초록 ▼

□ 과제명 : A형 간염 및 로타바이러스 질병 예방용 식용 백신 작물 개발
▶ 연구목적 :
○ 제1 세부과제
로타바이러스 예방성 작물 개발을 위하여 알팔파 및 벼에서 발현할 수 있는 유전자 발현 시스템의 구축하고 형질전환체를 선발 및 백신 유전자의 발현 분석 연구를 수행하여 로타바이러스 예방성 작물을 개발하고자 하는데 있다.
○ 제2 세부과제
차세대 백신기술로서 하나의 백신에 여러종류의 항원을 포함하고 있는 다가백신 유전자시스템을 개발하고 그 가능성을 제시하기 위하여, 본과제에서는 A형간염과 로타바이러스항

□ 과제명 : A형 간염 및 로타바이러스 질병 예방용 식용 백신 작물 개발
▶ 연구목적 :
○ 제1 세부과제
로타바이러스 예방성 작물 개발을 위하여 알팔파 및 벼에서 발현할 수 있는 유전자 발현 시스템의 구축하고 형질전환체를 선발 및 백신 유전자의 발현 분석 연구를 수행하여 로타바이러스 예방성 작물을 개발하고자 하는데 있다.
○ 제2 세부과제
차세대 백신기술로서 하나의 백신에 여러종류의 항원을 포함하고 있는 다가백신 유전자시스템을 개발하고 그 가능성을 제시하기 위하여, 본과제에서는 A형간염과 로타바이러스항원을 동시에 발현하는 시스템을 개발하는데 있다.
○ 제3 세부과제
A형 간염 예방성 원예작물 개발”과 관련 하여 A형 간염 백신 유전자 발현 시스템의 구축 및 최적화, 원예작물의 형질전환 연구, 형질전환체의 선발 및 백신 유전자의 발현 분석 연구를 수행하여 A형 간염 예방성 원예작물을 개발하고자 하는데 있다.
○ 제4 세부과제
형질전환 식물의 면역원성을 검정하고, 백신을 구강투여시 면역력을 증강시키는 천연물 질을 선발하는데 있다.
▶ 주요연구내용 :
○ 로타바이러스 질병 예방성 식량작물 개발연구
- 로타바이러스 항원 단백질로 알려진 피막단백질(RV-VP7)을 암호화하는 유전자는 제 1 혐동연구과제 책임자인 중앙대학교 김원용 박사로부터 분양받아서 알팔파와 벼 형질전환 운반체를 제작하여 과제를 수행하였다. 알팔파 형질전환을 위하여는 전신발현을 유도하는 35S 프로모터를 이용하였으며 선발마커로 basta 저항성 유전(bar)를 이용하였다. 형질전환된 알팔파를 bar-strip test로 100개체를 선발하였고, 2차로 genomic PCR을 수행하여 항원유전자가 삽입된 형질전환 알팔파 93개체를 확인 및 선발하였다. 유전자삽입이 확인된 개체에 대하여 ELISA검정을 통하여 항원단백질 발현 개체를 1차 선발한 후, Western blot 분석으로 다량 발현하는 9개체를 선발하여 증식하였으며, 항원단백질을 다량(0.3%) 발현하는 알팔파 형질전환계통을 선발하였고, 또한 실험동물을 이용한 항체 형성검정에서도 IgA와 IgG가 생성됨을 확인하였다.
- 벼 형질전환을 위해서는 벼 종실특이발현을 유도하는 glutelin 프로모터를 이용하고, 1년차에서는 무선발마커 운반체를 제작하여 이용하였으나 형질전환체 선발에 많은 어려움이 있어서 2년차에는 bar 선발마커가 있는 운반체를 제작하여 이용하였으며 로타바이러스 백신 유전자 외에 경희대 정인식 박사로부터 A형간염 백신유전자(HAV-VP1)를 분양받아서 운반체를 제작하여 벼 형질전환에 이용하였다. RV-VP7 형질전환 T2 종자 11계통과 HAV-VP1 형질전환 T2 종자 7계통을 각각 확보하여, Western blot 분석으로 로타바이러스 항원단백질과 A형간염 항원단백질이 발현되고 있음을 확인하였다. 한편 flanking sequence 분석으로 전환유전자가 intergenic한 곳에 RV-VP7 유전자가 삽입된 벼 2계통, HAV-VP1 유전자가 삽입된 1계통을 각각 선발 하였다. 또한 계속적으로 형질전환하여 T0 형질전환체가 RV-VP7는 10개체, HAV-VP1은 15개체를 선발하였으며 T1종실을 확보할 것이다.
