[보고서]줄기세포 기반 면역적합형 기능성 혈관재생 기술개발 및 허혈성 질환 치료 적용

한명관

줄기세포 기반 면역적합형 기능성 혈관재생 기술개발 및 허혈성 질환 치료 적용
Development of immune compatible stem cell therapy for vascular regeneration and its application for ischemic diseases 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	전북대학교 Chonbuk National University
연구책임자	한명관
참여연구자	이태희 , 송은경 , 이병선 , 박경순 , 서원희 , 송선화 , 안희진 , 임지은 , 김원 , 이수홍 , 차병현 , 권대기 , 안종찬 , 신정욱 , 정성훈 , 안혜린 , 이정은 , 현진숙 , 이애신 , 김영미 , 정유진 , 김달 , 문보경 , ARAI YOSHIE , 권현정 , 강광식 , 박광숙 , 김진수
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2014-04
과제시작연도	2011
주관부처	보건복지부
사업 관리 기관	한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute
등록번호	TRKO201400016786
과제고유번호	1465009923
DB 구축일자	2014-09-20
키워드	유도만능줄기세포.혈관내피세포.혈관평활근세포.허혈성질환.혈관재생.induced pluripotent stem cells.vascular endothelial cells.vascular smooth muscle cells.ischemic disease.vascular regeneration.

초록 ▼

현재 허혈성 심혈관질환치료에 사용하고 있는 혈관내피전구세포만으로는 이식 후 장기간 혈액을 전달할 수 있는 안정적이며 기능적 혈관재생이 매우 어려움. 안정적이며 기능성 혈관을 형성하기 위해서는, 혈관평활근세포가 단층의 혈관내피세포만으로 구성된 발달 초기의 불안정한 혈관 외벽에 부착하여 혈관을 안정화시키며 혈관의 탄력성 부여하여 많은 혈류량을 전달할 수 있는 동맥신생 (Arteriogenesis)을 유도함으로 허혈성 혈관질환 환자에서 실질적으로 필요한 동맥신생을 위해서는 혈관내피전구세포와 평활근세포가 모두 필요함. 본 연구에서는 임상가능 유도 만능 줄기세포주를 확립하고 이를 이용하여 혈관내피세포와 혈관평 활근 세포로 분화한 후 이를 마우스 허혈성 모델에 적용하여 그 혈관 신생효과를 검증하고자 하였음
본 연구 결과로는
(1) Sandai virus에 의한 역분화 전사인자를 도입시켜 인간 피부세포로부터 임상적용가능한 유도만능 줄기세포 주 확립 및 배양법 개발하였고
(2) 유도 만능 줄기세포로부터 혈관내피세포 및 혈관평활근 세포로의 분화 프로토콜 개발하였고
(3) 줄기세포에서 분화된 혈관내피세포와 평활근 세포간 상호 작용을 규명하여 허혈성 질환 동물모델에서의 혈관재생을 최적화함.
(4) 임상이용 가능한 조건에 맞추어 줄기세포 추적기술로 SPIO labeling후 MRI molecular imaging, liposomal microbubble을 이용한 줄기세포 targeting법을 제시하여 임상에서 이용할 수 있는 가능성 제시함
(5) iPS에서 분화된 혈관내피세포를 다층 혈관 지지체에 파종 후 전임상 질환모델에 이식하여 다층 혈관지지체를 형태학적 변성 확인 및 혈관관련 유전자와 단백질을 검증하였음.
이러한 연구결과는 혈관혈류감소와 관련된 질환에서 줄기세포의 치료(세포치료 또는 cytokine치료)의 가능성 제시하고, 생체모방형 혈관조직재생은 혈관 질환에서 조직재생의 새로운 치료 방법으로 제시할 뿐 아니라 혈관질환의 새로운 병태생리기전을 제시하여 치료의 실마리를 제공 할 수 있음

Abstract ▼

Results
(1) We established the derivation of clinically applicable induced pluripotent stem cells from human somatic cells and development culture method of them
(2) We established the protocol for differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells into vascular cells. We also established the reporter stem cell line that contains the engineered human CD34 BAC plasmid to chase the vascular differentiation of pluripotent stem cells
(3) We found out that the paracrine interaction between endothelial and vascular smooth muscle cells derived from pluripotent stem cells substantially contributes to the vascular regeneration and tissue repair in ischemic wound model, which shows that cotransplantation of endothelial and vascular smooth muscle cells derived from induced pluripotent stem cells may be feasible as a new autologous cell therapy for ischemic vascular diseases
(4) We demonstrated a new method of MRI image after SPIO labeled stem cells injection and developed liposome microbubble to targeting stem cells.
(5) In vivo vital microscopy and liposomal bubble were used to evaluate the function and structure of blood vessels.
(6) The desired scaffolds for bio-blood vessels made of bio-degradable polymers with high elasticity were successfully fabricated. The potential of the scaffolds was confirmed through the experiments utilizing a bioreactor with seeded stem cells. Especially the alignment of cell inside the vessels was observed, which is comparable with that in human body.
(7) We assess the function or structure of vascular graft supporter treated with differentiated endothelial cells in animal model.

