[보고서]배아줄기세포를 이용한 발생독성 대체시험법 탐색 연구

배아줄기세포를 이용한 발생독성 대체시험법 탐색 연구
Development of alternative test methods to potential developmental toxicology chemicals using embryonic stem cells 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	충북대학교 산학협력단 Chungbuk National University
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-11
과제시작연도	2013
주관부처	식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration
등록번호	TRKO201400011640
과제고유번호	1475007198
사업명	안전성관리 기반연구
DB 구축일자	2014-07-26
키워드	배아줄기세포.발생독성물질.발생독성평가.대체시험법.Embryonic stem cell.Embryoid body.Developmental toxicant.ECVAM.Alternatives to animal testing.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201400011640

초록 ▼

분화 만능성을 갖는 인간 배아줄기세포는 세포분화기전의 기초연구 및 치료개념으로 임상에 적용되는데, 최근에 생명윤리에 대한 문제가 대두되는 동물실험 또는 배양세포시험법을 대체 할 수 있는 대상으로 인식되고 있으며, 이는 기존에 사용되는 임상적용물질과 신약의 안전성 검증을 위한 새로운 개념의 시험법으로 평가되어지고 있다. 우리가 사용한 5-fluorouracil, hydroxyurea, indomethacin, dexamethasone, cytosine arabinoside는 동물실험, 세포배양실험 및 임상시험을 통해 검증된 대표적인 항암제, 항염증제로서 다양한 질병의 치료제로 사용되고 있으나, 수반되는 부작용들로 인하여 약물의 안전성 검증 측면에서 기준이 되는 약물이라 하겠다. 이러한 약물을 이용하여 유럽 (ECVAM)과 일본 (JACVAM)의 동물대체시험법검증센터는 실험동물사용의 윤리적 문제를 회피하기 위해 미분화 및 분화 단계의 마우스 배아줄기세포를 이용하여 안전성 평가 방법을 확립하였다. 그리고 배아줄기세포를 이용한 대상물질의 안전성 평가는 임상시험의 주요한 지표로 활용되거나 수많은 동물실험의 기준이 되므로 시험의 정확도가 요구된다. 하지만 이 기관들에서 사용된 배아줄기세포의 근간은 인간이 아닌 마우스 유래의 세포로 이종의 특성에 근거하여 사람에게 적용될 물질을 이해하는데 한계가 분명히 존재한다. 따라서 본 과제는 인간 유래의 배아줄기세포를 이용하여 미분화 및 분화 단계에서 발생독성물질 5종 및 음성대조물질 2종을 검증하고 평가하여 인간 배아줄기세포를 이용한 발생독성 대체시험법을 확립하였다.

Abstract ▼

Toxicity is generally referred to as the degree to which a substance can damage an organism. There have been numerous reports that detection of toxicities through in vitro system is an economical and an ethical method compared with in vivo system using animal. In evaluation of developmental toxicity, embryonic stem cells (ESs) have the potential because they proliferate in large number and differentiates into the three germ layers following embryoid bodies (EBs) formation like a developmental embryo. Using an microarray analysis, we confirm that embryotoxic chemicals (5-fluorouracil, hydroxyurea, indomethacin, dexamethasone, cytosine arabinoside) have cytotoxic effects, and modulate the differentiation-involved genes as well as metabolism-, development-, and apoptosis-related genes that have pivotal roles in undifferentiated conditions of the hES cells. To further investigate developmental toxicants, we examined the effects of them on formation of EBs using human ES cells. As expected, developmental toxicants impaired the differentiation of hES cells in company with cytotoxicity. In particular, we know that the relevancy of our experimental method is more accurate than that of EST using mouse ES cells. Therefore, we suggest that hES cells may be useful for testing the toxixity or differentiation impairment of chemicals that could impact the embryonic developmental stage.