○ 백신유전자 시스템 개발 및 기능분석
- 최근에는 미래의 백신시스템으로서 하나의 백신에 여러종류의 항원을 포함하고 있는 다가백신 개발에 관심을 보이고 있다. 본 연구에서도 A형간염과 로타바이러스 항원을 동시에 발현하는 시템을 개발하여 전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 virus-like particle을 확인하였고, 급성장염과 A형간염이 발병되니 환자의 혈청을 이용한 실험에서 A형간염과 로타바이러스에 대하여 항체반응이 나타남을 확인하였다.
- 베큘로 바이러스발현 벡터를 이용한 A형 간염 에피톱 함유 로타바이러스 키메라 바이러스입자(CLP)의 기능 및 면역원성 분석으로 D2/VP7 재조합 복합 항원 단백질은 로타바이러스 Wa주 및 A형 간염바이러스 항원에 대한 로타바이러스의 경우 희석배수 640배, A형 간염바이러스의 경우 희석배수 160배까지 특이적 항체 형성을 유도하였다.
- Western blot 분석은 발현된 2 종의 로타바이러스 및 A형 간염바이러스의 항원 함유 재조합 복합 항원 단백질이 면역원성을 가지는지를 조사하기 위해 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 발현된 2종의 재조합 복합 항원 단백질 모두 로타바이러스 특이 항체에 양성반응을 보였으나 3명의 사람 A형 간염바이러스 항혈청에서는 D2/VP7에서만 양성 반응을 확인하였다.
○ A형간염 예방성 원예작물 개발연구
- A형 간염 백신 유전자 발현 시스템의 구축 및 최적화 연구로 A형 간염 바이러스의 항원 유전자 발현 벡터를 구축하였으며 식물 발현 시스템 최적화를 위한 promoter 검토와 gene targeting sequence로서 secretion, ER retention, chloroplast targeting sequence 를 비교하여 ER retention의 경우 A형 간염 바이러스 항원 단백질의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 또한 백신 유전자 포함 발현 벡터 construct를 함유한 Agrobacterium을 이용하여 형질전환 및 재분화 연구를 수행하여 A형 항원 유전자인 VP1, sVP1과 VP3을 각각 발현하는 형질전환 토마토 식물체를 확보하였다. A형 간염 백신효과 검정을 위해 VP1 단백질을 복강면역하여 특이항체의 생성을 확인하였으며 확보된 형질전환 토마토 식물체의 T1세대와 T2세대의 발현을 분석하여 형질전환체를 선별하고 종자를 확보하였다.
- 당초 연구계획에 포함되지 않았던 내용의 추가 연구로서 형질전환 식물체에서 분리 정제한 백신소재 재조합 단백질 VP1을 이용하여 점막 경로인 intranasal(비강)과 sublingual (설하)경로를 통하여 실험쥐에 면역하였으며 실험군의 혈청에서 특이 IgG 항체가 생성되었고 분변과 vaginal wash에서는 특이 IgA항체가 생성을 확인하였다.었다. 이 결과는 형질전환 식물체에서 발현, 분리 정제한 A형 간염 백신소재 단백질이 비강 및 설하에서 점막면역 반응을 성공적으로 유도하는 것이기 때문에 구강으로 면역 시에 장관 면역도 유도될 수 있다는 것을 의미한다.
○ 백신 생산 작물의 면역원성 검증연구
- 경구용 면역보강제(adjuvant: CT, CTB, LTB, 키틴입자, CpG 등) 및 단백질 면역원(KLH, OVA, OM)의 경구투여시 유도되는 장관 면역활성을 비교함으로써 모델 동물 실험계에 사용하기에 가장 적합한 adjuvant와 모델 면역원로써 CT와 KLH를 각각 선발하였다.
- 천연물 중 경구용 adjuvant를 대체할 수 있는 소재를 in vitro계에서 탐색하여 청국장 추출물을 선발하였으며, 동물실험계에서 그 활성을 조사하였을 때 청국장추출물의 소장 중 IgA항체와 혈중 IgG항체 생산증가, 비장세포 증식효과 및 사이토카인 생산증가를 촉진함으로써 장관면역 유도활성이 매우 양호하여 CT보다 그 활성이 우수함을 밝혔다. 이는 경구 면역용 백신을 사람에 투여할 경우 효과적이고, 안전하고, 저렴하게 그 효능을 극대화할 수 있을 것으로 기대된다.
