보고서 정보
주관연구기관 |
동부팜한농(주) |
연구책임자 |
성순기
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참여연구자 |
이영표
,
최연옥
,
정주연
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-01 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
농림수산식품부 |
사업 관리 기관 |
농림수산식품기술기획평가원 |
등록번호 |
TRKO201400015335 |
과제고유번호 |
1545005176 |
사업명 |
생명산업기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-11-17
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초록
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Ⅳ. 연구개발결과
1. 원형질체 융합 callus 조기 판별 분자마커 시스템 개발
본 연구에서는 기존에 통상적으로 해오던 원형질체 융합 기술을 벗어나 분자마커의 접목으로 보다 효율적인 연구를 진행하고자 하였다. 즉 원형질체 융합 callus 단계에서 분자마커를 이용하여 조기에 원형질체 융합 여부를 판단해 원형질체 융합이 되지 못한 callus는 도태시키고, 원형질체 융합이 된 callus에서도 DCGMS의 미토콘드리아만 전이되고 엽록체는 recipient의 엽록체를 가진 callus를 선발하여 식물체를 얻고자 하였다. 이
Ⅳ. 연구개발결과
1. 원형질체 융합 callus 조기 판별 분자마커 시스템 개발
본 연구에서는 기존에 통상적으로 해오던 원형질체 융합 기술을 벗어나 분자마커의 접목으로 보다 효율적인 연구를 진행하고자 하였다. 즉 원형질체 융합 callus 단계에서 분자마커를 이용하여 조기에 원형질체 융합 여부를 판단해 원형질체 융합이 되지 못한 callus는 도태시키고, 원형질체 융합이 된 callus에서도 DCGMS의 미토콘드리아만 전이되고 엽록체는 recipient의 엽록체를 가진 callus를 선발하여 식물체를 얻고자 하였다. 이를 위해 무(DCGMS)와 십자화과 작물(양배추, 브로콜리, 유채, 배추)의 미토콘드리아 및 엽록체 DNA 다형성 분석을 실시하였다. 다형성 분석은 미토콘드리아/엽록체 유전자 coding region에서 프라이머를 제작하여 intergenic region의 다형성을 탐색하였다. 결과적으로 총 5개의 DCGMS 미토콘드리아를 식별할 수 있는 분자마커 및 엽록체 식별 분자마커를 개발하는데 성공하였고 원형질체 융합 callus의 조기 판별에 활용 하였다.
2. 양배추/유채/브로콜리/배추 자원 확보 및 원형질체 분리체계 확립
원형질체 융합 식물재료로 사용될 무 웅성불임 라인과 양배추, 브로콜리, 유채, 배추 등 십자화과 작물의 라인을 확보하고 기내 배양 체계를 확립해서 식물체를 대량 증식 시킨 후 각각의 작물별로 최적의 원형질체 분리조건을 확립하였다.
가 . 무웅성불임(DCGMS) 라인확보 및 원형질체 분리체계 확립
본 연구에 사용된 무 웅성불임(DCGMS) 라인은 제 1세부 연구팀에서 제공된 종자를 사용하였다. 약 1주일 무균 발아된 유식물체의 자엽 및 배축 약 1 g을 수거하여 세포벽분해효소용액(VCP: Viscozyme, celluclast 및 pectinEX (Novozyme) 혼합 용액으로 처리하여 최종 회수된 원형질체는 약 5x105 정도 이었다.
