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Kafe 바로가기주관연구기관 | 국립농업과학원 National Institute of Agricultural Sciences |
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 | 한국어 |
발행년월 | 2014-02 |
과제시작연도 | 2013 |
주관부처 | 농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 | TRKO201400011437 |
과제고유번호 | 1395030304 |
사업명 | 친환경안전농축산물생산기술 |
DB 구축일자 | 2014-07-05 |
Ⅳ. 연구개발결과
Bacillus valismortis EXTN-1 생산 CLP(cyclic lipopeptide)는 식물면역 활성 을 일으키며 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotricum acutatum 균에 항균활성이 우수하며 선발된 다이펩타이드 중 Q3는 농작물에 안정적인 생육촉진과 병해방제효과를 나타낸다.
선발 펩타이드는 고추, 배추, 담배, 마늘, 파프리카, 감자에서 면역 활성이 확인 되었으며 사과에 처리 시에는 포리페놀 함량증가에 따른 과실의 품질향샹에
Ⅳ. 연구개발결과
Bacillus valismortis EXTN-1 생산 CLP(cyclic lipopeptide)는 식물면역 활성 을 일으키며 Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotricum acutatum 균에 항균활성이 우수하며 선발된 다이펩타이드 중 Q3는 농작물에 안정적인 생육촉진과 병해방제효과를 나타낸다.
선발 펩타이드는 고추, 배추, 담배, 마늘, 파프리카, 감자에서 면역 활성이 확인 되었으며 사과에 처리 시에는 포리페놀 함량증가에 따른 과실의 품질향샹에 유리하였다. 또한 다이펩타이드 Q3 및 ASP binding 펩타이드는 무름병 및 고추역병에 대한 유도저항성 증강 능력이 우수하였다. ASP binding펩타이드는 NH2의 결합에 따라 생리활성을 달리하며 ASP binding 펩타이드 처리에 의한 내한성 증강과 다이펩타이드Q3의 알진염 담체화 처리에 의한 배추 무름병 억제 효과가 우수하였다.
바실러스 발리스모르티스 EXTN-1의 유전자 라이브러리 작성을 위한 항생제 내성검정을 통하여 형질전환을 위한 kanamycin 등 7종 항생제를 선발하였으며 플리스미드pIC333를 선발하였다. EXTN-1 게놈 시퀀스 정보를 토대로 유용유전자 (Lipopeptide)의 기능을 규명한 결과 surfactin, iturin A B, C 등 4종의 유전 정보를 수집하였다.
Bacillus valismortis EXTN-1으로부터 분리한 iturins 유도체 물질들을 유기분광학적 방법(NMR, HRTOFMS)을 활용하여 구조 규명하였으며, 측정값은 이미 알려진 문헌값과 비교하여 잘 일치하였다.
Bacillus valismortis EXTN-1 또는 BS07로부터 iturin 유도체 분리 및 활성검정용으로 제공되었으며 발효액 (20L, 100 L)로부터 iturin 유도체를 각각 분리하여 항균활성과 유도저항성 검정용으로 사용하였다. 분리된 물질의 량은 Iturin A2: 134.3 mg, Iturin A3: 22.3 mg, Iturin A4: 37.8 mg, Iturin A5: 1.0 mg, Iturin A6: 1.32 mg, Iturin A7: 1.78 mg Iturin A8: 2.50 mg 으로 유도저항성 및 항균 활성 검정에 사용되었다.
Bacillus B14로 부터 Bacilomycin D 유도체의 분리 및 구조를 규명하였다. 발효액 (20 L)로부터 R. solani에 항균활성을 보이는 물질을 분리하여 2개의 물질은 Bacillomycin D (ai-C-15)의 methyl ester (7.0 mg) 및 Bacillomycin D (i-C-15)의 methyl ester (11 mg)로 규명하였으며 활성을 보이는 다른 2 개의 물질 (34, 13 mg)은 900 MHz NMR (CD3OH)에서도 피크가 겹쳐서 고리의 연결 순서는 명확히 알아내지 못하였으나, 아미노산들(Tyr, Asn1, Asn2, Pro, Glu, Ser, Thr, β-AA)은 Bacillomycin과 동일하였으므로 이 계열의 물질로 파악된다. pyridine-d5와를 비롯한 다른 용매에서 자료를 측정해보아야 할 것으로 판단된다.