목차 Contents

표 지 ... 1
용역연구개발과제 최종보고서 ... 2
제 출 문 ... 3
목 차 ... 4
Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 6
국문 요약문 ... 6
영문요약문 (Summary) ... 8
Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 10
제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 26
제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 31
제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 99
제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 103
제6장 총괄참고문헌 ... 112
제7장 총괄첨부서류 ... 123
끝페이지 ... 124

표/그림 (70)

표 Fig. 1. Fertilization, embryonic development and differentiation of blastocyst.
표 Fig. 2. Origin and differentiation potential of embryonic stem (ES), and the use of the ES cell technology for mutagenicity
표 Fig. 3. Schematic illustration of the differentiation potential of hESC.
표 Fig. 4. Summary of data showing the developmentally controlled expression patterns of ES-cell-derived cardiac, myogenic, neuronal, epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro.
표 Fig. 27. 심근세포 및 신경세포로의 분화과정
표 Fig. 5. 수태능▪초기배 발생시험법에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 6. 배▪태자 발생시험법에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 7. 출생전▪후 발생 및 모체기능 시험법에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 8. 발생독성시험에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 9. 1세대 번식독성시험에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 10. 2세대 번식독성시험에서의 독성물질 투여기간
표 Fig. 11. 반복투여 및 생식발생독성 병합시험 투여기간
표 Fig. 12. 신경발생독성시험 투여기간
표 Fig. 13. Micromass embryotoxicity assay 방법
표 Fig. 14. 분리 후 2일된 mouse fibroblast 세포
표 Fig. 15. (A) Mito-mEF에서 인간 배아줄기세포 배양. 인간 배아줄기세포의 증식 확인, (B) 9일 된 인간 배아줄기세포
표 Fig 16. 여러 농도의 Matrigel에서 인간 배아줄기세포 배양
표 Fig. 17. 인간 배아줄기세포 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81의 발현 확인
표 Fig. 18. 발생독성물질과 음성대조물질에 의한 인간 배아줄기세포 증식력 측정 및 IC50 값
표 Fig. 19. 발생독성물질 (5-fluorouracil, indomethacin)과 음성대조물질 (penicillin G)에 의한 인간 배아줄기세포의 미분화능 유지 전사인자 유전자 발현 확인,
표 Fig. 20. 발생독성물질 (hydroxyurea, cytosine arabinoside, dexamethasone)과 음성대조물질 (ascorbic acid)에 의한 인간 배아줄기세포의 미분화능 유지 전사인자 유전자 발현 확인,
표 Fig. 21. 발생독성물질 (5-fluorouracil, indomethacin)과 음성대조물질 (penicillin G)에 의한 만능성과 자기 재생 및 사이토카인과 성장에 필요한 신호분자 유전자 발현 확인
표 Fig. 22. 발생독성물질 (hydroxyurea, cytosine arabinoside, dexamethasone)과 음성대조물질 (ascorbic acid)에 의한 만능성과 자기재생 및 사이토카인과 성장에 필요한 신호분자 유전자 발현 확인
표 Fig. 23. 발생독성물질 (5-fluorouracil, indomethacin)과 음성대조물질 (penicillin G)에 의한 인간 배아줄기세포 특이 유전자 발현 확인
표 Fig. 24. 발생독성 동물대체시험법에서 발생독성물질 (5-fluorouracil, indomethacin, cytosine arabinoside, hydroxyurea)과 음성대조물질 (penicillin G)에 의한 IC50 값
표 Fig. 25. 미분화 상태에서 embryotoxic chemicals 처리 3일 후 (1차년도 결과 기준) 유전자 발현 프로파일링. A) 생물학적 범주에 따른 유전자 ontology, B) 세포 발육, 세포 주기, 세포 사멸에 따른 유전자 ontology
표 Fig. 26. Microarray에 의해 발굴된 유전자 발현 확인
표 Fig. 27. 발생독성물질 5-fluorouracil의 미국 FDA 분류
표 Fig. 28. 발생독성물질 indomethacin의 미국 FDA 분류
표 Fig. 29. 인간 배아줄기세포에서 발생독성물질이 미치는 영향
표 Fig. 30. 발생독성물질과 음성대조물질에 의한 인간 배아줄기세포 증식력 측정 및 ID50 값
표 Fig. 31. 심근분화과정 시 전구세포와 최종 표적세포에서 계통별 분화 특이 표지 마커 발현 패턴 확인
표 Fig. 33. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 5-fluorouracil 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 32. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 cytosine arabinoside 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 34. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 hydroxyurea 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig 35. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 dexamethasone 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 36. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 indomethacin 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 37. 