나. 유채/배추/브로콜리/양배추의 기내배양 및 원형질체 분리 및 배양체계 확립
무균발아된 유채의 소식물체의 자엽으로부터 CPW 13M용액 (CPW salts +13% mannitol) 전처리 시간 및 효소 용액 배양시간이 원형질체 분리 효율에 미치는 영향을 조사한 결과 세포벽분해효소 처리시간이 4시간에서 16시간으로 증가할수록 원형질체 yields는 약 2-6배 정도 증가함을 알 수 있었다. 유채. 배추, 브로콜리, 및 양배추 자엽유래 원형질체 배양에 미치는 생장조절제의 영향을 조사하기 위하여 2,4-D와 BA를 여러 농도로 혼용 처리하여 원형질체의 세포분열 효율을 조사한 결과 2,4-D는 1-3 mg/L 범위 그리고 BA는 0.3-0.5 mg/L 범위내의 혼용처리가 세포분열 효율이 좋음을 알 수 있었다. 또한 원형질체 배양에 미치는 osmoticum 및 원형질체 배양밀도가 유채의 원형질체 배양에 미치는 영향을 조사한 결과 배양밀도가 1x104 개에서는 9% mannitol 과 6% myo-inositol 모두 세포분열이 이루어지지 않았으며 배양밀도가 5x104 개에서는 9% mannitol 과 6%myo-inositol 처리구에서 약 15% 분열 효율을 보였다. 아울러 1x105 및 2x105 처리구에서는 분열 효율이 20-25% 정도로 mannitol 및 myo-inositol 처리구에서 모두 높은 효율의 세포분열을 관찰 할 수 있었다. 아울러 원형질체 배양에 미치는 탄소원으로 sucrose 및 glucose가 유채의 원형질체 배양에 미치는 영향을 조사한 결과 배양밀도가1x105 개에서는 3% sucrose 및 3% glucose의 세포분열 효율은 각각 18%, 20%이었다. 그러나 배양밀도가 2x105 개에서는 세포분열 효율이 각각 30% 및 25%로 증가됨을 알 수 있었다.
상기의 원형질체 분리 및 배양체계를 이용하여 본 연구과제의 각 작물별로 분열 효율을 조사한 결과 배추는 배양밀도가 5x104 개에서 분열효율이 30%로 가장 높았고 양배추, 유채 및 브로콜리의 경우 배양밀도가 증가할수록 분열효율이 증가하여 23%, 15% 및 18% 임을 알 수 있었다.
3. 양배추/유채/브로콜리/배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립
확립된 십자화과 작물의 원형질체 분리 및 배양 체계를 통해 각 작물별로 고효율 식물체 재생 체계를 확립하였다.
가. 양배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립
양배추 자엽 유래 원형질체로부터 얻어진 callus를 BA 2 mg/L와 NAA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨 배양한 결과 약 1달 정도 후에 callus로부터 shoot가 발생함을 관찰하였고 신장이 이루어진 shoot를 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2 MS 배양배지로 옮겨 배양한 결과 뿌리가 발생되는 것을 관찰하였다.
나. 유채 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립
유채 자엽 유래 원형질체로부터 얻어진 callus를 BA 2 mg/L와 NAA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨 shoot를 유도하였으나 자엽 explant의 결과와는 달리 callus 증식만 이루어지면서 shoot 발달을 관찰 할 수 없었다.
다. 브로콜리 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립
브로콜리 원형질체로부터 얻어진 callus를 zeatin 2 mg/L, IAA 0.2 mg/L, GA3 0.03 mg/L를 첨가한 MS 배양배지에 옮겨 배양한 결과 약 1달 정도 후에 shoot가 유기 되었고, 신장이 이루어진 shoot를 생장조절제가 첨가되지 않은 1/2 MS 배지에 옮겨 배양한 결과 뿌리가 발생되었고 뿌리가 신장된 후 토양에 옮겨 순화시켰더니 정상적으로 식물체 발달이 이루어짐을 관찰할 수 있었다.
라. 배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립
배추 원형질체로부터 얻어진 callus를 BA 1 mg/L와 NAA 0.5 mg/L를 첨가한 MS agar 배지에 옮겨 신초를 유도했으나 callus만 증식하였고 자엽 explant의 결과와는 달리 신초 발달을 관찰 할 수 없었다.
4. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 세포질 융합체계 확립
Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 융합체계 확립을 위하여 무의 핵 불활성화 및 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추)의 세포질 불활성화 체계를 확립하였으며 전기융합 조건을 규명하여 각 작물별로 효율적인 비대칭원형질체 융합체계를 확립하였다.