EXTN-1 발효액의 CDP와 CLP의 정량분석법 확립 및 정량분석 비교하였다. 발효액을 BuOH로 추출하고, 1 g silica gel 컬럼을 사용하여 cyclic dipeptide와 iturin 유도체들의 정량분석법을 확립하였다. 표준물질의 HPLC 머무름 시간을 기준으로 시료에서 물질의 정체를 파악하였으며, 일부는 LC-MS로 분자량을 확인하여 보완하였다. HPLC는 C18 역상칼럼을 사용하였으며, 피크의 검출은 UV 210 nm를 사용하였다. 분석시간은 약 80분이 소요되었으며, 일부 피크는 적정한 흡수도를 나타냈으나, 일부 피크는 오차가 심한 흡수도 (0.1 이하)를 보였다. 어떤 피크는 겹쳐서 나오므로 C-18 역상칼럼을 다른 종류로 바꾸어서 겹치는 물질들이 분리되게 하여 정성적으로 확인하는 것도 가능하게하는 정성분석법을 확립하였다. Iturin유도체는 CDP와는 다른 분석 조건을 설정하여 주요생성물질 (A2, A3, A4)을 정성하는 데는 큰 문제가 없는 방법을 확립하였다. EXTN-1은 다른 미생물에서도 나오는 전형적인 iturin 유도체의 분포 패턴을 보였으나, BS07에서는 A2가 압도적으로 많이 함유되어 있었다. 정량분석은 표준물질을 사용하여 농도와 피크의 면적값을 활용한 검량곡선을 그려서 사용한 농도 범위에 들어오는 특정피크의 농도를 계산하여, 총 발효액의 양으로 역산하여 총량을 추정하였다. wild type과 mutant type을 비교해보면, CDP의 생산량에는 큰 차이가 보이지 않았지만, mutant type에서 iturin 유도체(아래그림 참조)는 3배 정도 많이 생산되는 것으로 나타났다.
EXTN-1이 생산하는 저분자 펩타이드의 합성 및 대량합성법을 확립하였다. 특허등록된 아래와 같은 방법으로 10 여개는 15 g, 5 개는 40 g 합성하여 유도저항성 검정용 시료로 제공하였다.
Bacillus vallismortis 균을 이용하여 세균병에 대한 활성이 우수한 제품을 개발하고자 Bacillus vallismortis EXTN-1 균 대한 배양조건을 검토하기 위하여 Flask 배양시험으로 얻어진 조건을 Jar 배양(5L)으로 진행하여 균의 생육조건으로 30oC온도에서 pH 7.0, 배양시간 48시간임을 확인하였다. 또한 생산배지 변화 시험으로 기본 생산배지를 우선적으로 선정하고 이를 기준으로 산업용 생산배지로써 탄소원으로 황물엿, 질소원으로 Soybean meal로 선정하였음. 이와 같이 배양 조건 변화 및 생산배지 변화 시험에서 얻어진 각 배양액들은 온실시험(배추 무름병)에서 활성을 확인한 결과 약 50〜60% 이상의 방제활성을 보였다. 앞에서 선정된 배양 조건과 배지 성분을 이용하여 Pilot 배양을 각 각 50L 와 300L 규모로 진행하여 각 배양액들을 동결건조(F/D)로 분말을 얻은 후 이것을 50% WP 제형으로 만들어 온실시험에서 배추무름병에 방제 활성을 확인하였으며 또한 최종적으로 포장시험을 진행하여 토마토 풋마름병에 대한 방제 활성을 조사하였음. 토마토 풋마름병에 대해서는 대략 50%〜60% 이상의 방제가를 보였다.