심근세포로 분화 중 음성대조물질인 ascorbic acid 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 38. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 cytosine arabinoside 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 39. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 5-fluorouracil 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 40. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 hydroxyurea 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 41. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 dexamethasone 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 42. 심근세포로 분화 중 발생독성물질인 indomethacin 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 43. 심근세포로 분화 중 음성대조물질인 ascorbic acid 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 44. 심근세포로 분화 시 발생독성물질에 의한 심근분화 표지 마커인 cTn1 면역 형광 확인
표 Fig. 46. 심근세포로 분화 시 발생독성물질에 의한 심근분화 표지 마커인 α-actinin 면역 형광 확인
표 Fig. 45. 심근세포로 분화 시 발생독성물질에 의한 심근분화 표지 마커인 ANP 면역 형광 확인
표 Fig. 47. 발생독성물질과 음성대조물질에 의한 인간 배아줄기세포 증식력 측정 및 ID50 값
표 Fig. 48. 신경분화과정 시 전구세포와 최종 표적세포에서 계통별 분화 특이 표지 마커 발현 패턴 확인.
표 Fig 49. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 cytosine arabinoside 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 50. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 5-fluorouracil 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 52. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 dexamethasone 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 51. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 hydoxyurea 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 53. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 indomethacin 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 54. 신경세포로 분화 중 음성대조물질인 ascorbic acid 처리 시 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 55. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 cytosine arabinoside 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 56. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 5-fluorouracil 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 57. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 hydroxyurea 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 58. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 dexamethasone 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 59. 신경세포로 분화 중 발생독성물질인 indomethacin 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 60. 신경세포로 분화 중 음성대조물질인 ascorbic acid 처리 시 lineage별 표지 마커의 발현 확인
표 Fig. 62. 신경세포로 분화 시 발생독성물질에 의한 신경분화 표지 마커인 β-tubulinIII 면역 형광 확인
표 Fig. 61. 신경세포로 분화 시 발생독성물질에 의한 신경분화 표지 마커인 nestin 면역 형광 확인
표 Fig. 63. ECVAM 에서 제시한 iPM과 이번 실험에서 제시할 PM의 분석방법과 등급기준
표 Fig. 64. H9 세포와 MRC-5 세포를 이용한 IC50 값과 ID50 값
표 Fig. 65. 인간 배아줄기세포를 이용한 분화유도
표 Fig. 66. cytotoxicity 측정과정
표 Fig. 67. 인간 배아줄기세포 분화시 cytotoxicity 측정
표 Fig. 68. hESC를 이용한 예측모델 (prediction model)의 endpoint 및 변수와 선형식별함수 식
표 Fig. 69. 발생독성 분류 기준

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
총연구비 (DetailSeriesProject) :	-
키워드(keyword) :	-
과제수행기간(LeadAgency) :	-
연구목표(Goal) :	-
연구내용(Abstract) :	-
기대효과(Effect) :	-

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 제목(한글), 저자명(한글), 발행일자, 전자원문, 초록(한글), 초록(영문) 관리번호, 제목(한글), 제목(영문), 저자명(한글), 저자명(영문), 주관연구기관(한글), 주관연구기관(영문), 발행일자, 총페이지수, 주관부처명, 과제시작일, 보고서번호, 과제종료일, 주제분류, 키워드(한글), 전자원문, 키워드(영문), 입수제어번호, 초록(한글), 초록(영문), 목차
저장형식	Text(ASCII format) Excel format
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

배아줄기세포를 이용한 발생독성 대체시험법 탐색 연구
Development of alternative test methods to potential developmental toxicology chemicals using embryonic stem cells 원문보기