가. 무 원형질체의 핵 불활성화 체계 확립
감마선의 세기를 각각 0, 300, 500, 700, 1000, 1500 Gy 로 조정하여 무 식물체에 조사한 다음 원형질체를 분리하여 배양을 통해 최적 세기를 조사한 결과 300 Gy 이상 방사선 조사가 이루어지면 무 식물체의 핵이 불활성화됨을 알 수 있었다. 또한 방사선의 세기가 너무 높을 경우 식물체에 손상을 주어 융합 효율이 떨어질 수 있으므로 융합에 사용되는 무 식물체의 경우 500 Gy 이상을 조사하지 않는 것이 적당할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 융합에 사용되는 적정한 방사선 세기를 300∼500 Gy 정도 조정하여 무의 핵 불활성화에 사용하였다.
나. 양배추/유채/브로콜리/배추 원형질체의 세포질 불활성화 체계 확립
양배추의 세포질을 효과적으로 불활성화 시키기 위해서는 3 mM IOA로 처리시간은 5∼10분 이내, 유채 원형질체는 5 mM로 처리시간은 10분, 브로콜리 원형질체는 3 mM로 처리시간은 5분, 그리고 배추 원형질체는 5 mM로 처리시간은 5분 정도로 처리하는 것이 세포의 손상을 최소화하고 융합에 적합한 세포질 불활성화 조건임을 알 수 있었다.
다. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 융합체계 확립
무와 십자화과 작물의 전기 융합 과정은 은 먼저 25∼40 V/cm 세기로 20∼30초 동안 교류를 통과 시켜 원형질체간의 사슬을 형성시킨 후 1,250∼1400 V/cm 세기로 60 usec 동안 직류 전기첫격을 주어 원형질체 융합을 실시하였다.
라. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 융합 효율 증대
각 작물별로 원형질체 배양을 통한 세포괴의 형성 효율이 상이하였다. 따라서 무와 양배추를 이용하여 핵 공여자(무)에 조사하는 방사선 세기 조정 및 화학물질 (DMSO 등) 첨가, IOA 처리 시간 변화 등의 시험을 통해 원형질체 융합 효율 증대 방안을 모색하였다. 아울러 각 작물별로 전기적 조건과 융합 버퍼의 조성 및 pH, 원형질체의 밀도 및 혼합 비율 변화 등 제반 요건의 미세한 조건들을 다양하게 변경하면서 융합 세포를 관찰하고 효율이 높고 반복 재현성이 높은 융합 체계를 개발하였다.
5. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 융합 원형질체로부터 cybrid 식물체 재생 기술 개발
상기의 원형질체 융합 조건 규명, 배양체계 및 원형질체 융합체계를 이용하여 각 작물별로 원형질체 융합 cybrid 식물체 재생 체계를 확립하였다. 또한 원형질체 배양후 얻어진 callus 단계에서 분자마커로 핵과 세포질을 도입여부를 분석해서 조기에 cybrid 선발하고자 하였다. 아울러 식물체 재생 효율을 높일 수 있는 요인들을 추가적으로 규명하고자 하였다.
가 무와 양배추 . 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발
무와 양배추가 융합된 세포는 배양 후 1주일 이내에 초기 분열을 거쳐 콜로니 단계까지 분열하였고 2,4-D 2 mg/L와 BA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨주었더니 약 3-4 주 정도 후에 microcalli를 형성하는 것을 관찰하였다. 형성된 callus를 동일 MS 고체 배지에 옮겨 callus의 증식을 유도하였고 유도된 callus는 BA 2 mg/L와 NAA 0.5 mg/L가 첨가된 MS, gelrite 0.4% 배지로 옮겨 배양한 결과 다수의 신초가 유도되었다. 분자마커를 이용하여 cybrid 여부를 조사한 결과 무 세포질과 양배추 핵을 가진 cybrid callus 라인은 14개이고 그 중 10개는 무(DCGMS) 미토콘드리아만 가지고 있는 cybrid callus로서 웅성불임 식물체로 재생될 경우 상업 육종에 활용이 가능한 자원이 될 것으로 예상하고 있다.
나. 무와 유채 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발
무와 유채의 융합 원형질체 재생 체계를 개발하였다. 무와 유채가 융합된 세포는 배양 후 1주일 이내에 초기 분열을 거쳐 콜로니 단계로 분열하였고 2,4-D 2 mg/L와 BA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨주었더니 약 3-4 주 정도 후에 micro calli를 형성하는 것을 관찰하였다. 이를 동일 MS 고체 배지에 옮겨 callus의 증식을 유도하였고 유도된 callus는 BA 1 mg/L와 NAA 0.5 mg/L가 첨가된 MS, 0.8% agar 배지로 옮겨주어 신초를 유도하였으나 식물체 재생이 이루어지지 않았다.
