초록 ▼

본 연구에서는 TAG-72 암특이항원에 대한 인간화항체를 개발하고, 이 인간화항체를 이용하여 인간단일클론항체를 개발하여 그 분자면역적 특성 및 생체내외에서의 조직결합특이성을 확인하여 대장암의 진단 및 치료용 항체를 개발하였다.
우선 인간화항체를 제조하기 위하여 TAG-72에 대한 생쥐 단일클론항체 CC49의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 가장 유사한 인간항체 유전자 DP25와 DPK24에 항원결합부위를 형성하는 생쥐항체의 CDR 아미노산잔기들의 일부와 CDR의 confonnation에 영향을 주는 FR의 아미노산 잔

본 연구에서는 TAG-72 암특이항원에 대한 인간화항체를 개발하고, 이 인간화항체를 이용하여 인간단일클론항체를 개발하여 그 분자면역적 특성 및 생체내외에서의 조직결합특이성을 확인하여 대장암의 진단 및 치료용 항체를 개발하였다.
우선 인간화항체를 제조하기 위하여 TAG-72에 대한 생쥐 단일클론항체 CC49의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 가장 유사한 인간항체 유전자 DP25와 DPK24에 항원결합부위를 형성하는 생쥐항체의 CDR 아미노산잔기들의 일부와 CDR의 confonnation에 영향을 주는 FR의 아미노산 잔기들을 이식하였다 (그림 1, 2). 그 결과 제조된 인간화항체 (HzCC49)의 Fab을 E. coli에서 발현시켜 정제하고 (그림 3, 4, 5), 또한 whole IgG fonn의 인간화항체를 동물세포 CHO에서 발현시켜 정제하였다 (그림 8, 9). 각 정제한 항체의 항원결합능을 확인하였으며, 항원결합친화도를 측정한 결과 whole IgG가 2 X 10^-8의 K_D 값을 나타내어 affinity값이 좋은 편으로 나타났다 (그림 10, 11)
상기 Fab항체와 whole IgG의 인간화항체가 암조직에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여, 우선 암환자의 조직을 위 항체들로 immunohistochemistry를 수행한 결과 두 항체 모두 암조직에 결합함을 확인하였다 (그림 12). 계속하여, human colon carcinoma xenograft nude mice model을 만들고, 각 정제한 항체를 방사성동위원소 1-125로 표지하여 항체만을 분리한 후 (그림 13), nude mice model에 주사하고 4시간후와 24시간 후의 방사성동위원소의 암으로의 집적상태를 영상화하였다 (그림 14, 15). 그 결과 Fab은 대장암으로 집적되지 않았고 (그림 14), whole IgG의 인간화항체는 대장암에 특이하게 결합하였다 (그림 15). Whole IgG 인간화항체는 시간이 지나 체외로 배출됨을 확인하였으며, 24시간 후에 종양 이외의 다른 장기에 남아 있는 항체의 양도 훨씬 적었다 (그림 16). 따라서, 상기 whole IgG의 인간화항체는 동위원소 표지 후 종양영상이 가능하며 적절한 동위원소 표지 후 치료 가능성도 있을 것으로 판단된다. 이 인간화항체의 제조방법을 특허 출원하였다.
상기의 인간화항체는 생쥐 유래의 아미노산잔기들을 포함하고 있으므로, 인체에 반복 투여시 HAMA 반응을 유발할 가능성이 존재하므로, 인간단일클론항체를 개발하는 것이 이상적이다. 이를 위하여 phage displayed 인간경쇄라이브러리를 chain shuffling 방법으로 제조하고 panning 방법으로 스크리닝한 결과 몇개의 highly specific 한 클론들을 분리하였고, 그 아미노산서열들을 결정한 결과 parental 인간화경쇄와는 farnily가 다르고 또한 CDR의 아미노산서열들이 다름을 확인하였다 (그림 6, 7). 앞으로 이 인간경쇄를 갖는 항체의 항원결합특성을 분석한 후 특허를 출원할 예정이다. 또한 인간중쇄라이브러리를 제조하여 chain shuffling방법으로 TAG-72에 특이하게 결합하는 인간중쇄들을 분리할 예정이다.
결론적으로, 본 연구를 통하여 개발된 TAG-72에 대한 인간화항체와 인간항체는 TAG-72가 특히 많이 발현되는 대장암의 진단과 치료에 유용할 것으로 기대된다. 이 항체는 radioimmunotherapy, 암특이적 유전자치료제 계발 및 암특이 세포치료법에도 활용할 수 있는 등 광범위한 암치료법에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

Abstract ▼

We have developed humanized and human monoclonal antibodies with specificity for the tumor associated antigen T AG-72 and confirmed that they bound the human colon carcinomas specifically by immunohistochemistry and in vivo animal study using human colon carcinoma xenograft nude mice.
To construc

We have developed humanized and human monoclonal antibodies with specificity for the tumor associated antigen T AG-72 and confirmed that they bound the human colon carcinomas specifically by immunohistochemistry and in vivo animal study using human colon carcinoma xenograft nude mice.
To construct the humanized antibody, some amino acid residues of the complementarity determining reglOns (CDRs) and the framework regions of mouse monoclonal antibody CC49 were grafted onto human Ig germline genes DP25 and DPK24 (Fig. 1, 2). The variable region genes constructed were fused to the human constant region gene CΓ1 and C_K to make the whole IgG humanized antibody genes. The Fab or whole IgG form of the humanized antibody was expressed in E coli or chinese hamster ovary cells, respectively, then purified by an affinity chromatography on Protein G column from the periplasmic extracts of the bacteria or the culture supernatant of the CHO cells (Fig. 3, 4, 5, 8, 9). The antigen binding activities of the purified antibodies were analyzed, which showed that the affinity (K_D) of the whole IgG humanized antibody was 2 x 10^-8 (Fig. 10, 11).
The humanized Fab and whole antibody bound to human carcinomas, as assessed by immunohistochemistry (Fig. 12). Also, the 1-125 labelled humanized antibody specifically targeted the human colon carcinoma xenograft in nude nuce (Fig. 15, 16), while the humanized Fab did not, which is likely due to the reduced avidity of the Fab (Fig. 14). The humanized will be useful in the in vivo imaging of human colon carcinomas, and have been filed for patent application.
To develope fully human monoclonal antibodies with specificity for the TAG-72, we have constructed phage-displayed human light chain libraries from the B cells of PBL, bone marrow, and spleen bu chain shuffling, then screened for the T AG-72-binding clones by panmng. As the result, we have isolated highly specific clones, and the determination of the sequences of the positive clones revealed that they are member of human kappa light chain subgroup I, while parental humanized kappa chain is a member of subgroup IV. In addition, the CDR sequences of the newly isolated clones were different from that of parental humanized kappa chain. The antibodies will be analyzed for their antigen binding affinity and filed for patent application. Also, the human heavy chain library will be constructed and screened for the development of fully human anti-TAG72 monoclonal antibodies.
In conclusion, we have successfully developed the humanized and human monoclonal antibodies with specificity for the TAG-72 antigen. The antibodies will be useful in the in vivo Imaging and therapy of human colon carcinoma. We plan to use these antibodies in radioimmunotherapy, gene therapy, and cell therapy for the specific targeting of human carcinomas.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 33
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 34
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 36
• 6. 첨부서류 ... 36
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 37
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 38
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 38
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 38
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 42
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 43
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 44
• 7. 참고문헌 ... 44
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 47
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 48
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 48
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 53
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 54
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 55
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 57
• 7. 참고문헌 ... 58
• 끝페이지 ... 58