목차 Contents

표지 ... 1
제출문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
요약문 ... 5
SUMMARY ... 6
6.1 총괄연구개발과제의 연구성과 실적 및 향후 계획 ... 7
6.2 연구성과 유형별 세부 내역 ... 8
7. 참여연구원 현황표 ... 10
I. 총괄현황 ... 11
II. 총괄연구과제 연구결과 ... 12
1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 13
2. 국내외 기술개발 현황 ... 18
3. 연구개발과제의 추진체계 ... 23
4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 24
5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 70
6. 향후 연구성과 추진 계획 ... 74
7. 연구개발결과의 파급효과 ... 74
8. 연구개발결과의 활용계획 ... 76
9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 78
10. 참고문헌 ... 78
IV.제1 세부연구과제 ... 79
1. 연구개발과제의 목표 ... 80
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 84
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 86
4. 참고문헌 ... 121
IV.제2세부연구과제연구결과 ... 123
1. 연구개발과제의 목표 ... 124
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 129
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 130
IV.제3세부연구과제연구결과 ... 156
1. 연구개발과제의 목표 ... 158
2. 연구개발과제의 추진체계 ... 164
3. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 166
4. 참고문헌 ... 222
끝페이지 ... 227

표/그림 (200)

표 혈관기능저하로 인해 발생하는 난치성 허혈성 혈관질환.
표 혈관내피전구세포에 의한 혈관신생 및 손상된 혈관의 복구
표 면역적합성 줄기세포 기반 생체모방형 혈관의 제작 및 혈관재생에의 활용 개념도
표 유전자 도입을 통한 유도만능줄기세포 제작 도표
표 Sickle cell anemia 치료 동물모델
표 TGF beta 신호계를 억제하는 화합물인 SB-431542의 처리에 의해 배아줄기세포로부터 혈관내피세포로의 분화가 촉진됨
표 Angiopoietin-1 과발현 중간엽줄기세포의 wound healing 효과를 epidermis 재생과 CD31(+) 세포의 형성정도로 분석함.
표 Effects of circulatory cells (CAC) and cardiac cell (CSC) transplantation on ventricular scar after left anterior descending ligation (A) Representative histology images from each stem cell treatment 28 days after myocardial infarction demonstrating scar burden using Masson trichrome satin. (B) Quantification of the scar tissue present in the left ventricle (LV) 28 days after myocardial infarction.
표 The effect of MMS on p53 acetylation and Gadd45a expression. Wild or SIRT1- / - mESCs were treated with 1 mM for 1 h. p53 acetylation and Gadd45a expression levels were determined by western blot analysis using anti- acetyl p53 (Lys379)and anti- Gadd45a antibodies.
표 The effect of SIRT1 knockout in the expression of p53 or NF- κB target genes during the differentiation of mESC into EB. p53 or NF- κB target genes were mapped to expression ratios for mESC differentiated for 5 day versus undifferentiated ESC. Shown is the distribution of log2- transformed ratios for the p53 or NF- κB target genes that show differential expression more than 1.148 fold in both directions.
$No effect of SIRT1 on hypoxia- induced nuclear translocation of NF- κB. Wild- and SIRT1 knockout mESC were cultured for 24 hr with complete medium under normoxia (20% oxygen) or hypoxia (5%). Cytoplasmic and nuclear fractions were prepared for NF- κ B western blotting. The same blot was probed for β- actin (a control for cytoplasmic fractionation) and TBP (a control for nuclear fractionation).$ 표 No effect of SIRT1 on hypoxia- induced nuclear translocation of NF- κB. Wild- and SIRT1 knockout mESC were cultured for 24 hr with complete medium under normoxia (20% oxygen) or hypoxia (5%). Cytoplasmic and nuclear fractions were prepared for NF- κ B western blotting. The same blot was probed for β- actin (a control for cytoplasmic fractionation) and TBP (a control for nuclear fractionation).
표 사람 평활근세포로 부터 역분화 유도만능줄기세포주 유도.
표 수립한 유도만능줄기세포의 분화능
표 혈관내피전구세포에서 역분화 유전자 발현
표 사람지방줄기세포 분리 및 역분화 유전자 발현 조사
표 PTD- 전사인자 발현 및 정제
표 PTD- 전사단백질 도입에 의한 사람유도만능줄기세포 제작
표 SMC, SES- 8, SES8- SMC, H9에서 신호전달 관련 단백질의 비교분석
표 평활근세포로부터 유도만능줄기세포 제작 및 평활근세포 재분화 모식도
표 리포터 평활근세포주에서 역분화인자에 의한 Sox2- RFP 발현
표 293 세포주에서 western blot에 의한 렌티바이러스 발현조사
표 Stat- 3 함유 리포터 평활근세포주에서 역분화인자에 의한 Sox2- RFP 발현
표 Tet inducible vector system. 왼쪽, Gentarget company: 오른쪽, Jaenisch lab
표 iOKSM inducible 평활근세포에서 c- Myc 단백질 발현의 세포염색
표 유도만능줄기세포의 분화능 조사. left panel, RT- PCR: right panel, H&E staining
표 제작된 유도만능줄기세포의 핵형조사
표 Version- 1 센다이바이러스 이용 HDF에서 리프로그래밍
표 센다이바이러스에 의한 역분화유전자 발현 경로
표 Version- 2 센다이바이러스에 의해 제작된 유도만능줄기세포주에서 세포염색법에 의한 단백질 발현 조사
표 CPT 와 cytokine에 의한 임상등급 유도만능줄기세포 배양 비교
표 SRT1720 처리에 의한 리프그램밍 효율 측정 모식도
표 SRT1720의 리프로그램밍 증대 효과
표 SRT1720 처리 역분화 유도만능 줄기세포의 배아줄기세포 특이표식인자 Live Cell Imaging. 배아줄기세포를 살아있는 상태에서 anti- TRA- 1- 82과 anti- SSEA4를 염색하여 형광 현미경으로 촬영함
표 in vitro에서 Embryonic Body(EB) 형성을 통한 유도만능줄기세포의 삼배엽 분화를 형광면역염색으로 확인(endoderm: Foxa2, Sox17, mesoderm: SMA & Desmin, ectoderm: Tuj1, Nestin)
표 Nanog promoter의 DNA methylation state. 검정색원은 methylation된 CpG
표 인간배아줄기세포 분화 과정중의 CD34 발현 세포 분석
표 Dox- inducible 생쥐 유도만능 줄기세포주로의 CD34 BAC plasmid 도입
표 (A) 리포터 유도만능줄기세포의 분화초기 (D7)과 분화 후기 (D24)에 형성된 분화세포 모양 (B) 분화초기와 분화 후기세포에서 발현되는 마커의 RNA 수준을 배아줄기세포와 혈관내피세포를 대조군으로 하여 분석함 (C) 분화후기 세포에서 CD34의 활성화에 의한 형광 발현과 immunocytochemical staining에 의한 VE- cadherin의 발현을 관찰함
표 Spry1 발현정도에 따른 혈관내피세포 분화 정도 분석
표 Tcea3 저발현세포주의 VE- cadherin (+)세포로의 분화 촉진과 TGF beta 신호억제제인 SB- 431542처리에 의한 VE- cadherin (+)세포 분화 억제를 immunocytochemical staining으로 확인함. Tcea3KD에서의 VE- cadherin 발현세포 분화효율 정도를 FACS로 분석한 결과 대조군 대비 40% 증가함을 확인함
표 인간배아줄기세포 (H9) 및 유도만능줄기세포(SES8) 유래 혈관내피전구세포 및 혈관평활근세포의 분화 확인.