다. 무와 브로콜리 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발
무와 브로콜리가 융합된 세포는 배양 후 약 1주일이내에 초기 분열을 거쳐 2∼3주 사이에 콜로니 단계로 분열하였다. 이를 2,4-D 2 mg/L와 BA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨주었더니 약 3-4 주 정도 후에 microcalli를 형성하는 것을 관찰하였다. 이를 2,4-D 0.5 mg/L와 BA 2 mg/L를 첨가한 MS 고체 배지에 옮겨 callus의 증식을 유도하였고 유도된 callus는 Zeatin 2 mg/L, IAA 0.2 mg/L, GA3 0.03 mg/L가 첨가된 MS 0.4% gelrite 배지로 옮겨주었더니 신초가 유도되었다. 유기된 신초는 생장조절제를 제외한 1/2 MS 배지에 옮겨 뿌리 형성을 유도하여 무와 브로콜리의 cybrid 식물체를 재생하는데 성공하였다. 현재 무 세포질과 브로콜리 핵을 가진 cybrid callus로 검증되어 유지하고 있는 식물체는 향후 식물체로 순화하여 화기 구조 및 원예적 특성 검정을 진행할 예정이다.
라. 무와 배추 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발
무와 배추가 융합된 세포는 배양 후 주일 1 이내에 초기 분열을 거쳐 콜로니 단계로 분열하였고 2,4-D 2 mg/L와 BA 0.5 mg/L를 첨가한 MS 배지에 옮겨주었더니 약 4 주 정도 후에 microcalli를 형성하는 것을 관찰하였다. 이를 2,4-D 0.5 mg/L와 BA 2 mg/L를 첨가한 MS 고체 배지에 옮겨 callus의 증식을 유도하였고 유도된 callus는 BA 5 mg/L와 NAA 0.5 mg/L가 첨가된 MS 0.8% agar 배지로 옮겨 약 1달 정도 신초를 유도한 후 Zeatin 0.2 mg/L가 첨가된 MS B5 0.8% agar 배지로 다시 옮겨 2차로 신초를 유도하였다. 2차 이식 후 약 1달 후에 무와 배추 융합 callus에서 유래한 신초가 유도되었다. 유도된 신초를 생장조절제를 제거한 1/2 MS 기본 배지에 옮겼더니 뿌리가 형성되었고 IBA 0.3 mg/L가 첨가된 1/2 MS 기본 배지로 옮겨 뿌리 증식을 유도하여 무와 배추의 cybrid 식물체를 재생하는데 성공하였다. 향 후 식물체로 순화하여 화기 구조 및 원예적 특성 검정을 진행할 예정이다. 특히 배추의 경우 상업적으로 활용할 수 있는 웅성불임 자원이 거의 없는 실정이기 때문에 성공적으로 웅성불임 배추가 개발되어 진다면 상업적 가치가 매우 클 것으로 예상되고 있다.
마. Donor(무) 와 recipient(양배추/유채) 융합 원형질체로부터 식물체 재생 효율 증대
양배추의 경우 기내에서 배양중인 cybrid plant를 육종의 중간모본으로 직접적으로 활용하기 위해서는 다수의 cybrid plant 확보가 필요하다. 따라서 확립된 안정적인 원형질체 융합 체계를 이용해 목적하는 cybrid plant를 다수 생산하고자 하였다. 따라서 본 연구과제의 대상 작물 중에서 타작물에 비해 융합 및 재분화 효율이 높고 재현성이 좋아 cybrid 확보가 용이한 양배추를 우선으로 대량 생산 체계를 확립하였다.
