초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 돼지유행성 설사병 예방을 위한 벼 신품종 개발
돼지 유행성 설사병에 대한 식물경구백신을 개발하기 위하여 원인균인 PEDV spike protein의 epitope 부분으로 알려진 COE와 S1D 항원유전자를 발현시키기 위하여 rice amylase 3D promoter 조절 하에 있는 식물발현 벡터를 제작하였고 벼에 형질전환하여 항원단백질의 발현을 확인하였다. 항원단백질을 발현하는 식물체를 냉동건조하여 얻은 분말을 이용하여 경구적인 방법으로 동물 실험한 결과 실험동물 쥐에서는 점막면역계에서 liga

Ⅳ. 연구개발결과
1. 돼지유행성 설사병 예방을 위한 벼 신품종 개발
돼지 유행성 설사병에 대한 식물경구백신을 개발하기 위하여 원인균인 PEDV spike protein의 epitope 부분으로 알려진 COE와 S1D 항원유전자를 발현시키기 위하여 rice amylase 3D promoter 조절 하에 있는 식물발현 벡터를 제작하였고 벼에 형질전환하여 항원단백질의 발현을 확인하였다. 항원단백질을 발현하는 식물체를 냉동건조하여 얻은 분말을 이용하여 경구적인 방법으로 동물 실험한 결과 실험동물 쥐에서는 점막면역계에서 ligand로 쓰이는 Co1과 융합한 융합항원단백질을 먹인 그룹에서 항원단백질에 대한 면역 반응을 보이는 것을 확인하였고 목적 동물 돼지에서는 carrier와 adjuvant로 널리 이용되는 LTB와 융합한 LTB-COE 융합항원단백질을 먹인 그룹에서 면역된 돼지의 새끼에서 시행한 공격접종에서 방어능력을 보였다. 형질전환 식물체의 elite line 선발을 위하여 항원유전자 1-2 copy가 도입된 형질전환 식물체를 real time PCR, genomic DNA Southern blot analysis, DNA flanking sequence를 이용하여 선발하였고 농업형질 검사를 위하여 포장에서 실험한 결과 성숙기에 최종적으로 불임성이 없이 정상적으로 등숙한 개체를 확보하였다.
2. 어류 노다바이러스 어류경구백신 형질전환 담배 개발
노다바이러스 캡시드 유전자를 외래 단백질의 발현을 극대화 시킬 수 있도록 식물 색소체 유전자 전사과정에 맞도록 염기서열을 담배 색소체의 코돈에 맞게 최적화하여 색소체 형질전환 기본벡터인 TIA::RclpGAH로 도입하였다. 완성된 벡터를 이용하여 bombardment 방법으로 노다바이러스 캡시드 유전자를 담배 색소체로 도입하여 형질전환체를 확보하였다. 확보된 T₀ 형질전환체는 gDNA PCR, RT-PCR, Western blot 방법을 통해서 유전자 도입과 발현을 확인하였다. 노다바이러스 캡시드 유전자의 발현양이 높은 형질전환체 3개의 line을 확보하여 T₁-T₄ 세대까지 안정적으로 발현이 유지되는지 확인하였다. 감염개체의 뇌, 비장, 신장으로부터 total RNA를 추출한 후 노다바이러스 캡시드 protein 유전자를 확보하였으며, 클로닝 및 발현 검증을 통해 노다바이러스 캡시드 유전자를 확보하였다. 확보된 유전자를 이용하여 단백질 발현을 확인한 후 순수분리를 실시하였다. 순수분리된 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 anti-noda coat protein 항체를 생산하였다. 항체가 상승을 위한 키토산 formulae 개발을 위해서 여러 가지의 키토산 대상 중에서 생체자극이 덜하고 점막면역자극효과가 기대되는 CM-chitin사용하여 본 실험에 이용하였으며 CM-chitin이 adjuvant로서 효능이 있는 것을 확인하기 위한 실험을 실시하였고 마우스와 능성어에서 CM-chitin이 adjuvant로써의 역할을 수행함을 확인하였다. 동물성 사료를 급이하는 능성어류에 있어 식물성 사료의 함유량이 먹이반응에 미치는 영향을 알아보기 위해 식이거부반응 실험을 실시하여 어류 사료내의 담배 식물재료 최적 formulae 개발하였다. 담배유래의 항원에 대한 마우스와 능성어에서 항체유도 확인 실험을 진행하여 통계학적으로 유효한 항체가 유도되는 것을 확인 할 수 있었다. 일시적발현 벡터인 pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP, pTRAkc-ERH vector에 Noda gene을 삽입하여 최종벡터를 완성하였다. 완성된 벡터를 Agrobacterium GV3101에 형질전환하여 infiltration 과 vacuum inocualtion 실험에 사용하였다. 형질전환된 Agrobacterium cell을 이용하여 일시적 발현 방법인 infiltration 방법을 이용하여 단백질 발현의 최적조건을 확립하였다. 한번에 많은 sample에 단백질 발현을 확인하기 힘든 infiltration 방법을 개선하기위해서 vacuum inoculation 방법을 이용하여 단백질 발현을 확인하였고 silwet 농도, vacuum 압력, vacuum 시간, sampling 시기, sampling 위치 등 단백질 발현 최적 조건을 확립하였다.
