. HPLC chromatograms of Monacolin J metabolites by CYP102A1 M16V3 [A], BM3 mutant A1 [B], B1 [C], and BM3 B4 [D]")
![Fig 12. LC-MS profile of Monacolin J metabolites by CYP102A1 M16V3 [A] and CYP102A1 chimeric mutant B4 [B]](https://nrms.kisti.re.kr/bitextimages/TRKO201300014350/TRKO201300014350_62_image_27.jpg "Fig 12. LC-MS profile of Monacolin J metabolites by CYP102A1 M16V3 [A] and CYP102A1 chimeric mutant B4 [B]")