유채의 경우 연구 개발 초기에 사용된 유채의 식물체 재분화율이 높지 않아 비교적 식물체 재분화율이 높은 것으로 알려진 유채 라인들을 새로이 선발하여 무와 유채의 원형질체 융합 및 cybrid 식물체 재생체계를 새로이 확립하였다. 그 결과 BN 11라인이 가장 적합한 라인으로 선발되었으며 무와 유채의 융합 callus로부터 식물체 재생에 필요한 식물생장조절제의 종류 및 농도를 재차 규명하여 융합 callus를 BA 5 mg/L와 kinetin 0.5 mg/L가 첨가된 MS 배지에 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 고체 배지에서 배양한 결과 무와 유채의 융합 callus로부터 효과적으로 신초가 유도된 것을 관찰하였다. 발달이 이루어진 신초를 생장조절제를 제외한 1/2 MS 기본 배지에 옮겨 약 3주 정도 더 배양 하였더니 뿌리가 발생되면서 정상적인 식물체로 발달되는 것을 관찰할 수 있었다. 향 후 식물체로 순화하여 화기 구조 및 원예적 특성 검정을 진행할 예정이다.
6. FT-IR 분광분석을 통한 hybrid, cybrid 식물체 판별 기술 개발
원형질체 융합을 통해 생산되어진 cybrid line 중 상당히 많은 개체들이 실제적으로는 목적하는 세포질 융합이 되지 않은 경우가 많기 때문에 대량 생산되는 cybrid callus의 원형질체융합 여부를 조기에 판별해서 선별된 것들을 집중 관리할 수 있는 검증 시스템이 생산 효율을 높이는데 무엇보다 중요하다. 따라서 원형질체 융합을 통해 증식이 이루어진 다수의 융합 callus로부터 cybrid 후보 callus를 조기에 선발하기 위한 시스템을 DNA 분광분석을 통해 확립하였다.
가. Genomic DNA 적외선 분광분석을 통한 비대칭융합 cybrid 식별 체계 확립
무(세포질 DNA 공여체)와 양배추(핵DNA 공여체)의 비대칭 원형질체 융합을 통하여 만들어진 세포질 융합체(cybrid) 로부터 추출된 genomic DNAs 시료로부터 적외선분광 스펙트럼 분석을 통한 cybrid 식물체 식별체계를 확립하였다.
나. Genomic DNA 적외선 분광분석을 통한 무와 양배추 hybrid 식별 기술 개발
무와 양배추 genomic DNA의 FT-IR 스펙트럼을 통해 무와 양배추 그리고 이들의 DNA가 혼합된 DNA의 식별이 가능함을 알 수 있었다.
다. Genomic DNA의 FT-IR 분광 분석을 통한 배추, 양배추 그리고 유채의 식별 기술 개발
무와 양배추 그리고 유채와 이들의 혼합 genomic DNA 용액으로부터 얻어진 FT-IR 스펙트럼 데이터를 PCA 분석한 결과 무와 양배추 그리고 유채 genomic DNA의 식별이 가능하였다. 따라서 본 기술은 생물종 genome의 진화적 측면을 연구할 수 있는 새로운 단서를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
7. DCGMS 웅성불임 후보 유전자 탐색
무의 신규 웅성불임 자원(DCGMS)의 웅성불임 유전자는 아직 밝혀진 바가 없고, DCGMS의 웅성불임성을 타 십자화과로 성공적인 전이를 위해서는 웅성불임 유전자를 확인하는 것이 매우 중요한 연구이다. 본 연구에서는 무의 short repeat sequence들을 확인하고 이를 기반으로한 DCGMS에서만 존재하는 신규 ORF를 탐색하였다. 결과적으로 총 1,389개의 염기 (nucleotide)로 구성되어 있었으며, 단백질은 총 463개의 amino acid로 구성 되어있는 DCGMS 특이적인 신규 ORF 유전자를 확인하였다(orf 463이라 명명). 또한 orf 463 유전자는 발현이 되는 유전자이며 DCGMS의 웅성불임 후보 유전자로 판단되어 미토콘드리아/엽록체 식별 분자마커와 더불어 원형질체 callus의 선발에 분자마커로서 활용하였다.
8. 신규 웅성불임 양배추 개발 및 특성 분석
유채/브로콜리/배추의 경우 분자마커를 통해 지속적으로 선발하여 신초 유도 및 발근 (rooting) 중에 있기 때문에 원예적 형질 검증에는 좀 더 시간이 필요한 실정이다. 그러나 양배추의 경우 2개 라인의 callus에서 총 8개체의 원형질체 융합 식물체를 생산하여 화기 구조 및 원예적 형질을 검증 할 수 있었다.