3. 산업용 효소 생산용 형질전환 벼 개발
식물세포배양을 이용하여 산업용 효소인 TEV endopeptidase와 Enterokinase를 생산하기 위하여 TEV endopeptidase와 Enterokinase의 유전자를 벼에 최적인 코돈으로 디자인 하여 합성 한 후에 rice amylase 3D promoter를 이용한 식물발현 벡터를 제작하고 이를 각각 벼에 형질전환하여 TEV endopeptidase와 Enterokinase의 발현을 확인하였으며, 분자생물학적 방법을 이용하여 고생산 벼 세포주를 확립하였다. 각각의 고생산 세포주로부터 현탁세포를 유도하고 이를 이용하여 생산한 식물유래 TEV endopeptidase 및 Enterokinase의 활성을 확인하였으며, TEV endopeptidase 및 Enterokinase 고생산 세포주의 cell bank를 구축하였다. 대용량 배양 후 식물유래 TEV endopeptidase 및 Enterokinase에 대한 고순도 분리․정제방법을 확립하였으며, 식물세포유래 TEV endopeptidase 및 Enterokinase에 대한 생화학적 특성을 분석하였다. 각 단계별 최적 조건을 종합하여 TEV endopeptidase 및 Enterokinase 고생산 세포주 배양, 20 L/batch 규모의 배양 및 정제관련 SOP를 확립하였다.
4. 식물세포 배양을 이용한 항체 대량 생산 및 기능 분석
식물세포 현탁배양에서 치주균에 대한 항체 단백질의 생산을 증진시키고자 amylase와 Cys protease에 대한 siRNA를 제작하여 형질전환하여 식물세포 현탁배양에서 배지에 축적되는 amylase와 단백질 분해 효소의 활성의 감소를 확인하였고 항체단백질의 발현 증진을 확인하였다. 식물세포 현탁배양에서 분비된 항체단백질을 protein G column을 이용하여 분리하였고 분리된 항체단백질을 이용하여 P. gingivalis의 부착에 대한 억제 효능, invasion assay를 이용하여 세포내 침투 능력 억제, phagocytosis assay를 이용하여 치주균의 phagocytosis의 중가, bacterial killing assay를 수행하여 neutrophill의 치주균 사멸능의 증가를 확인하였다. 항체단백질의 대량생산을 위하여 대체성 탄소원(fumaric acid, malic acid), 삼투성 제제 (NaCl)를 첨가하여 fumaric acid 첨가에서 항체단백질의 고발현을 확립하였고 protein G column를 이용하여 식물세포 현탁배양에서 분비 축적된 항체 단백질의 분리 및 정제 조건을 확립하였다.
