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핵심기술
본사에서 개발한 마우스 유래의 바이러스억제물질인 VSF (virus suppressing factor)를 인체에서 바이러스질환 치료제로 개발하기 위하여, 인간항체화한 VSF (HzVSF; Humanized VSF)로 제작하는 것임
최종목표 세포수용체를 활성화하는 새로운 항바이러스제를 위한 인간항체화한(인간화) VSF 개발
개발내용 및 결과
○ 인간화 VSF 개발
- 원천물질인 마우스 VSF인 mVSF(항바이러스능 1 unit이 90ng)의 CDRs은 그대로 유지하면서 FRs을 사람의 것으로 교체하

핵심기술
본사에서 개발한 마우스 유래의 바이러스억제물질인 VSF (virus suppressing factor)를 인체에서 바이러스질환 치료제로 개발하기 위하여, 인간항체화한 VSF (HzVSF; Humanized VSF)로 제작하는 것임
최종목표 세포수용체를 활성화하는 새로운 항바이러스제를 위한 인간항체화한(인간화) VSF 개발
개발내용 및 결과
○ 인간화 VSF 개발
- 원천물질인 마우스 VSF인 mVSF(항바이러스능 1 unit이 90ng)의 CDRs은 그대로 유지하면서 FRs을 사람의 것으로 교체하여, mVSF 항바이러스능의 1/3에 근접하게 바이러스억제효과를 나타내는 HzVSF(1unti이 250ng)를 제작하였음
- HzVSF의 면역원성을 LONZA에서 실시하고 있는 EpibaseTM immunoprofiling을 사용하여 분석한 결과, HzVSF wild type (52 count)은 현재 전 세계적으로 시판되고 있는 humanized Ab 형태의 Herceptin (64count) 또는 chimeric Ab 형태의 Remicade (115 count) 등 대부분의 시판 항체 신약보다 면역원으로 작용할 가능성이 낮은 것으로 분석되었음
- 바이러스가 감염된 표적세포이외의 비-표적 세포나 조직에 대한 HzVSF의 결합여부를 규명하기 위해 사람 주요 장기에서의 교차반응성을 조사한 결과, 사람의 간을 포함한 생체의 정상조직에 VSF가 결합하는 조직은 면역조직화 학염색에서 없는 것으로 나타났음
○ 인간화 VSF의 발현 vector 제작
- 발현 벡터는 pdCMV-dhfr vector로써, 두 가지 종류의 유전자를 하나의 vector 내에서 서로 다른 transcription unit으로 구성하여 각각 자체의 프로 모터와 polyA signal을 사용하여 발현하는 것으로, 강력한 mammalian expression promotor인 cytomegalovirus (CMV) 프로모터를 사용함
○ 인간화 VSF 발현 세포주 개발
- HzVSF wild type 발현을 위하여 HEK293T (Human Embryonic Kidney Cell-line 293T) mammalian cell에 PEI reagent를 사용하여 transfection 하였으며 transfection efficiency는 80% 이상임
○ 배양공정개발
- HEK293T mammalian cell 전용 무혈청 배지인 Pro293a-cdm 배지와 2% FBS/DMEM 배지의 생산량을 비교 실험한 결과, 2%FBS/DMEM 배지가 발현량도 1.6배 많고 정제 후 회수율도 97%로 Pro293a-cdm 배지 보다 높았음
- 또한 2%FBS/DMEM은 항바이러스 활성 1unit이 0.5ug으로 Pro293a-cdm 배지의 1ug보다 1/2 적은 양으로도 같은 활성을 나타내는 것으로 나타났음
○ 정제공정개발
- HzVSF 정제를 위한 초기 공정으로 capture 단계는 centrifugation과 filtration을 실시하며, intermediate purification은 Protein A affinity chromatography를 하는 것으로 순도 98%로 확립하였음
○ VSF의 HBV에 대한 항바이러스 활성 확인
- HBsAg을 분비하는 HepG.2.2.15 cell에 VSF를 처리하고 HBsAg ELISA Kit를 사용하여 HBsAg을 정량한 결과, VSF를 1,000unit 처리한 실험군에서는 대조군에 비하여 HBsAg의 증식이 40% 정도 억제되는 것으로 나타났음
○ VSF의 HCV에 대한 항바이러스 활성 확인
- HCVcc (in vitro HCV cell-culture system) 감염모델을 이용하여 HCV RNA 및 HCVcore 단백 발현의 억제를 조사한 결과, VSF를 1,000unit 처리한 실험군에서는 대조군과 대비하여 HCV RNA와 HCVcore 단백이 10~20% 정도억제되는 것으로 나타났음
기술개발배경
○ 미충족 의료수요
