보고서 정보
주관연구기관 |
국립식량과학원 National Institute of Crop Science |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-02 |
과제시작연도 |
2013 |
주관부처 |
농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA) |
등록번호 |
TRKO201400011439 |
과제고유번호 |
1395031731 |
사업명 |
농축산물부가가치향상 |
DB 구축일자 |
2014-07-05
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201400011439 |
초록
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Ⅳ. 연구개발결과
새싹보리 전용 품종을 선정하기 위해 겉보리 10종, 쌀보리 5종, 맥주보리 3종의 종자를 파종하에 보리싹 수율과 생육상태가 우수한 겉보리 품종인 큰알보리(62.1%), 대진보리(60.1%)를 선발하고 2년차 임상시험을 위한 시험재료 증식도 동시에 실시하였다. 선발된 품종중 대진보리를 대량 온실파종 하여 파종 후 약 10-13일 후 수확, 음건세절하여 분말화 하였다. 기능성물질의 분리, 정제를 위해 80% 메탄올로 24시간, 3회 교반추출하여 진공회전 농축기를 이용하여 추출용매를 회수 후 농축하여 새싹보리 조추
Ⅳ. 연구개발결과
새싹보리 전용 품종을 선정하기 위해 겉보리 10종, 쌀보리 5종, 맥주보리 3종의 종자를 파종하에 보리싹 수율과 생육상태가 우수한 겉보리 품종인 큰알보리(62.1%), 대진보리(60.1%)를 선발하고 2년차 임상시험을 위한 시험재료 증식도 동시에 실시하였다. 선발된 품종중 대진보리를 대량 온실파종 하여 파종 후 약 10-13일 후 수확, 음건세절하여 분말화 하였다. 기능성물질의 분리, 정제를 위해 80% 메탄올로 24시간, 3회 교반추출하여 진공회전 농축기를 이용하여 추출용매를 회수 후 농축하여 새싹보리 조추출물 약 4.5kg을 얻었다. 조추출물을 다시 물로 녹여 헥산으로 지질, 왁스성분들을 걸러낸뒤 헥산층, 물층의 분획물을 농축하여 각각 1.2kg, 3.2kg을 얻었다. 역상, 순상 실리카겔크로마토그래피를 이용하여 플라본글루코사이드류로 이루어진 폴리페놀 화합물 10종과 폴리코사놀류 화합물 9종을 순수 분리하였고 이들은 핵자기공명분광기(NMR), 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-Ms/Ms) 등의 분광기기를 이용하여 화학구조를 동정하였다. 여러 새싹보리에 함유된 2차대사성분 중 기능성을 가지는 지표물질을 지질왁스 성분인 폴리코사놀과 플라본글루코사이드인 플라보노이드계 화합물인 사포나린으로 선정하고 이들의 콜레스테롤, 중성지방 및 혈당경감효과를 실험과 재배방법, 품종에 따른 함량 변화 등을 조사하였다. 새싹보리 품종별, 생육시기별 폴리코사놀 함량은 큰알보리, 대진보리가 파종후 약 10-13일, 온도는 22-25℃ 일 때 가장 높은 총폴리코사놀 함량을 나타내었고(약 342mg/100g) 그중 헥사코사놀이 약70% 이상을 차지하였다. 사포나린 성분은 노지 춘파 파종(3월27일)에서 약13일 후 일 때 가장 많이 함량(약 1,811mg/100g)을 나타내었다. 지표성분의 지질대사 예방 및 개선효과를 검정하기 위하여 마이크로어레이 실험과 인체간세포를 이용하여 지질대사와 관련된 유전자 및 전사조절인자의 발현을 조사한 결과 새싹보리 추출물 및 지표성분은 세포내에서 에너지 대사를 유지 및 조절하는 기능을 가진 단백질인 AMPK의 인산화가 촉진되어 에너지증가, 지방 및 콜레스테롤 생합성과정을 억제하여 지구력증진 및 콜레스테롤 개선효과가 나타나는 것으로 그 작용기작을 구명하였다. 세포독성이 없는 농도(100ug/mL)에서 인체간암세포(HepG2)의 중성지방 경감 효과 확인한 결과 실험대조군인 로바스타틴(Lovastatin) 약효 대비 약 70% TG 억제효과 확인하였다. 또한 수용성 화합물중의 지표성분인 사포나린의 혈당강하에 관여하는 효소인 알파-글루코시데이즈 억제활성을 검정한 결과 세포독성이 없는 농도에서 대조군 대비 IC50 값이 약 55.4uM로 나타났다. 