발근(rooting)까지 거쳐 순화된 원형질체 융합 양배추 식물체는 온실에서 재배하였다. 양배추의 특성상 개화를 시키려면 일정 크기의 구가 형성될 때까지 키운 후 저온처리를 해야 개화가 진행되기 때문에 유묘 상태의 원형질체 융합 양배추를 일정 기간 재배한 후 60일 가량 인공적으로 저온처리(7℃)를 하였다. 확보된 8개체의 원형질체 융합 양배추는 모두 DCGMS의 미토콘드리아와 양배추의 엽록체를 가지고 있다. 또한 웅성불임 후보 유전자인 orf463 유전자를 모두 가지고 있는 cybrid 식물체이다. 8개의 cybrid 양배추는 약 60일간의 저온 처리에도 불구하고 저온황화 등과 같은 현상은 보이지 않았고, 정상적인 생육을 하였다. 이들 8개체 중에서 2개체는 현재 개화되어 화기를 관찰 할 수 있었고, 개화 된 2개체는 모두 웅성불임성을 보였다. 즉 DCGMS와 양배추의 원형질체 융합을 통해 생산된 식물체의 수술은 꽃 발달 초기(stage 1)부터 수술 발달에 이상이 있었고, 꽃 발달 후기(stage 5)에서도 정상적인 양배추 화기와는 전혀 다르게 수술이 퇴화된 모습을 보였다. 확인된 웅성불임 cybrid 식물체는 정상 양배추와의 교배를 통해 종자까지 얻을 수 있었는데, 이는 수술은 퇴화되었지만 암술의 기능은 정상적이라는 것을 확인 할 수 있는 결과였다.
이와 같은 결과로 DCGMS 웅성불임성을 양배추에 전이시켜 육종에 활용 가능한 새로운 웅성불임 양배추 자원을 개발하는데 성공하였다. 신규 웅성불임 양배추로 확인된 식물체의 callus는 2013년 2월 5일자로 한국 생명공학 연구원 유전자 은행에 기탁 하였다(기탁번호: KCTC 12365BP).
9. 십자화과 유전자원 수집 및 특성 분석
본 연구에서는 원형질체 융합을 통해 생산된 웅성불임 식물체의 조기 상용화를 위해 국내/해외 육종자원 수집 및 특성평가를 실시하였다. 또한 특성 평가를 통해 선발된 유전자원은 웅성불임 식물체가 생산되었을 때 교배친으로 활용하고자 하였다. 유전자원에 대한 특성 평가는 1년차와 2년차에 집중적으로 실시를 하여 미리 교배친으로 사용할 육종 자원을 선발하고, 웅성불임 식물체가 확보 되면 식물체 유지 및 계통 고정을 위해 활용하고자 하였다. 결과적으로 중국에서 수집한 총 26종의 유채 유전자원과 23종의 양배추 유전자원에 대한 원예적 특성 검정을 실시하였다. 또한 그 중 가장 우수한 형질을 보이는 10종의 유채 유전자원과 2종의 양배추 유전자원을 한국생명공학연구원 유전자원 센터에 기탁하였다.
Abstract
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A cybrid plant is a type of hybrid plant that combines the nuclear genome from one recipient species with the cytoplasmic genome (mitochondria and chloroplast) from a donor plant species. Cybrid plants can be produced using protoplast fusion technology. Using this technology, it is possible to eluci
A cybrid plant is a type of hybrid plant that combines the nuclear genome from one recipient species with the cytoplasmic genome (mitochondria and chloroplast) from a donor plant species. Cybrid plants can be produced using protoplast fusion technology. Using this technology, it is possible to elucidate the genetic contribution of the cytoplasmic genome apart from that of the nuclear genome. As important agronomical characteristics such as cytoplasmic male sterility (CMS) are controlled by the cytoplasmic genome, CMS cybrids are valuable resources in the agronomic seed industry. Cybrid plants, especially CMS cybrids, can also be produced using donor-recipient asymmetric protoplast fusion technologies.