표 인간배아줄기세포 (H9) 및 유도만능줄기세포(SES8) 유래 혈관내피세포 및 혈관평활근세포의 상호작용 분석.
표 Angiogenic secretome profiles. A) Angiogenesis proteome profiler array system. B) mRNA level of VEGF, EGF, FGF- 4. C) 혈관평활근세포의 이동능
표 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포에서 ROS 증가. (A) 인간배아줄기세포의 중배엽 분화시 ROS 증가. (B) 분화 15일 째에 anti- CD34와 H2DCFDA의 염색을 통하여 CD34 양성 세포가 ROS를 유발하는 것을 확인함.
표 Selenium에 의한 인간배아줄기세포의 혈관전구세포, 혈관세포로의 분화 증가 (A) 인간배아줄기세포의 분화과정 동안 selenium에 의한 배아줄기세포 특이 유전자(Oct4, Nanog), 중배엽 특이 유전자(KDR, CD34), 외배엽 특이 유전자(PAX6, Nestin), 내배엽 특이유전자(Sox17, GATA6)의 유전자 발현 조사. (B) selenium에 의한 중배엽(CD34), 외배엽(β- III tubulin), 내배엽(AFP)의 protein 발현을 immucocytochemistry로 확인함.(C) 인간배아줄기세포의 혈관내피세포 (PECAM, VE- cadherin) 및 혈관평활근세포 (SMA, Myocardin)로의 분화를 RT- PCR로 조사. (D- E) 인간배아줄기세포 분화 15일에서 selenium에 의한 혈관내피 세포 (CD31, VE- cadherin) 및 혈관평활근세포 (SMA, SM22a)로의 분화를 immucocytochemistry (D) 및 FACS (E)로 확인함.
표 인공전사인자 F435는 지방줄기세포의 VEGF 유전자를 활성화시킬 수 있음 (A) VEGF 항체를 이용한 지방줄기세포 면역염색법 (B) 지방줄기세포 배양시간별 VEGF 분비 량 측정. EV: empty vector로 형질전환된 지방줄기세포, F435: F435 인공전사인자로 형질전 환된 지방줄기세포.
표 F435 형질전환 지방줄기세포에 의한 HUVEC 세포의 tube formation 형성능 증가 (A) Matrigel에서의 tube formation 형성능 분석 (B) branches 형성정도에 대한 정량분석 CM: conditioned media
표 Tcea3 저발현 배아줄기세포에서 chimeric embryo를 형성한 결과, 대조군에 비해 혈관조직이 비정상적으로 과다하게 형성된 것을 확인함
표 MR image obtained 7 days after intramuscular injection of labeled mESCs with SPIO- PLL complex shows multiple tiny dark signals, which means SPIO- PLL labeled mESCs, surrounded by bright signal intensity (arrows). Swelling and diffuse increased signal intensity of the left buttock and thigh may be caused by cells injection.
표 A. Findings of Doppler ultrasonography in control mice demonstrates that there is positive Doppler signals in right femoral artery after microbubble injection. B. Findings of ultrasonography in control mice demonstrates that there is microbubble in right femoral artery after microbubble injection. C. Doppler ultrasonographic findings in control mice shows that there is positive Doppler signals in left femoral artery but, no Doppler signals after ligation of right femoral artery after microbubble injection. Arrows in panel A indicate normal femoral arterial flow in A, small arrows in panel B indicates microbubble in femoral artery and arrow heads in panel C indicates no Doppler signals in femoral artery.
표 DiO와 DiD로 labeling된 fibroblast가 부착된 fiber sheet를 이용하여 tube 타입으로 제조된 인공 혈관을 공초점 현미경을 사용한 사진. 세포가 부착되어 다중층을 이루고 있음.
표 왼쪽 사진은 native 돼지 혈관의 SEM 단면 사진. 오른쪽 사진은 세포가 부착된 fiber sheet를 이용하여 튜브 모양으로 제작한 인공 혈관의 단면 사진. 확대된 이미지에서 단면은 fiber 형태로 되어있음을 확인할 수 있고, 면과 면 사이에 세포가 부착되어 있음을 확인할 수 있음.
표 Immunofluorescence staining results of SMA and PECAM in implanted PTFE scaffold (Scale bar: 100 μm).
표 Immunofluorescence staining results of IL- 1β in implated PTFE scaffold (Scale bar: 100 μm).
