초록 ▼

유산균은 GRAS균(General1y Recognized As Safe)으로 안전성과 함께 단백질을 세포밖으로 분비하는 분비기작을 가지고 있어, 유산균을 이용한 백신개발, 효소, 항균제등의 운반체 개발등의 연구가 심도있게 진행되고 있으며, 최근에는 생명공학기법을 이용하여 새로운 기능성을 가지는 유산균을 개발하려는 연구가 전 세계적으로 활발하게 시도되고 있다.
본 연구에서 추진한 식품유래 혈압강하 펩타이드 발현 유산균주 개발은 세계 최초의 시도이다. 식품에서 분리한 혈압강하 펩타이드를 생명공학기법을 이용하여 유산균용 벡터에 옮겨

유산균은 GRAS균(General1y Recognized As Safe)으로 안전성과 함께 단백질을 세포밖으로 분비하는 분비기작을 가지고 있어, 유산균을 이용한 백신개발, 효소, 항균제등의 운반체 개발등의 연구가 심도있게 진행되고 있으며, 최근에는 생명공학기법을 이용하여 새로운 기능성을 가지는 유산균을 개발하려는 연구가 전 세계적으로 활발하게 시도되고 있다.
본 연구에서 추진한 식품유래 혈압강하 펩타이드 발현 유산균주 개발은 세계 최초의 시도이다. 식품에서 분리한 혈압강하 펩타이드를 생명공학기법을 이용하여 유산균용 벡터에 옮겨 유산균에서 혈압강하 펩타이드를 발현시키는 실험을 수행하였다. 그 결과 생명공학기법을 이용해서 만들어진 혈압강하 펩타이드는 대장균에서 뿐만 아니라 유산균에서도 발현되는 것을 확인하였다. 유산균에서 혈압강하 펩타이드의 발현을 위해서 개발된 벡터가 균주내에서 안정적으로 목적 유전자를 발현시키는 것을 확인함으로써, 이 벡터의 다른 용도, 예를 들어 백신 운반체로서의 이용가능성을 확인하였다. 본 연구를 통하여 개발된 혈압강하펩타이드를 분비하는 기능성 유산균을 안전하고 예방의학적인 기능성을 갖는 신가능성 유산균제품의 개발에 이용하고자 한다. 또한, 본 연구를 수행하면서 확보하게 된 식품용 유산균 발현 시스템은 향후 유산균을 이용한 vaccine 개발, 여러 호르몬제의 장내 운반체등으로 이용될 수 있으므로, 개발된 시스템의 산업적 가치는 실로 대단하다.
한편, 유산균과 발효유의 항암효과와 혈압강하효과, 항동맥경화효과 등은 알려져 있으나, 활성이 높은 물질의 동정이나, 이를 기능성 소재로 이용하려는 시도는 거의 없었다.
따라서, 본 연구에서 다양한 유산균의 균체성분중 항암효과와 혈압강하, 항동맥경화등의 효과가 뛰어난 활성부분만을 분리,동정, 정제하여 건강 기능성 신소재로 개발하고,이를 식품산업에 이용한 것은 대단한 가치가 있다고 할 수 있다.
본 연구에서는 유산균에서 항암 활성을 보이는 성분을 분리하고자 다음의 10가지 유산균들을 배양하였다 ; Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casel, Lactobacillus plantarum, Lactococαcus lactis lactis, Lactococcus lactis ssp cremoris, Streptococcus thermophillus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis. 배양한 유산균에서 유산균 세포들만을 분리한 뒤에, 유산균 세포들을 cell wall 분획과 cytoplasm 분획으로 각각 나누었다.
그 중 10가지 유산균들의 cytopasm 분획들을 가지고 인간유래 암세포주 11종에 대하여 ³H-thymidine uptake의 방법으로 세포독성 실험을 수행하여 항암활성을 분석한 동시에 ACE 반응계에 첨가한 후, ACE 저해 활성을 조사하였다. 그 결과 인간 유래 세포주중 SNU1에 대하여 Lactococcus lactis ssp cremoris, Bijidobacterium longum, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis ssp lactis의 cytoplasm이 높은 항암활성을 나타내었다.
In vitro 활성이 높은 유산균주를 가지고, In vivo 실험을 수행한 결과 역시 cytoplasm 분획이 항암활성을 가지고 있음을 확인하였다. In vivo 실험 결과, 항암 면역증강 효과에 밀접한 관련이 있는 NK,macrophage의 population을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 , in vitro에서 유산균주 세포성분의 cell cycle을 flow cytometry로 분석한 결과 인간의 대장암 세포주 성장을 S phase에서 멈추게 한다는 점을 확인하였다. 이러한 활성 분획을 분리정제한 결과 단백질과 당이 함께 존재하는 당단백질로 판명되었다.
또한, 유산균의 항동맥경화 활성을 규명하기 위하여 9가지 유산균 cytoplasm 분획물을 사용하여 실험한 결과 Lactobacillus delbrueki ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophíllus, Lactococcus lactis ssp. cremoris의 순으로 지질과산화를 억제하는 것으로 확인되었으며, 특히 Lactobacillus delbrueki ssp. cremoris의 순으로 지질과산화를 억제하는 것으로 확인되었으며, 특히 Lαctobacillus delbrueki ssp. bulgaricus cytoplasm 분획물은 t-BHP로 유도한 혈관내피세포 및 대식세포의 산화적 손상에 대해서도 보호작용을 나타내는 것으로 확인되었다. In vitro 실험의 경우 고지방 식이군에서 Lactobacillus delbrueki ssp. bulgaricus cytoplasm 분획물의 첨가로 인해 콜레스테롤 및 중성지방의 함량이 감소함을 알 수 있었다. Lactobacillus delbrueki ssp. bulgaricus cytoplasm 분획물의 항산화 효과를 조사한 결과, 분해 분획물의 in vitro에서의 항산화 활성이 in vivo에서도 발현되고 있음을 확인하였다. 또한, Lactobacillus delbrueki ssp. bulgaricus cytoplasm 분획물은 세포의 산화적 손상으로 인한 보호 및 혈중지질 수준을 개선하고 염증성 전구 물질의 생성을 조절함으로써 항동맥경화의 효과를 가질 것으로 사료된다.
연구에 의하여 개발된 유산균 유래 항암, 항 동맥경화 활성등을 가진 기능성물질은 고기능성 건강식품 개발에 유용하게 이용될 수 있다고 판단된다.