전임상, 임상시험용 새싹보리 추출물의 지표 성분 함량을 조사한 결과 전임상 시험용의 폴리코사놀 함량은 61.4mg±2.5/g, 임상제형의 폴리코사놀 함량은 7.5mg±0.4/capsule로 각각 분석되었다. 실험동물을 이용한 전임상 시험에서는 헥사코사놀과 새싹보리 주정추출물을 투여한 마우스 그룹에서 혈중 콜레스테롤 농도가 감소하였고 새싹보리 주정추출물과 헥사코사놀을 처리한 그룹에서는 HMGCR의 활성을 저해하는 AMPK가 활성화되고, 콜레스테롤 대사 유전자의 전사를 조절하는 mature type의 SREBP2의 발현 감소가 관찰되었다. 또한 free cholesterol을 저장형태인 cholesterol ester의 형태로 전환시켜주는 ACAT2의 발현 감소, 콜레스테롤 대사조절에 이로운 역할을 수행하는 것으로 분석되었고 새싹보리 추출물을 투여한 마우스 그룹에서 당대사 개선효능이 관찰됨에 따라 관련 유전자들의 발현을 조사하였으며, 연구결과 포도당신생합성에 관여하는 유전자들의 발현이 감소한 것으로 나타났다. Autophagy pathway 분석결과에서는 autophagosome을 형성하는 유전자들의 발현 증가가 관찰되어, 새싹보리 추출물 투여그룹에서의 지방간 개선 효능을 뒷받침하는 결과를 확보하였고 염증마커를 분석한 결과, 새싹보리 추출물 투여군에서 염증성 사이토카인인 TNFα의 발현이 감소함을 확인하였다. 임상시험은 2013년 4월부터 2013년 12월 까지 진행되었으며 중도 탈락자는 총 11명으로 최종 분석은 50명으로 이루어졌다. 11명중 7명은 경증의 가려움증을 호소하여 시험을 중단 하였으며 4명은 시험자의 개인사정으로 끝까지 진행하지 못하였다. 시험군 25명, 대조군 25명이었으며 시험군은 남자 1명, 여자 24명이었고 대조군은 남자 2명, 여자 23명이었다. 결과는 SPSS 17.0 version으로 기술통계와 paired T-test 검정을 이용하여 두 군 사이에 통계학적 유의한 차이가 있는지 살펴보았다. p-value가 0.05이하인 경우 두 유의하다고 정의하였으며 결과값은 소수점 둘째자리까지 반올림하여 표시하기로 하였다. 식품을 복용하기 전 시험군과 대조군은 평균 나이 각각 42.54 ± 12.95세, 39.12 ± 11.36세, 키, 몸무게, BMI, 혈압, 맥박 등 기본 특성 및 TG, Total cholesterol, LDL-C, HDL-C, fasting glucose, insulin, HbA1c 등 모든 생화학 지표에서 유의한 차이가 없었다. (표 1) 12주가 지난 뒤에는 Total cholesterol 값이 복용 전에 비하여 대조군에서는 182.28 ± 26.72mg/dl에서 187.72 ± 28.79 mg/dl로 약 5.5mg/dl 증가한 반면 시험군에서는 182.16 ± 31.89mg/dl에서 182.16 ± 33.19mg/dl로 증가하지 않았다. 뿐만 아니라, 12주가 지난 뒤 LDL-C 값은 복용 전에 비하여 대조군에서는 114.36 ± 27.51mg/dl에서 116.84 ± 30.66 mg/dl로 약 2.5mg/dl 증가한 반면 시험군에서는 111.16 ± 26.83mg/dl 에서 107.96 ± 30.21mg/dl로 약 3.2 mg/dl 감소하였다. 당대사 지표에 있어서는 공복혈당과 2-3개월 혈당의 평균치를 반영하는 당화혈색소 (HbA1c) 수치를 비교해 본 결과, 시험군과 대조군에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이 결과를 바탕으로 새싹보리 추출물은 주로 지질대사에 효과를 보이는 것으로 생각된다. 새싹보리 추출물을 복용한 군과 placebo 식품을 복용한 군사이의 최종 Total cholesterol과 LDL-C 값의 변화 차이는 각각 약 5.5mg/dl, 약 5.7mg/dl이었다. 이번 임상시험을 통해 무작위 추출 성인에서 식이조절, 운동 등의 생활습관을 개선하지 않고 새싹보리 추출물 복용만으로도 지질강하의 효과가 나타났음을 알 수 있었다. 향후 새싹보리 추출물 성분의 건강기능성 식품이 만들어 진다면 효용성과 충분한 시장성이 있을 것으로 생각된다. 하지만, Total cholesterol과 LDL-C에서 p-value 값이 각각 0.323, 0.301로 통계적 유의성을 나타내기에는 부족하였다. (표 4) 이는 시험 대상자가 수 십명 내외로 적었던 점과 시험을 진행하는 동안 탈락자가 발생하였기 때문으로 생각되어진다.