포장검정 시험에서 유도저항성이 있는 고초균인 Bacillus vallismortis 07을 1.0×109cfu/ml으로 생산하여 500배로 희석, 육묘 중에 3∼5회 관수 처리하여 정식하였을 때 시설고추와 벼를 제외한 시설참외, 시설완숙토마토, 시설방울토마토, 노지고추, 땅콩 등에서 다소 증수되는 것으로 나타났으나 유의성은 없었다. 그러나 대부분의 작물에서 증수되는 경향이 있은 것으로 볼때 Bacillus vallismortis 07 미생물이 수량을 증수하는 것으로 볼 수 있다. 특히 고추 탄저병 저항성을 볼 때 병해 억제 효과가 있는 것으로 나타나 친환경 영농을 추진하는데 있어서 Bacillus vallismortis 07을 육묘 중에 사용하는 것이 증수효과와 더불어 병해충 억제에도 효과적일 것으로 사료된다. 2년차 시험으로 Bacillus vallismortis 07 균주가 만드는 물질 중 Q3 물을 이용하여 1ppm, 10ppm, Ap 물질을 이용하여 육묘 중 처리, 생육 중 관주처리, 생육 중 엽면처리와 B vallismortis 07을 혼합하여 처리하는 등 다양한 방법으로 펩타이드 물질과 미생물을 처리한 결과 전체적으로 펩타이드 물질을 처리한 구에서 생육이 촉진되거나 수량이 증수되는 것으로 조사되었다. 또한 병해도 억제되는 경향이 있었지만 지속적이지 않아 처리기간을 단축하거나 농약과 혼용하는등의 시험도 필요하다. 본 시험은 2년차에 마무리되기 때문에 농도에 따라 재현성 조사가 어려웠으나 전체적으로 펩타이드 물질을 처리하면 병해억제와 수량증대가 이루어졌다.
Cyclic lipopeptide iturin A analogs derived from a plant growth–promoting rhizobacterium (PGPR), the Bacillus vallismortis stain EXTN-1 (EXTN-1), have been shown to cause disease suppression through induced systemic resistance (ISR) in chili pepper plants. EXTN-1 was effective in the control of the
Cyclic lipopeptide iturin A analogs derived from a plant growth–promoting rhizobacterium (PGPR), the Bacillus vallismortis stain EXTN-1 (EXTN-1), have been shown to cause disease suppression through induced systemic resistance (ISR) in chili pepper plants. EXTN-1 was effective in the control of the phytophthora blight disease caused by P hytophthora capsici in chili pepper. Cyclic lipopeptides were purified from the culture filtrate of EXTN-1 and characterized as iturin A analogs based on NMR and HR-MS spectral analyses. All iturin A analogs tested (0.1 to 10 ppm) caused a significant disease reduction of phytophthora blight through the ISR mechanism in chili pepper after challenge inoculation with zoospores of P capsici, although iturins A6 and A8 showed antibiotic activity against the plant pathogens in an antibiosis assay, the other analogs did not. This result suggested that the disease suppression was due not to antibiosis but instead to ISR. The importance of the ISR mechanism was supported by the enhanced expression of defense-related genes such as P R -1, β-1,3-glucanase, chitinase, P R -4, peroxidase and P R -10 in three-week-old chili pepper after the pathogen challenge, as determined using reverse transcriptase (RT)-PCR. Cyclic dipeptides also isolated from B. vallismortis EXTN-1 and some related chemical analoges were made artificially. All the analoges were tested by ISR screening on tobacco,red-pepper and arabidopsis in green house. The promising dipeptide Q3 gave a sucessful results in green house and field test on chinse cabbage and red-pepper field, The soybean meal is a very suitable medium for mass production of B. vallismortis EXTN-1 which prodution of secondary methabolites, The dipeptide apllication showed plant growth promotion, induction of systemic resistance and resistance to abiotic stress on the crops.
These findings suggest that the iturin A analogs and dipeptides from EXTN-1 are involved in the activation of the plant immune system and contributed in plant health.
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