표 동물 실험을 통해 얻어진 두 그룹의 지지체의 H&E staining image (A)와 내부에 coating된 세포의 두께 (B)
표 두 그룹에 존재하는 endothelial cell을 확인한 이미지. (A) Endothelial cell marker인 CD31/PECAM- 1 positive cell (흰색 화살표)이 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 많은 세포가 확인 됨. (B) Smooth muscle cell marker인 SMA positive cell (흰색 화살표)이 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 많은 세포가 확인 됨.
표 이식한 분화된 내피세포의 생존 확인을 위하여 human nuclei antigen staining을 수행 후 이미지. Control에 비해 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 보다 많은 rabbit cell을 recruitment 하였음 (검은색 화살표). Control 그룹에서는 rabbit 세포만이 확인 되는데 반해서 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서는 지지체 내와 안쪽 면에 human nuclei antigen positive cel이 염색됨을 확인 함 (흰색 화살표).
표 두 그룹에서 염증관련 marker인 TNF- α의 발현 양상.
표 두 그룹의 지지체 내에 존재하는 rabbit cell을 이용한 RT- PCR 결과.
표 다양한 만능줄기세포 제조방법
표 네가지 역분화 전사인자 도입에 의한 역분화 유도만능줄기세포 제조의 도식
표 Expression of Cx43 in hESCs and hASCs. The expression of endogenous Cx43 in hESCs and hASCs was confirmed by qRT- PCR (A) and Western blot analysis (B). Expression of OCT4 (red) and Cx43 (green) in hESCs and hASCs was observed by immunocytochemistry (C). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). The arrow head indicates the expression of endogenous Cx43 in hESCs adjacent to hASCs (arrow). The white box indicates the Cx43 expression at the border line. All data are shown as the mean 6 the standard deviation (SD) (n = 4; # , p.0.05; * , p,0.05). Scale bar, 100 mm.
표 GJIC between hESCs and hASCs. Functional gap junction channels were detected by the scrape loading/dye transfer assay for hASCs cultured alone and with hESCs. Phase contrast (A(a- c), B(a- c), C(a,b)), Lucifer yellow (A(d- f), B(d- f), C(c,d)) and rhodamine- dextran (A(g- i), B(g- i), C(e,f)) of hASCs and hESCs are shown. A scrape was made across the monolayer to allow the uptake of Lucifer yellow by the wounded cells. The dye was then transferred from the wounded cells to the adjacent, intact cells via functional gap junction channels. Lucifer yellow dye transfer was shown from hASCs to adjacent hASCs (A(e,f)); hESCs to adjacent hESCs (B(e,f); and hASCs to adjacent hESCs (C(c,d)). No- scrape group was employed as the normal conditions (A(d) and B(d)). Rhodamine- dextran was used as a negative control, showing no dye transfers from the wounded cells to neighbouring cells (A(h,i), B(h,i), C(e,f)). The black and white arrows indicate the scraped cells and the hESC colonies, respectively. The white dotted lines show the boundary between the hASCs and hESC colony. Scale bar, 100 mm.
표 Effect of Cx43 down- regulation on hESC stemness. Down- regulation of Cx43 and stemness gene (OCT4, SOX2, and NANOG) expression in Cx43- siRNA- treated hESCs was confirmed by qRT- PCR after 2 days culture (A) and Western blot analysis after 4 days culture (B). The percentage of AP- positive colonies formed by hESCs following Cx43- siRNA treatment was significantly lower than the percentage of AP- positive colonies formed by hESCs following control or scrambled- siRNA treatment (C). Immunocytochemical analysis demonstrated that OCT4 and Cx43 protein expression was reduced in Cx43- siRNA- treated hESCs versus control or scrambled- siRNA- treated hESCs (D). (C) and (D) were evaluated after 5 days culture. All data are shown as the mean 6 the SD (n = 4; * , p,0.05). Scale bar, 100 mm.
표 siRNA- mediated downregulation of Cx43 in hASCs. The time- dependent, siRNA- mediated downregulation of Cx43 in hASCs was investigated by qRT- PCR (A) and Western blot analysis (B). Immunocytochemical analysis confirmed the Cx43 downregulation in hASCs after 3 days of siRNA treatment (C). Nuclei were counterstained with DAPI. All data are shown as the mean 6 the SD (n = 4; * , p,0.05). Scale bar, 100 mm.
표 Schematic diagram of Cx43- siRNA treatment method. To downregulate Cx43 expression in hASC feeder cells, hASCs were seeded at 2.16105 cells per 60 mm tissue culture plate before 24 h. hASCs were washed with PBS and then treated with scrambled- siRNA or Cx43- siRNA and cultured for 24 h. Twenty- four hours after transfection, hESCs clumps were transferred onto siRNA treated hASC feeder cells and maintained for 5 days.
표 Culture of hESCs on Cx43 siRNA- treated hASCs. Compared with treatment of hASCs with control or scrambled- siRNA, the Cx43- siRNA treatment of hASC feeder cells did not alter adhesion (A), colony growth (n = 20; B), gene expression (i.e., OCT4, SOX2, and NANOG) (C), AP positive colony numbers (D), OCT4 expression (E), or chromosomal stability (F) of co- cultured hESCs. Nuclei were counterstained with DAPI (E). All data are shown as the mean 6 the SD. (n = 4; # , p.0.05). Scale bar, 100 mm.
표 The effect of SIRT1 knockout in the expression of p53 or NF- κB target genes during the differentiation of mESC into EB. p53 or NF- κB target genes were mapped to expression ratios for mESC differentiated for 5 day versus undifferentiated ESC. Shown is the distribution of log2- transformed ratios for the p53 or NF- κB target genes that show differential expression more than 1.148 fold in both directions.
표 The effect of MMS on p53 acetylation and Gadd45a expression. Wild or SIRT1- / - mESCs were treated with 1 mM for 1 h. p53 acetylation and Gadd45a expression levels were determined by western blot analysis using anti- acetyl p53 (Lys379)and anti- Gadd45a antibodies.
