초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
□ 제 1세부과제
○ hG-CSF를 유즙으로 분비하는 형질전환돼지 생산
- mWAP 프로모터를 이용한 2개인 insulator를 붙인 발현 벡터 사용
- 수정란 전핵 내 미세주입에 의한 방법으로 hG-CSF 형질전환돼지 생산(논문투고)
○ 기 생산 보유 형질전환돼지의 산업적 활용 가능성 타진
- 형질전환돼지 유래 장기 세포를 이용한 바이오시밀러 가능성 시사(논문작성)
○ 기 생산 보유 형질전환돼지 생식세포 발달 관련 단백질 및 세포 사 확인(국외논문게재)
□ 제 2세부과제

Ⅳ. 연구개발결과
□ 제 1세부과제
○ hG-CSF를 유즙으로 분비하는 형질전환돼지 생산
- mWAP 프로모터를 이용한 2개인 insulator를 붙인 발현 벡터 사용
- 수정란 전핵 내 미세주입에 의한 방법으로 hG-CSF 형질전환돼지 생산(논문투고)
○ 기 생산 보유 형질전환돼지의 산업적 활용 가능성 타진
- 형질전환돼지 유래 장기 세포를 이용한 바이오시밀러 가능성 시사(논문작성)
○ 기 생산 보유 형질전환돼지 생식세포 발달 관련 단백질 및 세포 사 확인(국외논문게재)
□ 제 2세부과제
○ hG-CSF 정제를 위한 결합 특이적 단 크론 항체 생산
- 분리 정제된 단 크론 항체를 이용하여 배양 세포에서 hG-CSF 검출 확인
○ 유선 유래 재조합체 분리 정제
- 당 단백질 분리에 이용되는 2가 이온을 사용 분리하는 방법(CaCl2, ZnCl2)으로 농도별 유즙 내 재조합 단백질의 침전도 확인
○ 조직 특이적 발현벡터 설계 및 구축
- 유선 특이적 단백질의 유전자로부터 프로모터 부위와 3‘-UTR 부위를 크로닝하여삽입된 유전자 위치에서 다른 유전자들의 영향을 받지 않고 유전자의 발현이 쉽게 일어날 수 있게 도와주는 유전자의 조절 인자에 insulator를 프로모터 영역 앞에 넣는 발현 벡터를 구축
- 구축된 벡터들이 유선 유래의 세포에서 호르몬 자극에 의해 발현 유도가 일어나는지 확인하고자 유선 유래 (Mouse HC11, Human breast cancer MCF7)세포에 발현 벡터를 transfection시켜 lactation 호르몬을 첨가 배양하여 세포 밖으로 분비되는 양을 ELISA방법으로 분석한 결과, 호르몬 자극을 받지 않은 세포에 비하여 단백질 발현량이 높게 나타났음. 이렇게 확인된 벡터는 형질전환돼지 생산에 이용하기 위하여 미세주입 형태로 제작하여 형질전환동물 생산 과제로 넘김.
□ 제 3세부과제
○ 세포 수준에서 pWAP-G-CSF 발현벡터의 발현 검증
- 구축한 pWAP/hG-CSF 벡터가 포유류 유선 조직유래의 세포들에서 정상적으로 작동하여 단백질을 발현하는 능력이 있는지 여부를 확인하고자 생쥐 유선상피세포(HC11) 또는 사람의 유방암세포에 기 구축하여 보유중인 pWAP/hG-CSF 벡터를 transfection하고 사람의 G-CSF 단백질 발현을 확인을 통하여 pWAP 프로모터 능력을 확인한다. 프로모터의 능력은 pWAP/hG-CSF 벡터를 transfection한 세포들에서 hG-CSF 단백질의 발현을 ELISA 방법으로 확인.
○ 생쥐에서 pWAP/hG-CSF 발현벡터의 발현 검증
- 구축한 pWAP/hG-CSF 벡터가 세포수준(in vitro)이 아닌 실제 포유류인 생쥐의 유선조직에서도 정상적으로 작동하여 목적 단백질을 발현하는 능력이 있는지 여부를 확인하고자, 형질전환 생쥐를 생산하고 이들 중 암컷의 유선조직 또는 젖에서 목적단백질(hG-CSF) 발현을 ELISA 방법으로 확인.
○ 돼지 WAP 프로모터 영역 클로닝
- pWAP 유전자에 있는 제한효소로 BAC DNA를 절단하고 전기영동을 통하여 각 크기별로 분리하였다. UV광선 아래에서 BAC DNA가 절단되어진 것을 확인하고 니트로셀룰로오스 막에 DNA를 옮겨 DIG로 표지한 DNA탐침(probe)으로 Southern Blot 방법을 이용하여 우리가 원하는 유전자의 유무를 확인

Abstract ▼

1. Production of G-CSF transgenic pig
We have developed wildtype G-CSF transgenic pig by microinjection on one-cell stage of in vivo fertilized oocytes. Protein medicine like EPO, G-CSF and GM-CSF would be a new choice of bio-similar to reduce cost of cancer therapy. One-cell stage embryos were p

1. Production of G-CSF transgenic pig
We have developed wildtype G-CSF transgenic pig by microinjection on one-cell stage of in vivo fertilized oocytes. Protein medicine like EPO, G-CSF and GM-CSF would be a new choice of bio-similar to reduce cost of cancer therapy. One-cell stage embryos were prepared by superovulation treatment and natural mating was used to fertilized ovulated oocytes. After the surgical procedures of oocyte recovery, one-cell stage embryos were collected for microinjection. Approximately, 25 embryos were implanted into 21 surrogate mothers. G-CSF production vector containing the insulator, the mWAP promoter and bovine growth hormone poly A-containing sequences was used for transgenic microinjection.
2. Proliferation rate of hEPO transgenic and Wildtype pig cells
The survival and proliferation of the hEPO transgenic(TG) pig cells are examined. The TG and wildtype(WT) cells were selected into 100mm dish at a concentration of 2 x 105. After incubation for 5 days, cells proliferation was analyzed. Proliferation of TG cells was generally decreased than WT cells.
Especially, mammary gland cells of TG pigs were significantly decreased. But the proliferation of TG kidney cells was similar to WT kidney cells.
3. Expression of hEPO mRNA in primary cell of TG and WT pig The expression of hEPO in primary cells of TG(hEPO-lactation) was confirmed by RT-PCR. The expression of hEPO mRNA was detected hEPO TG primary cells derived from the mammary gland, kidney, lung, heart and spleen. However, the primary cells of WT were not detected.
4. Apoptotic analysis in primary cells of TG and WT pig
To identity of cell viability, the primary cells of the TG and WT pigs were analyzed for Annexin V and PI staining. The rate of death cells in TG pig was less than 4%. Whereas, rate of apoptotic cell was less than 4% in mammary cell and kidney cell of TG and WT pigs. Spleen and lung cells of TG and WT pigs were less than 29%. Therefore, apoptotic analysis was not significantly different in cell of the TG pig compared to WT pig.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 5
• 목 차 ... 6
• 제 1 장 서 론 ... 7
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 8
• 가. 유전자 변형동물 생산 기술 ... 8
• 나. 유전자 변형동물의 개발현황 ... 9
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 11
• 제 4 장 연구개발 목표 달성도 및 대외 기여도 ... 65
• 1절 목표대비 달성도 ... 65
• 2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타) ... 66
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 71
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 71
• 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 71
• 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 72
• 제 9 장 참고문헌 ... 73
• 끝페이지 ... 79