Abstract
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Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase (AMPK) is an intracellular sensor that can regulate glucose levels within the cell. For this reason it is well known to be a target for drugs against diabetes and obesity. AMPK was activated significantly by the hexane extract of barley sprouts. Th
Adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase (AMPK) is an intracellular sensor that can regulate glucose levels within the cell. For this reason it is well known to be a target for drugs against diabetes and obesity. AMPK was activated significantly by the hexane extract of barley sprouts. This AMPK activation emerges across the growth stages of the sprout, becoming most significant (three times above the initial stages) 10 days after sprouting. After this time, the activation decreased between 13 to 20 days post sprouting. Analysis of the hexane extracts by GC-MS, showed the amounts of policosanols (PCs, which are linear, primary aliphatic alcohols with 20-30 carbons) in the plant dramatically increased between 5 days (109.7 mg/100g) to 10 days (343.7 mg/100g) post sprouting, and then levels fell back down, reaching 76.4 mg/100g 20 days post sprouting. This trend is consistent with policosanols being the active ingredient in the barley plants. We validate this by showing that hexacosanol is an activator of AMPK. The richest cultivar for PCs was found to be Daejin cultivar. Cultivars had a significant effect on total PC content (113.2 to 183.5 mg/100g) within the plant up to 5 days post sprouting. However this dependence on cultivar was not so apparent at peak stages of PC production (10 days post sprouting). The most abundant policosanol in barley sprout, hexacosanol contributed 62–80% of the total PC content at every stage. These results are valuable to determine the optimal times of harvest obtain the highest yield of PCs. AMPK is a cellular regulator of energy metabolism, which is activated by increased AMP concentrations. The active AMPK phosphorylates and inhibits 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMGCR) activity thus reduces cholesterol biosynthesis. In this project, we investigated hypocholesterolemic mechanisms of barley sprout extract which contains policosanols. HepG2 cells stimulated with barley sprout significantly reduced total, free cholesterol, and cholesterol ester concentrations with the activation of AMPK and subsequent induction of HMGCR phosphorylation. Moreover, barley sprout suppressed SREBP2 transport to nucleus, thus, reduced HMGCR translation. High-fat-fed mice orally administered with barley sprout for 12 weeks revealed significantly reduced plasma cholesterol, IL-6, TNFα and hepatic cholesterol concentrations compared with controls. The expression of major gene in cholesterol efflux and cholesterol ester synthesis were significantly altered in barley sprout group. AMPK activation with barley sprout resulted in the lowering fasting glucose concentration in mice by repressing the expression of hepatic gluconeogenic genes including fructose-1, 6-bisphosphatase and pyruvate carboxylase. Interestingly, hepatic autophagy which is activated by AMPK signaling was stimulated with barley sprout with induced protein expressions of LC3-II and LAMP. In conclusion, barley sprout activates AMPK and hepatic autophagy thus hypocholesterolemic, hypoglycemic and improves symptoms in hepatic steatosis. Clinical experiment test is a 12-weeks randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. The investigation was conducted in the clinic of Family medicine at the Ewha Womans University Mokdong Hospital, Seoul, Korea. A total of 72 persons who had been examined for history taking, physical examination and routine chemical laboratory test for baseline work-up. Information on the medical history, current use of medications, weekly alcohol consumption and smoking status were obtained from all participants using a standard questionnaire. A participant was considered to have a diabetes mellitus if he was currently taking an oral glucose-lowering agent or insulin, or if he had a fasting serum glucose level ≥ 126 mg/dL. The definition of hypertension was a systolic blood pressure (BP) ≥ 140 mmHg, a diastolic BP ≥ 90 mmHg, or the use of anti-hypertensive medication. A venous blood sample was drawn from an antecubital vein in the morning after more than 12 hours of fasting. The serum levels of liver enzymes and other biochemical markers were measured using the Bayer Reagent Packs (Bayer HealthCare, Tarrytown, NY) on an ADVIA 1650 automated chemistry analyzer (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germany). The clinical laboratory has been accredited by the Korean Association of Quality Assurance for Clinical Laboratories and participates annually in inspections and surveys. Among the 72 participants, 11 were excluded for various reasons: 1 had a past history of a cardiovascular disease, 5 were receiving medication for lipid-lowering agents, 5 had baseline type 2 diabetes mellitus, at initial examination. The participants were randomly divided into two groups in each group by using a computer generated code: the case group, receiving capsules of barley malt sprout extracts 500 mg qd, and the control group, receiving a dextrin capsule of placebo bid. We further excluded 11 participants who did not attend any follow-up visit or did not take more than 80% of capsules. Eventually, 50 participants were enrolled in the final analysis (case group = 25, control group = 25). The statistical results are presented as the mean ± standard deviation or median for continuous variables and percentages of the number for categorical variables. The study was approved by the institutional review board of Ewha Womans University Mokdong Hospital. Written informed consent was obtained from all participants.
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- S U M M A R Y ... 7
- 목 차 ... 10
- 제 1 장 서 론 ... 11
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 13
- 제1절 국내 연구 현황 ... 13
- 제2절 국외 연구 현황 ... 16
- 제3절 국내외 연구 현황 비교 및 필요연구 분야 ... 18
- 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 19
- 제1절 연구재료 및 방법 ... 19
- 제2절 연구결과 ... 28
- 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 87
- 1절 : 목표대비 달성도 ... 87
- 2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 89
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 93
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 95
- 제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 95
- 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 95
- 제 9 장 참고문헌 ... 95
- 끝페이지 ... 97
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