$No effect of SIRT1 on hypoxia- induced nuclear translocation of NF- κB. Wild- and SIRT1 knockout mESC were cultured for 24 hr with complete medium under normoxia (20% oxygen) or hypoxia (5%). Cytoplasmic and nuclear fractions were prepared for NF- κ B western blotting. The same blot was probed for β- actin (a control for cytoplasmic fractionation) and TBP (a control for nuclear fractionation).$ 표 No effect of SIRT1 on hypoxia- induced nuclear translocation of NF- κB. Wild- and SIRT1 knockout mESC were cultured for 24 hr with complete medium under normoxia (20% oxygen) or hypoxia (5%). Cytoplasmic and nuclear fractions were prepared for NF- κ B western blotting. The same blot was probed for β- actin (a control for cytoplasmic fractionation) and TBP (a control for nuclear fractionation).
표 사람 평활근세포로 부터 역분화 유도만능줄기세포주 유도
표 수립한 유도만능줄기세포의 분화능
표 혈관내피전구세포에서 역분화 유전자 발현
표 사람지방줄기세포 분리 및 역분화 유전자 발현 조사
표 PTD- 전사인자 발현 및 정제
표 PTD- 전사단백질 도입에 의한 사람유도만능줄기세포 제작
표 SMC, SES- 8, SES8- SMC, H9에서 신호전달 관련 단백질의 비교분석
표 평활근세포로부터 유도만능줄기세포 제작 및 평활근세포 재분화 모식도
표 리포터 평활근세포주에서 역분화인자에 의한 Sox2- RFP 발현
표 293 세포주에서 western blot에 의한 렌티바이러스 발현조사
표 Stat- 3 함유 리포터 평활근세포주에서 역분화인자에 의한 Sox2- RFP 발현
표 Tet inducible vector system. 왼쪽, Gentarget company: 오른쪽, Jaenisch lab
표 iOKSM inducible 평활근세포에서 c- Myc 단백질 발현의 세포염색
표 유도만능줄기세포의 분화능 조사. left panel, RT- PCR: right panel, H&E staining
표 제작된 유도만능줄기세포의 핵형조사
표 Version- 1 센다이바이러스 이용 HDF에서 리프로그래밍
표 센다이바이러스에 의한 역분화유전자 발현 경로
표 Version- 2 센다이바이러스에 의해 제작된 유도만능줄기세포주에서 세포염색법에 의한 단백질 발현 조사
표 CPT 와 cytokine에 의한 임상등급 유도만능줄기세포 배양 비교
표 SRT1720 처리에 의한 리프그램밍 효율 측정 모식도
표 SRT1720의 리프로그램밍 증대 효과. 그림 29처럼 0- 200 nM SRT1720 처리한 후 리프로그램밍을 한 후 20 일 후 alkaline phosphatase staining을 실시함.
표 SRT1720 처리 역분화 유도만능 줄기세포의 배아줄기세포 특이표식인자 Live Cell Imaging. 배아줄기세포를 살아있는 상태에서 anti- TRA- 1- 82과 anti- SSEA4를 염색하여 형광현미경으로 촬영함
표 in vitro에서 Embryonic Body(EB) 형성을 통한 유도만능줄기세포의 삼배엽 분화를 형광면역염색으로 확인(endoderm: Foxa2, Sox17, mesoderm: SMA & Desmin, ectoderm: Tuj1, Nestin)
표 Nanog promoter의 DNA methylation state. 검정색원은 methylation된 CpG nucleotide 하얀색원은 demethylation된 CpG nucleotide를 나타냄.
표 하지혈관폐색이 관찰되는 버거씨 질환
표 혈관내피전구세포에 의한 혈관신생 및 손상된 혈관의 복구
표 인간배아줄기세포의 혈관세포로의 분화 모식도
표 인간배아줄기세포 분화 과정중의 혈관/혈액 분화 관련 유전자 발현 변이 분석
표 인간배아줄기세포 분화 과정중의 CD34 발현 세포 분석
표 인간배아줄기세포주로의 CD34 BAC plasmid 도입
표 B- cell leukemia, IM- 9으로의 CD34 BAC plasmid 도입
표 Dox- inducible 생쥐 유도만능 줄기세포주로의 CD34 BAC plasmid 도입
표 (A) 리포터 유도만능줄기세포의 분화초기 (D7)과 분화 후기 (D24)에 형성된 분화세포 모양 (B) 분화초기와 분화 후기세포에서 발현되는 마커의 RNA 수준을 배아줄기세포와 혈관내피세포를 대조군으로 하여 분석함 (C) 분화후기 세포에서 CD34의 활성화에 의한 형광 발현과 immunocytochemical staining에 의한 VE- cadherin의 발현을 관찰함
표 Spry1 과발현 또는 저발현 배아줄기세포주 제작
표 Spry1 발현정도에 따른 혈관내피세포 분화 정도 분석
표 (A) Tcea3를 안정적으로 과발현하거나 또는 저발현하는 배아줄기세포주를 제작하고 Tcea3, Oct4, p- Stat3의 발현 정도를 immunoblot으로 분석함. (B) Tcea3 과발현 또는 저발현 배아줄기세포주에 retinoic acid (RA)를 처리함으로써 무작위적으로 분화하였을 때 Tcea3의 저발현 세포주가 빠르게 분화함을 확인함
표 Tcea3 과발현 배아줄기세포는 대조군에 비해 현저하게 Teratoma 형성능이 떨어졌지만, Tcea3 저발현 배아줄기세포는 대조군에 비해 Teratoma 형성이 빠르게 진행됨을 확인함
표 Tcea3 테라토마에서 외배엽, 중배엽, 내배엽 분화마커의 발현양상을 realtime RT- PCR 방법으로 대조군과 비교 분석한 결과
표 Tcea3 과발현 및 저발현 배아줄기세포를 in vitro에서 mesoendoderm으로 분화한 후 중배엽과 내배엽 분화마커의 발현양상을 realtime RT- PCR 방법으로 대조군과 비교하여 분석함.