5. 경구백신 효율 증진 기술 및 효능 검정 기술 개발
본 연구에서는 항 펩타이드 LL-37이 점막의 면역 유도조직에서 외부 항원에 대한 항체를 형성하기에 적합한 환경을 구성하는 역할을 확인하였다. 항 펩타이드 LL-37을 경구 백신 모델에 적용하였을 때 항원 특이적 항체들이 T 세포 면역반응에 의해 증가 되는 것을 확인하였을 뿐 아니라 병원성 항원에 적용될 경우 병원균의 감염을 방어할 수 있는 항체 형성을 검증하였다. 또한 외부 항원 유입의 대표적인 세포인 M cell에서 특이적으로 발현하는 단백질 C5aR를 발견하였으며 C5aR에 대한 targeting이 경구 백신 효능을 증진 시킬 수 있음을 확인하였다. M cell에서 C5aR에 의한 병원균 Yersinia enterocolitica의 감염이 TLR 과의 상호작용으로 유도되는 cAMP 증가에 따른 조절을 확인하여 M cell에서 병원균 유입 대한 새로운 기작을 확인하였다.
6. 고효율 발현 종자 및 뿌리 특이적 프로모터와 벡터 제작
hMBP 단백질 발현에 적합한 벡터를 제작하여 당근에 형질전환하였다. 기내배양을 통하여 대량생산하여 MBP 단백질의 발현 유무를 분석하였고 최적의 단백질 추출 조건을 확립하였다. 또한 당근의 translational machinery에 맞도록 코돈을 최적화하였다. 유용 프로모터 개발을 위하여 microarray data와 RT-PCR 분석을 통한 새로운 종자 및 뿌리 특이적 프로모터의 대량 탐색을 완료하였고, 탐색된 프로모터 중 기존에 알려지지 않은 종자 특이적 프로모터를 선별이 가능하였다. 총 37개의 종자특이 발현이 예상되는 유전자를 선발하였고, 그 promoter들을 분석하였다. 콩과 옥수수 종자를 이용해 seed-specific cis-element를 포함한 promoter의 transient expression을 분석하였고, 종자 특이 프로모터를 4차년도에 3건, 5차년도에 3건의 특허출원을 완료하였다. 이 중에서 2건의 특허는 등록되었다.
7. 면역성이 제거된 인간화 당단백질 생산용 벼 개발
식물 특이적 면역원성이 제거된 당 단백질 생산 식물체 및 식물세포 개발을 목표로 gnt1 (cgl) 돌연변이 벼와 β1,2-xylosyltransferase, α1,3-fucosyltransferase 등의 식물 특이적인 당전이효소의 활성이 없는 돌연변이체를 이용하여 immunogenic β1,2-xylose와 α1,3-fucose가 없는 당단백질 생산 식물체를 개발하는 연구를 진행하였고 이들의 N-glycan을 Con A-, HRP-, α1,3-fucose-, β1,2-xylose-항체 그리고 MALDI-TOF/MS를 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 bioinformatics와 분자생물학적인 기법을 이용한 식물 특이적인 복합당쇄를 만드는데 관여하는 단백질과 외부 유전자의 발현을 억제하는 단백질 등이 결여된 knockout 돌연변이체(벼 5종, 애기장대 18종)를 확보하여 이들 각각의 돌연변이체에 대한 동형 접합자를 분리하는 일을 마무리하였고 교배를 통하여 맞춤형 당 단백질 생산 식물 library를 구축하였다.