Cruciferae is one of the most important vegetables in the world. Recently the world market of F1 hybrid seed industry is significantly enlarged. In order to protect domestic seed industry, many countries are trying to possess these CMS cybrid technologies. The development of CMS cybrid technologies play key role in becoming a winner in global seed market. Therefore this research aims to develop core technologies for production of CMS cybrid plant from Cruciferae plants. To accomplish these goals, first of all we collected plant materials including CMS donor plant (radish from Dongbu company) and recipient Cruciferae plants (cabbage, rapeseed, broccoli, and chinese cabbage). Secondly, we established the efficient protoplast isolation and asymmetric protoplast fusion system from these plants. Thirdly, we established the plant regeneration system from fused protoplast of each CMS donor and recipient Cruciferae plants (cabbage, rapeseed, broccoli, and chinese cabbage). In addition, chloroplast-based markers and mitochondria-based markers, orf463 markers that distinguish cytoplasm of DCGMS were used for selection of callus by protoplast fusion. Also, we developed the rapid discrimination system of cybridity and hybridity between Cruciferae plants using FT-IR spectroscopy combined by multivariate analysis.
Thus, we obtained 2 cybrid plants(cabbage), containing DCGMS-mitochondrial genome and cabbage-chloroplast genome. Both cybrid plants had short stamens with undeveloped anthers. Whereas, these cybrids set seeds when pollinated with female-fertile cabbage, and this results indicate that the female-fertility of cybrid plants are normal. Therefore, these cybrids may be useful for production of F1 hybrid seed in cabbage. Furthermore, CMS cybrid technologies established in this research could be applied for the development of CMS line from other crops and horticultural plants. In addition, the rapid and reliable discrimination system shown in this research could be applied as a novel tool for F1 hybrid and cybrid plant selection.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 15
- CONTENTS ... 17
- 목차 ... 19
- 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 22
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 23
- 1. 본 연구 관련 국내외 기술수준 비교 ... 23
- 2. 본 연구관련 핵심 특허분석 ... 25
- 3. 본 연구관련 논문분석 ... 25
- 4. 본 연구관련 제품 및 시장 분석 ... 26
- 제 3 장 연구 개발 수행 내용 및 결과 ... 28
- 제 1 절 원형질체 융합 callus 조기 판별 분자마커 시스템 개발 ... 28
- 1. 십자화과 미토콘드리아 식별 분자마커 시스템 개발 ... 29
- 2. 십자화과 엽록체 식별 분자마커 시스템 개발 ... 32
- 제 2 절 무/양배추/유채/브로콜리/배추 자원 확보 및 원형질체 분리체계 확립 ... 36
- 1. 무웅성불임(DCGMS) 라인 확보 및 원형질체 분리 체계 확립 ... 36
- 가. 식물재료의 발아율 검정 ... 36
- 나. 무 웅성불임(DCGMS) 라인 확보 및 기내 배양체계 확립 ... 36
- 다. 무 자엽 및 배축으로부터 원형질체 유리 조건 확립 ... 37
- 2. 유채/배추/브로콜리/양배추의 기내배양 및 원형질체 분리 조건 확립 ... 38
- 가. 유채 원형질체 분리 및 배양체계 확립 ... 38
- 나. 배추 원형질체 분리 및 배양체계 확립 ... 41
- 다. 브로콜리 원형질체 분리 및 배양체계 확립 ... 42