표 Tcea3 과발현 및 저발현세포주에서 Tcea3가 Lefty1 유전자의 transcription initiation site에 결합하는 정도를 chromatin immunoprecipitation 방법을 통해 대조군과 비교 분석함
표 Tcea3 과발현 배아줄기세포의 유전자 발현양상을 microarray로 분석한 결과, TGF beta 신호계 조절자인 Lefty1을 활성화시킴을 확인함
표 Tcea3의 과발현이 Smad의 배아줄기세포의 핵내 발현을 억제한다는 것을 immunocytochemical 염색법으로 확인하고, Tcea3의 저발현이 Smad의 인산화를 유도함을 immunoblotting으로 확인함
표 Tcea3의 과발현이 Smad1/5의 인산화에 미치는 영향을 immunoblot으로 확인함
표 Tcea3 저발현세포주의 VE- cadherin (+)세포로의 분화 촉진과 TGF beta 신호억제제인 SB- 431542처리에 의한 VE- cadherin (+)세포 분화 억제를 immunocytochemical staining으로 확인함. Tcea3KD에서의 VE- cadherin 발현세포 분화효율 정도를 FACS로 분석한 결과 대조군 대비 40% 증가함을 확인함
표 Tcea3 저발현 배아줄기세포에서 chimeric embryo를 형성한 결과, 대조군에 비해 혈관조직이 비정상적으로 과다하게 형성된 것을 확인함
표 인간배아줄기세포 (H9) 및 유도만능줄기세포(SES8) 유래 혈관내피전구세포 및 혈관평활근세포의 분화 확인.
표 인간배아줄기세포 (H9) 및 유도만능줄기세포(SES8) 유래 혈관내피세포 및 혈관평활근세포의 상호작용 분석
표 인간배아줄기세포 (H9) 및 유도만능줄기세포(SES8) 유래의 혈관내피세포와 혈관평활근세포의 주변분비에 의한 상호작용.
표 Angiogenic secretome profiles
표 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포에서 ROS 증가.
표 인간배아 줄기세포 유래 혈관전구세포에서 과발현되는 NOX4에 의해서 ROS 증가.
표 Selenium에 의한 인간배아줄기세포의 혈관전구세포, 혈관세포로의 분화 증가
표 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포 및 혈관평활근세포의 cotransplantation은 in vivo neovascularization을 촉진함.
표 유도만능줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포 및 혈관평활근세포의 cotransplantation은 ischemic wound healing 을 촉진함
표 인공전사인자 F435는 지방줄기세포의 VEGF 유전자를 활성화시킬 수 있음
표 F435 형질전환 지방줄기세포에 의한 HUVEC 세포의 tube formation 형성능 증가
표 20- 64세 성인의 만성 질환 유병율 (%). 국민건강영양조사 ‘98, ’01, ‘05년; 만성 질환 유병율: 고혈압, 당뇨병, 이상지혈증, 비만 중 1가지 이상 질환을 가진 성인의 비율
표 난치성 만성 혈관 질환에서 줄기세포를 이용한 치료 전략
표 Schematic diagram of SPIO and PLL to use in magnetically cell probe imaging.
표 Structure of Bubble liposome (yellow circle: Perfluoropropane gas)
표 제3부과제에서 실시하고자 하는 계획
표 MRI 소견. MRI 조영제인 gadolinium (Gd)을 ICAM- 1 antibody와 같이 conjugation시켜 서 Gd- anti- ICAM- 1 antibody를 만든 후에 정상 (A)와 관절에 염증이 있을 때 (B) 촬영한 MRI소견. ICAM- 1 antibody가 염증이 있는 관절에 binding하는 것(화살표)을 MRI로 관찰
표 Prussian blue stain of human umbilical vein endothelial cells after transfection with ferumoxide and PLL complex. Cells incubated with PLL for 24 hours. Magnification, 1,000X
표 Vital microscopic finding of renal surface microcirculation in kidney after ischemia reperfusion injury.
표 Biotin- conjugated bubble에 대한 위상차현미경 소견(A)과 bubble- biotin - streptoavidin- biotin- antibody
표 Blood urea nitrogen (A) and serum creatinine levels (B) after IRI in immunodeficient nude mice. Blood and tissue sample were collected 2 and 5days after IRI. (C) Sections of kidney were stained with periodic acid- Schiff after IRI operation. The IRI kidneys showed marked injury with sloughing of tubular epithelial cell, loss of the brush border, and dilatation of the tubules. scale bar, 50um.
표 Bubble을 관찰한 초음파소견. 배양접시위에서 자란 제대정맥 내피세포에서 흰색으로 bubble이 관찰.
표 Scheme of mimic vascular structure
표 8. Manufacture of melt- electrospining system. (A1 and 2) Whole melt- electrospinnig system. (B and C) Precision fluid metering pump (green box), melt spinning system (red box) and collector (blue box).
표 SEM images of porcine cellular artery (A) and acellular artery (B)
표 Fabrication of nanofibrous sheets and tube from poly(lactic acid co-ε-caprolactone) (PLCL)
표 Manufacture of teflon mold for the vascular type scaffolds
표 Findings of Doppler ultrasonography in control and hind limb ischemic model. Arrows indicate normal femoral arterial flow and arrow heads indicate no Doppler signals in femoral artery.