Abstract ▼

Lactic acid bacteria(LAB) strains are one of the microorganisms that are known as GRAS (generally recognized as safe) strain. Therefore, Lactic acid bacteria strains are used extensively in the food industry. Recently, many laboratories have studied the vector system of Lactobacillus for the develop

Lactic acid bacteria(LAB) strains are one of the microorganisms that are known as GRAS (generally recognized as safe) strain. Therefore, Lactic acid bacteria strains are used extensively in the food industry. Recently, many laboratories have studied the vector system of Lactobacillus for the development of vaccine, enzyme and antibiotics.
In this study, we constructed the Lactobacillus vector for the expression of anti-hypertensive peptide, HHL. The constructed pJC5H was transformed into the E.coli and Lactobacillus. We found that Lactobacillus transformants harboring pJC5H expressed the anti-hypertensive peptide, HHL. The Lactobacillus transformant expressing the anti-hypertensive peptide and the constructed expression vector for Lactobacillus can be used in the functional food industry and for the development of oral vaccine.
Lactic acid bacteria have been known to exhibit various probiotic benefits including resistance to infectious disease, reduction of blood pressure and serum cholesterol, and regression of tumors. It has appeared that LAB preparations, such as whole cells, cell walls, or other cellular components possess marked inhibitory activity on the growth of syngenic or autochthonous tumors in vivo. Since this activity is suggested to be mediated by activation of the host's immune system, many studies have been performed on the effect of LAB and fermented milk on the immune system. It was also reported that a glycoprotein found in the supernatants of Lactobacillus cultures and peptidoglycans of Lactobacillus casei were shown to have a cytotoxic activity against some tumor cell lines. In this study, we reported that the antitumor activity of different cellular components of LAB is dependent on primary toxic activity against tumor cell lines. Whole cells, cytoplasms, and cell wall peptidoglycans of 10 different lactic acid bacteria were tested for in vitro cytotoxicity on 11 human tumor cell lines by ³H-thymidine incorporation assay. We found that cytoplasmic fractions of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophillus, Lactococcus lactis ssp. cremoris have the inhibitory effect on lipid peroxidation in order. The cytoplasmic fraction of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus especially showed protective effect on tBHP-induced oxidative damage in cultured macrophage and bovein pulmonary artery endothelial cell. In this study, when mice on high-fat diet were treated with the cytoplasmic fraction of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, their amount of cholesterol and neutral lipid decreased. In addition, the cytoplasmic fraction of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus were had the same inhibitory activity against oxidation in vivo and in vitro. The cytoplasmic fraction of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus had higher anti-arteriosclerosis activity than whole cell. Therefore, we concluded that the cytoplasmic fraction of Laccillus delbrueckii ssp. bulgaricus had an effect of anti-arteriosclerosis by protection of oxidative damage, developing of lipid profile in blood and control of production of inflammatory precursor. In conclusion, our results will be useful to the development of functional food using lactic acid bacteria.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 6
• Project Summery ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 10
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 17
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 22
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 25
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 28
• 6. 첨부서류 ... 29
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 30
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 31
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 31
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 32
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 40
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 41
• 7. 참고문헌 ... 42
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 44
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 45
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 45
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 49
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 52
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 53
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 54
• 7. 참고문헌 ... 54
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 69
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 70
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 70
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 74
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 83
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 85
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 86
• 7. 참고문헌 ... 86
• 끝페이지 ... 89