- 백신 생산작물의 면역원성 검증을 위한 첫 번째 시도로서 HAV VP3형질전환 담배잎 추출물을 생쥐에 경구로 투여한 경우에는, 소장 중 특이 lgA항체 및 전체 IgA항체의 생산이 증가되었고, 비장세포 증식활성이 높고, 사이토카인 IL-4/IFNr의 비율이 높게 나타나 Th2 반응이 증가되는 등 장관면역이 활성화됨을 확인하였다. 따라서, VP3의 형질전환체는 경구용 HAV 백신으로서 성공가능성이 매우 높음을 시사하였다.
- 백신 생산작물의 면역원성 검증을 위한 두 번째 시도로서 Rotavirus VP7 형질전환 알팔파 추출물을 생쥐에 경구로 투여하였을 때, 혈 중 전체 IgG항체 생산이 높았고, 소장 중 특이 lgA항체와 전체 IgA항체 생산도 높게 나타났다. 또한, 처리한 생쥐의 비장세포에 의한 사이토카인 IL-4와 IFNr의 생산이 높게 나타나 Th1과 Th2 반응이 모두 활발하게 유도되는 등 장관면역이 활성화됨을 확인하였다. 따라서, VP7의 형질전환체는 경구용 로타바이러스 백신으로서 성공가능성이 매우 높음을 시사하였다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results
For the purpose to develop a vaccine gene system using rotavirus VP7, VP2 and P1 genes (VP1, D2, D3, D4) coding structural proteins of Korean type hepatitis A virus, a complex vaccine system simultaneously expressing rotavirus and hepatitis A virus antigen proteins is constructed. Also

Ⅳ. Results
For the purpose to develop a vaccine gene system using rotavirus VP7, VP2 and P1 genes (VP1, D2, D3, D4) coding structural proteins of Korean type hepatitis A virus, a complex vaccine system simultaneously expressing rotavirus and hepatitis A virus antigen proteins is constructed. Also, hepatitis A virus epitope is cloned to develop a CVP (Chimeric Virus-like Particles) expression system and recombinant baculovirus is selected. The activity of recombinant baculovirus and its expression condition are optimized by in vitro folding. The analysis of function and immunogenicity of rotavirus CVP containing hepatitis A virus epitope indicates that recombinant D2/VP7 complex antigenic proteins induce the formation of antibodies. In the case of rotavirus against rotavirus Wa or hepatitis A virus antigen), recombinant D2/VP7 complex antigenic proteins induce the formation of antibodies up to a dilution factor 640. In the case of hepatitis A virus, recombinant D2/VP7 complex antigenic proteins induce the formation of antibodies up to a dilution factor 160. In Western blot analysis to determine whether recombinant complex antigenic proteins containing both rotavirus and hepatitis A virus antigens have an immunogenicity, recombinant complex antigenic proteins show positive signals against rotavirus-specific antibody. In the reaction between anti-sera and recombinant D2/VP7 complex antigenic proteins, the appearance of cytopathic effects is significantly reduced compared to positive control, indicating that anti-sera contains neutralizing activity to suppress both viruses. The formation of rotavirus VP (Virus-like Particle) containing recombinant D2/VP7 complex antigenic proteins is confirmed by structural analysis of CVP using immunoelectron microscopy.