표 A. Findings of Doppler ultrasonography in control mice demonstrates that there is positive Doppler signals in right femoral artery after microbubble injection. B. Findings of ultrasonography in control mice demonstrates that there is microbubble inright femoral artery after microbubble injection. C. Doppler ultrasonographic findings in control mice shows that there is positive Doppler signals in left femoral artery but, no Doppler signals after ligation of right femoral artery after microbubble injection. Arrows in panel A indicate normal femoral arterial flow in A, small arrows in panel B indicates microbubble in femoral artery and arrow heads in panel C indicates no Doppler signals in femoral artery.
표 Immunohistochemistry of Rat endothelial cell antigen (RECA)- 1 (A- C) and PECAM- 1(D). RECA- 1, rat endothelial cell specific marker, is expressed in heart (A), Liver (B), Kidney (C) arteriole. PECAM- 1, platelet/endothelial cell adhesion molecule- 1, is expressed in kidney arteriole (D).
표 (A) Electrospinning system (B) side view of rotating collecting target (C) servo motor controller (D) cam controller
표 전기 방사 후 SEM 촬영 결과. (A) 10%(w/ v) PLCL (B) 13%(w/ v) PLCL
표 Photograph of the PLCL tubular type construct.
표 Tubular type의 PLCL electrospun nanofiber 스케폴드의 SEM 촬영 결과. (A) entire construct (x20) (B) cross- sectional morphologies (x40) (C- D) outer surface (C: x25, D: x100) (E- F) inner surface (E: x200, F: x500)
표 다양한 조건에서의 방사된 PLCL의 SEM 사진 (왼쪽부터 condition 1, 5, 8)
표 전기 방사법을 이용하여 PLCL을 fiber sheet형태로 제작하였고 (왼쪽) fiber sheet 후에 fibroblast를 부착한 후 SEM 사진 (오른쪽).
표 소수성으로 인한 낮은 세포 부착율을 극복하기 위해 fibrin glue를 이용하여 fiber sheet를 친수성 및 세포친화력이 강한 fibrin으로 코팅하였고 (왼쪽) 코팅된 fiber sheet에 fibroblast를 부착시킨 후 SEM 사진 (오른쪽).
표 Fibrin 코팅된 fiber sheet와 코팅되지 않은 fiber sheet에 fibroblast를 접종 24시 간 후 fibroblast의 부착율을 비교 하였음. 코팅된 fiber sheet 위에서 세포 부착율은 90% 코팅되지 않은 fiber sheet에서의 세포 부착율은 34%로 코팅했을 때 세포의 부착율이 크게 상승하였음.
표 CCK- 8 kit를 이용한 fiber sheet위에서 fibroblast의 세포 성장률.
표 다중층 혈관 모양을 제작하기 위한 모식도.
표 DiO와 DiD로 labeling한 fibroblast를 fibrin이 코팅된 fiber sheet에 접종하고 7일간 배양한 후에 SEM과 공초점 현미경으로 관찰함.
표 DiO와 DiD로 labeling된 fibroblast가 부착된 fiber sheet를 이용하여 tube 타입으로 제조된 인공 혈관을 공초점 현미경을 사용한 사진. 세포가 부착되어 다중층을 이루고 있음.
표 왼쪽 사진은 native 돼지 혈관의 SEM 단면 사진. 오른쪽 사진은 세포가 부착된 fiber sheet를 이용하여 튜브 모양으로 제작한 인공 혈관의 단면 사진. 확대된 이미지에서 단면은 fiber 형태로 되어있음을 확인할 수 있고, 면과 면 사이에 세포가 부착되어 있음을 확인할 수 있음.
표 Scheme of differention from mESC to endothelial cells.
표 (A) Prussian blue stain of mouse ESC after incubation with SPIO (feridex? and PLL complex. Cells incubated with PLL for 12 hours. SPIO particles with dark blue color were accumulated in cells (400X). (B- D) T2- weighted MRI images of the buttock and thigh using 4.7T MR. (B) Male mice (8 weeks old) were anesthetized with ketamine and xylazine. Left inguinal lesion was dissected with animal microscopy (5X). Left common femoral artery was ligated with black silk (4.0) 1 cm apart and femoral artery was excised between ligation. Left buttock and thigh shows slight increased signal intensity because of mild ischemic inflammation. (C) SPIO- PLL labeled stem cells were injected to mouse by tail vein (2X106 cell). MR image shows no specific changes in the left ischemic buttock and thigh. SPIO- PLL labeled stem cells might not be inoculated into the ischemic muscle by intravenous injection. (D) Mice were injected in 3 places with SPIO- PLL labeled ESCs. Injections were applied as follows: 2X106 labeled cells were intramuscularly injected in the buttock, mid portion of the thigh, and in the calf area. MR image obtained 7 days after intramuscular injection of labeled mESCs with SPIO- PLL complex shows multiple tiny dark signals, which means SPIO- PLL labeled mESCs, surrounded by bright signal intensity (arrows). Swelling and diffuse increased signal intensity of the left buttock and thigh may be caused by cells injection.
표 Tissue blood flow in left lower limb was measured with laser- Doppler ultrasonography 7 days after hindlimb ischemia. Male mice (8 weeks old) were anesthetized with ketamine. Left inguinal lesion was dissected with animal microscopy (50X). Left common femoral artery was ligated with silk (4.0) 1 cm apart and femoral artery was excised between ligation. mESCs were injected to mouse by tail vein (2X106 cell). Mice were injected in 3 places with mESC. Injections were applied as follows: 1x106 labeled cells were intramuscularly injected in mid portion of thigh, in lower portion of thigh and in calf area. Measurement was performed from mid portion and lower portion of thigh and mid portion of leg of mice. Data are means?SD. n=4 in each group. * * , vs normal without ischemia; # , vs hindlimb ischemia + control buffer
표 Compliance testing for the tubular- shaped scaffold
표 Compliance test. The changes of diameters of the PLCL aligned scaffold were measured at six different loading pressures. The initial diameters were divided by the diameters deformed by each pressure.