- 라. 양배추 원형질체 분리 및 배양체계 확립 ... 43
- 마. 원형질체 분리 효율 증대 ... 43
- 제 3 절 양배추/유채/브로콜리/배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립 ... 45
- 1. 양배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립 ... 45
- 2. 유채 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립 ... 47
- 3. 브로콜리 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립 ... 48
- 4. 배추 원형질체로부터 식물체 재생체계 확립 ... 50
- 제 4 절 Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체 융합 체계 확립 ... 52
- 1. 무 원형질체의 핵 불활성화 체계 확립 ... 52
- 2. 양배추/유채/브로콜리/배추 원형질체의 세포질 불활성화 체계 확립 ... 53
- 가. 양배추 원형질체의 세포질 불활성화 조건 확립 ... 53
- 나. 유채 원형질체의 세포질 불활성화 조건 확립 ... 54
- 다. 브로콜리 원형질체의 세포질 불활성화 조건 확립 ... 55
- 라. 배추 원형질체의 세포질 불활성화 조건 확립 ... 55
- 3. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 융합체계 확립 ... 56
- 가. 무와 양배추 원형질체의 융합 체계 확립 ... 57
- 나. 무와 유채 원형질체의 융합 체계 확립 ... 59
- 다. 무와 브로콜리 원형질체의 융합 체계 확립 ... 60
- 라. 무와 배추 원형질체의 융합 체계 확립 ... 61
- 4. Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 원형질체의 융합효율 증대 ... 62
- 가. 무와 양배추 원형질체의 융합 효율 증대 ... 62
- 나. 무와 유채 원형질체의 융합 체계 개발 ... 65
- 다. 무와 브로콜리 원형질체의 융합 체계 개발 ... 66
- 라. 무와 배추 원형질체의 융합 체계 개발 ... 67
- 제 5 절 Donor(무)와 recipient(양배추/유채/브로콜리/배추) 융합 원형질체로부터 cybrid 식물체 재생 기술 개발 ... 70
- 1. 무와 양배추 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발 ... 70
- 2. 무와 유채 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발 ... 71
- 3. 무와 브로콜리 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발 ... 73
- 4. 무와 배추 융합 원형질체로부터 식물체 재생 기술 개발 ... 74
- 5. Donor(무) 와 recipient(양배추/유채) 융합 원형질체로부터 식물체 재생 효율 증대 ... 79
- 가. 무와 양배추 융합 원형질체의 재생 효율 증대 ... 79
- 나. 무와 유채 융합 원형질체의 재생 효율 증대 ... 81
- 제 6 절 FT-IR 분광분석을 통한 hybrid, cybrid 식물체 판별기술 개발 ... 92
- 1. Genomic DNA 적외선 분광분석을 통한 비대칭융합 cybrid 식별 체계 확립 ... 92
- 2. Genomic DNA 적외선 분광분석을 통한 무와 양배추 hybrid 식별 기술 개발 ... 97
- 3. Genomic DNA의 FT-IR 분광 분석을 통한 배추, 양배추 그리고 유채의 식별기술 개발 ... 100
- 제 7 절 DCGMS 웅성불임 후보 유전자 탐색 ... 104
- 1. 무의 short repeat sequence 분석 ... 104
- 2. DCGMS 웅성불임 후보 유전자 탐색 및 유전자 분석 ... 107
- 제 8 절 신규 웅성불임 양배추 개발 및 특성 분석 ... 111
- 제 9 절 십자화과 유전자원 수집 및 특성 분석 ... 116
- 1. 해외 유채 유전자원 수집 및 유전자원 기탁 ... 116
- 2. 해외 양배추 유전자원 수집 및 유전자원 기탁 ... 119
- 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 121
- 1절 연구목표 달성도 ... 121
- 2절 관련 분야 기여도 ... 126
- 1. 십자화과 웅성불임 식물체 라인 개발 ... 126
- 2. 원형질체 융합을 통한 웅성불임 식물체 개발 기술 ... 127
- 3. Cybrid 식물체 분석 및 세포질 융합 패턴 분석 ... 127
- 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 128
- 1절 연구 개발 성과 ... 128
- 가. 연구개발결과의 성과 및 활용목표 대비 실적 ... 128
- 나. 논문게재 성과 ... 129
- 다. 특허 성과 ... 130
- 2절 연구 성과 활용 계획 ... 130
- 1. 신규 웅성불임 cybrid 양배추 식물체 활용 계획 ... 130
- 2. 십자화과 웅성불임 식물체 라인 활용계획(배추/유채/브로콜리) ... 131
- 3. 웅성불임 식물체 개발 기술 활용 계획 ... 132
- 4. Cybrid callus 조기 식별 시스템 ... 132
- 5. Cybrid 식물체 분석 및 세포질 융합 패턴 분석 ... 132
- 6. 특허 출원 계획 및 논문 게재 계획 ... 133
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ... 133
- 제 7 장 참고문헌 ... 134
- 끝페이지 ... 136
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