The antigen gene expression vectors harboring hepatitis A virus antigenic genes (VP1, sVP1, and VP3) are constructed. Transgenic tomato plants expressing hepatitis A virus antigens are obtained by Agrobacterium-mediated transformation and regeneration. The production of specific antibodies is confirmed in mice that are administrated with plant-derived VP1 protein via intra-peritoneal route for hepatitis A virus vaccine efficiency test. T1 and T2 transgenic plants are selected by analyzing the expression of vaccine genes and the seeds are obtained from transgenic plants. Also, recombinant VP1 vaccine materials purified from transgenic plants are administrated through intranasal and sublingual routes. The production of specific IgG antibodies is confirmed from sera. The production of specific IgA antibodies is also confirmed from feces and vaginal washes. Because hepatitis A virus vaccine materials being expressed and purified from transgenic plants successfully induce a mucosal immunity at intranasal and sublingual sites, these imply that oral immunization of hepatitis A virus vaccine materials can induce a gut immunity. Also, oral immunization of transgenic tobacco leaf extracts expressing hepatitis A virus VP3 protein increases the production of specific IgA antibodies in small intestine and overall IgA antibodies. Vaccination with transgenic tobacco leaf extracts expressing hepatitis A virus VP3 protein increases the proliferation of splenocytes and the expression ratio of IL-4 and IFN-γ, indicating that transgenic tobacco leaf extracts expressing hepatitis A virus VP3 protein induce a Th2 immune response and activate a gut immunity. Therefore, these suggest that VP3 transgenic plants have a high potential as an oral hepatitis A virus vaccine.
An expression vector is constructed to transform RV-VP7 gene coding rotavirus antigenic protein VP7 into alfalfa plant. The expression vector for constructing transgenic alfalfa contains a 35S promoter and a basta-resistant gene (bar) as a selection marker. One hundreds of putative transgenic alfalfa are selected by a bar-strip test. Ninety three of transgenic alfalfa are selected in second screening using genomic PCR. Nine transgenic alfalfa expressing antigen proteins are selected by ELISA and Western blot analysis. A transgenic alfalfa line expressing a high content of antigen protein (0.3%) is finally selected. The production of specific IgG and IgA antibodies is confirmed by mice experiment. Oral administration of transgenic alfalfa extracts expressing rotavirus VP7 increases the production of IgG antibodies in serum, and the production of specific IgA and overall IgA antibodies in small intestine. The content of cytokine IL-4 and IFN-γ is higher in the splenocytes of transgenic alfalfa extract-administered mice, indicating that transgenic alfalfa extracts induce Th1 and Th2 immune responses and activate a gut immunity. Meanwhile, an expression vector in which RV-VP7 gene coding rotavirus antigen protein and hepatitis A virus VP1 gene are under control of glutelin promoter is constructed to generate a transgenic rice. Eleven lines of T2 seeds for RV-VP7 and seven lines of T2 seeds for hepatitis A virus VP1 are obtained, and the expressions of RV-VP7 and hepatitis A virus VP1 are confirmed by Western blot analysis. Two transgenic rice lines having an intergenic insertion of RV-VP7 gene are selected by flanking sequence analysis. And one transgenic rice line having an intergenic insertion of hepatitis A virus VP1 gene is selected. Additionally, ten lines of T0 transgenic rice for RV-VP7 and fifteen lines of T0 transgenic rice for hepatitis A virus VP1 are selected, and T1 seeds from those transgenic rice will be obtained.
CT and KLH are selected for an ideal adjuvant and immunogen, respectively, from the analysis of gut immune activities induced by oral administration of oral adjuvants (CT, CTB, LTB, chitin particle, CpG, etc) and protein antigens (KLH, OVA, OM). A study was made to screen natural compounds that can replace oral adjuvants. In animal experiments, cheonggukjang (fast-fermented bean paste) extract increases the production of IgA antibodies in small intestine and IgG in sera. This extract also stimulates the proliferation of splenocytes and the production of cytokines. The cheonggukjang extract is favorable for inducing gut immunity and its activity is higher than that induced by CT.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 5
• 제1장 서 론 ... 9
• 제1절 연구개발의 목적 및 성격 ... 9
• 제2절 연구개발의 필요성 ... 9
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 11
• 제1절 연구개발대상 기술의 경제적 • 산업적 중요성 ... 11
• 제2절 국외 연구현황 ... 12
• 제3절 국내 연구현황 ... 12
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 14
• 제 1 절 백신유전자 시스템 개발 및 기능분석 ... 14
• 제 2 절 A형간염 예방성 원예작물 개발연구 ... 31
• 제 3 절 로타바이러스 질병 예방성 식량작물 개발연구 ... 58
• 제 4 절 천연소재로부터 면역보조제 선발연구 ... 81
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 97
• 제1절 목표대비 달성도 ... 97
• 제2절 정량적 성과 ... 97
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 100
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 101
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 101
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 101
• 제 9 장 참고문헌 ... 101
• <참고 1> 연차평가 지적사항 및 조치결과 ... 105
• <참고 2> 주요연구 성과 ... 106
• 주요 결과 요약서 ... 107