표 Photograph and schematic of the rotating system used for the MSCs seeding about speed of 1 rpm of the tubular scaffolds
표 Evaluation of cell attachment efficiency on the inner surface of the tubular- type construct through the MTT assay (n=5). (A) Cell adhesion rate, (B) Photograph of culture well and silicone tube
표 Pulsatile flow bioreactor for tissue engineered vascular graft culture. (A) A schematic of system design, (B) Image of the actual bioreactor system
표 F- actin reorganization of MSCs after shear stress stimulation of 2.5 and 10 dyne/ cm2. Rearrangements of cytoskeletons, morphology changes, and cell arrangements (F: flow direction). (Scale bar: 50um)
표 Image of chamber equipped with electropun scaffolds
표 Tissue blood ow in left lower limb was measured fl with laser- Doppler ultrasonography 7 days after hindlimb ischemia. Male nude or C57BL6 mice (8 weeks old) were anesthetized with ketamine. Left inguinal lesion was dissected with animal microscopy (50X). Left common femoral artery was ligated with silk (4.0) 1 cm apart and femoral artery was excised between ligation. human umbilical vein endothelial cell or differentiated endothelial cells were injected in mid portion of thigh. Measurement was performed from mid portion and lower portion of thigh and mid portion of leg of mice. Data are means?SD. n=4 in each group. * * , vs normal without ischemia; # , vs hindlimb ischemia + control buffer
표 Typical results of RT- PCR. MSCs were cultured in endothelial growth medium under static or shear stress conditions for 24h. (A) EC markers and (B) SMC markers (*p≤ 0.05).
표 The rotating system used for the MSCs seeding of the tubular scaffolds.
표 Immunofluorescence staining results of MSCs cultured on the inner surface with or without shear stress (Scale bar: 50 μm).
표 EC markers of MSCs were analyzed after applying the shear stress of 2.5 dyne/ cm2 for 4 days. (*p < 0.05)
표 SMC markers of MSCs were analyzed after applying the shear stress of 2.5 dyne/ cm2 for 4 days. (*p < 0.05)
표 Images of immunofluorescence staining: for 4 days at 2.5 dyne/ cm2 stimulation (Scale bar: 50 μm).
표 The qPCR results for EC and SMC markers of MSCs cultured on outer layers of the scaffolds and subjected for 3% stretch for 3 days followed by 5% stretch for 4 days. (*p < 0.05)
표 The qPCR results for EC and SMC markers of MSCs cultured on inner layers of the scaffolds and subjected for 3% stretch for 3 days followed by 5% stretch for 4 days. (*p < 0.05)
표 After the application of 5 % stretch, KDR and vWF expressions of MSCs cultured on the inner layer were analyzed and - SMA, α Caldesmon known as SMC specific makers were examined from MSCs on the outer layer of the scaffold.
표 Scheme diagram of the PLCL nanofiber fabrication process.
표 SEM images of the DiO (FITC) and DiD (Cy5) labeled cell
표 Immunofluorescence staining results of SMA and PECAM in implanted PTFE scaffold (Scale bar: 100 μm).
표 Immunofluorescence staining results of IL- 1β in implated PTFE scaffold (Scale bar: 100 μm).
표 Schematic diagram of electrospinning technique
표 Electrospinning system for fabrication of artificial vessel
표 FE- SEM images of a PLCL tubular scaffold with different magnification
표 Photograph of artificial tubular scaffold
표 FE- SEM images of a PU tubular scaffold
표 Photograph and schematic of the rotating system used for the MSCs seeding about speed of 1 rpm of the tubular scaffolds.
표 Evaluation of cell attachment efficiency on the inner surface of the PU or PLCL tubular scaffolds through the MTT assay (n=5).
표 Images of H&E staining
표 F- actin reorganization of ECs (x 100)
표 Images of immunofluorescence staining for detection of SMCs (x 100)
표 Images of immunofluorescence staining for detection of ECs (x 100)
표 소구경 혈관 (A)와 4',6- diamidino- 2- phenylindole (DAPI) 으로 염색한 후에 소구경 혈관에 coating된 사람의 재대정맥 내피세포의 형광현미경 사진.
표 A. Diagram of inferior vena cava. B. Inferior vena cava before interpositon of graft. The external diameter of inferior vena cava is about 5 mm. C. Explanted grafts just after surgery. There was no bleeding at the anastomotic sites and center of the grafts.
표 동물 실험을 통해 얻어진 두 그룹의 지지체의 H&E staining image (A)와 내부에 coating된 세포의 두께 (B)
표 이식한 분화된 내피세포의 생존 확인을 위하여 human nuclei antigen staining을 수행 후 이미지. Control에 비해 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 보다 많은 rabbit cell을 recruitment 하였음 (검은색 화살표). Control 그룹에서는 rabbit 세포만이 확인 되는데 반해서 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서는 지지체 내와 안쪽 면에 human nuclei antigen positive cel이 염색됨을 확인 함 (흰색 화살표).
표 두 그룹에 존재하는 endothelial cell을 확인한 이미지. (A) Endothelial cell marker인 CD31/PECAM- 1 positive cell (흰색 화살표)이 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 많은 세포가 확인 됨. (B) Smooth muscle cell marker인 SMA positive cell (흰색 화살표)이 분화된 내피세포를 coating한 그룹에서 많은 세포가 확인 됨.
표 두 그룹에서 염증관련 marker인 TNF- α의 발현 양상.
표 두 그룹의 지지체 내에 존재하는 rabbit cell을 이용한 RT- PCR 결과.

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줄기세포 기반 면역적합형 기능성 혈관재생 기술개발 및 허혈성 질환 치료 적용
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