- 바이러스에 직접 작용하여 증식을 억제하는 항바이러스제는, 특히 만성질환 치료에서 장기간 투여시에는 필연적으로 내성이 증가해 지속적인 개발이 필요하나, 바이러스는 생명체로서 적응하기 위해 계속 내성바이러스가 생길 것임
- 인터페론은 세포에 작용하여 바이러스 증식을 억제하고 병용하는 화학제(증식억제제)에 대한 내성을 억제하나, 면역병리현상과 세포독성을 촉진시킴
- 아직까지 바이러스 감염세포에 작용하여 바이러스증식억제를 유도하면서 감염된 세포를 보호하고 염증을 억제하는 항바이러스제에 대한 연구는 없음
○ 미래 항바이러스제의 가능한 예
- 바이러스에 감염되어 생체내에서 분비되는 인터페론은 세포를 항바이러스 상태로 만들어 바이러스의 증식을 막지만, 일단 세포에 바이러스 단백질이 생성되면 면역세포들의 침윤을 유도하여 감염세포를 죽이거나 손상을 일으키는 부작용(간염, 뇌염, 심각한 인플루엔자 등)인 면역병리현상(immunopathologic phenomena)을 동반하는 문제가 있음
- 건강한 사람에 대한 바이러스의 감염은 과도한 면역활성에 의한 부작용이 거의 없이 자연치유가 이루어지며, 이는 세포매개성 면역반응을 유도하여 감염된 세포의 파괴를 수반하는 T 세포의 작용(adaptive immunity) 외에 선천면역(innate immunity)과 연계한 새로운 개념의 세포내 항바이러스 신호전달기작의 가능성을 제시함
- 따라서 기존 항바이러스제의 부작용과 내성 등의 문제를 극복하고 다양한바이러스의 감염에 대하여 작용하는 항바이러스 체계에 대한 이해와 이를 이용한 바이러스 질환 치료제의 개발이 절실히 필요한 시점임
- 최근에는, 선천면역과 관련된 Tol-like receptor(TLR)를 매개로하는 신호가 바이러스의 감염을 조절하는 감염세포내 유전자의 발현을 조절한다는 연구가 활발히 진행되어지고 있음
- 따라서, 사이토카인이나 항체 같은 생체유래 내재성 물질을 이용한 항바이러스 치료제의 개발에 대한 관심이 높아지고 있으며, 특히 세포수용체에 반응하는 인간화 항체는 특이성이 높고 부작용이 적을 뿐 아니라 반감기가 길어 효과적인 치료제로 작용할 수 있음
핵심개발기술의 의의
○ 바이러스 감염에서 나타나는 과잉 면역반응인 염증의 치료를 위한 후보물질 제공
- 다양한 바이러스 질환에서 바이러스자체에 의한 조직손상보다 면역세포의 과잉 활성화에 따른 부작용(면역병리현상)에 의해 중증질환으로 악화되어 가끔 사망하게 됨
- 본사에서 개발하고 있는 인간화 바이러스억제물질(humanized VSF; HzVSF)은 뇌심근염바이러스 뿐만 아니라 마우스간염바이러스(mouse hepatitis virus; MHV) 등에서도 바이러스 증식을 억제하고 바이러스 감염에 의한 면역부작용인 면역병리현상을 억제하여 염증을 감소시켜서 증상의 발현을 억제함으로써 증상완화를 통한 치료를 유도함이 확인됨(예비실험)
- 이는 VSF 수용체(VSF receptor)인 VR의 신호전달을 통해 유도됨이 확인되었음
- 본사는 세포의 VR에 작용하며 항바이러스 및 항염증 효과를 나타내는 HzVSF를 제작하였고, 향후 이를 이용하여 바이러스질환 치료제(특히 C형 및 B형간염)로 개발할 예정임
적용분야
○ 향후 사람에서 면역원성은 거의 없고 효과는 높은 완전히 최적화된 HzVSF를 제작할 것임
○ 또한 세포수용체의 특성을 규명하고 바이러스 증식 및 병리억제의 세포내 신호전달 기작을 조사하여 다양한 바이러스성 감염에 대해 공통적으로 작용하는 생체의 항바이러스 작용의 작동원리를 규명할 것임
○ 이러한 결과를 이용하여 HzVSF에 대해 전임상 및 임상시험을 수행하여 성공한다면 바이러스질환 치료의 blockbuster급 신약이 될 것임

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 지역산업기술개발사업 보고서 초록 ... 2
• 연구개발사업 주요 연구성과 ... 12
• 목 차 ... 15
• 제 1 장 서론 ... 16
• 제 1 절 개발기술의 중요성 및 필요성 ... 16
• 제 2 절 국내 ․ 외 관련 기술의 현황 ... 19
• 제 3 절 기술개발 시 예상되는 기술적 ․ 경제적 파급 효과 ... 26
• 제 2 장 기술개발 내용 및 방법 ... 28
• 제 1 절 최종 목표 및 평가 방법 ... 28
• 제 2 절 단계 목표 및 평가 방법 ... 29
• 제 3 장 결과 및 사업화 계획 ... 78
• 제 1 절 연구개발 최종 결과 ... 78
• 1. 연구개발 추진 일정 ... 78
• 2. 연구개발 추진 실적 ... 78
• 제 2 절 연구개발 추진 체계 ... 129
• 1. 주관기관 ... 129
• 2. 위탁기관 ... 130
• 제 3 절 시장 현황 및 사업화 전망 ... 130
• 최종보고서 요약서 ... 135