8. 식물체에서의 고효율 단백질 발현 시스템 확립
본 연구를 통해서 translational efficiency를 획기적으로 높일 수 있는 5‘-UTR을 screening하고자 하였다. 흥미롭게도 5’-UTR의 nucleotide sequence에 따라서 단백질의 level이 1000배 이상 차이가 난다는 사실을 확인하였다. 이들 중에서 가장 높은 translational efficiency를 보이는 5‘-UTR을 확보하고 이를 이용하여 expression vector를 구축하였다. 또한 chloroplast targeting signal sequence와 ER targeting signal sequence 들 중에서 가장 효율이 좋은 signal sequence를 확보하고 이들을 이용하여 high level ER targeting vector와 high level chloroplast targeting vector를 구축하였으며 이들을 이용하여 total soluble protein의 1%에 이르는 고발현 vector 및 고축적 vector들을 구축하였다. 이러한 결과들은 식물 세포를 이용하여 단백질 생산 시스템으로 활용하고자 하는 식물 바이오텍의 원천 기술들이라 할 수 있다. 또한 본 연구에서는 단백질들이 어떻게 endomembrane compartment에 trafficking 되며 이 과정이 어떻게 조절되는지와 엽록체 및 mitochondria에 단백질들이 어떻게 targeting되는지에 대한 기초 연구를 수행하여 다양한 중요한 factor들을 동정하였으며 이들의 작용 기작을 규명하였다. 이들은 후속 연구들을 통해서 단백질의 고축적 기술 개발에 활용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼

Ⅳ. Research/development results
1. Development of transgenic plant expressing antigen proteins against PEDV.
For development of transgenic plant against porcine epidemic diarrheal disease as edible vaccine, the COE and S1D genes containing epitopes of Porcine epidemic diarrhael virus spike pro

Ⅳ. Research/development results
1. Development of transgenic plant expressing antigen proteins against PEDV.
For development of transgenic plant against porcine epidemic diarrheal disease as edible vaccine, the COE and S1D genes containing epitopes of Porcine epidemic diarrhael virus spike protein, which were fused with cholera toxin B subunit, LTB, and Co1 as ligands to improve uptake of antigen proteins into mucosal immune systems, were expressed under the rice amylase 3D promoter expression systems in transgenic rice cell suspension culture. The IgG and IgA antibodies against antigen proteins were elicited in orally administrated mouse. The protection against virus challenge were observed in piglet from immunized pigs by orally administrated with LTB-COE fusion antigen proteins. The seeds from transgenic plants showing 1-2 copies of target gene were germinated and cultured. Some plants with fertilization and showing normal phenotype were observed and their seeds were harvested.
2. Development of new tobacco variety producing the vaccine against grouper nodavirus infection
The coat protein gene was codon optimized in plant expression system and subsequently subcloned into TIA::RclpGAH, chloroplast transformation basic vector. The gene was introduced into plastid genome by the bombardment method. All transgenic tobacco plants were confirmed by gDNA PCR, RT-PCR, and Western blot methods. Three independent transgenic lines expressing high level of recombinant protein were selected and kept for further studies. After extracting total RNA from brain, spleen, and kidney of infected groupers, Nodavirus coat protein gene was obtained through cloning and expression test. Pure virus particles were isolated for the challenging test. Antibody was prepared against the recombinant protein purified from E. coli. For antibody formation, CM-chitin that has been known as an adjuvant was used for fish feed formulation. Moreover, the experiment has been conducted to check whether CM-chitin was effective as an adjuvant in mouse and grouper. After a diet rejection test, the optimal tobacco plant-based source formulae in fish flake has been developed to discover the effect of food reaction depending on vegetable flake content among grouper that usually has fed animal flake. The effective antibodies has been statistically induced by feeding of antigens in both mouse and grouper fries. The final vectors harboring Noda gene pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP, and pTRAkc-ERH were generated and then introduced into Agrobacterim GV3101 for the infiltration and vacuum inoculation methods. Optimal conditions for the high protein level expression been established by improving infiltration method such as silwet concentration, vacuum pressure, vacuum time, sampling timing, sampling days, and etc.
3. Development of new rice variety producing the recombinant industrial enzymes
For development of transgenic plant new rice variety producing the recombinant industrial enzymes, the TEV endopeptidase and human Enterokinase light chain genes were expressed under the rice amylase 3D promoter expression systems in transgenic rice cell suspension culture, respectively. Secretion of TEV endopeptidase and human Enterokinase light chain into the culture medium was achieved by using the existing signal peptide. Proteolytic activity of the rice-derived TEV endopeptidase and human Enterokinase light chain were confirmed and were similar to that of the commercial bovine-produced trypsin and recombinant Enterokinase light chain, respectively. SOP for culture of cell lines with high expression efficiency of TEV endopeptidase and Enterokinase were established.
4. Improvement of antibody production in transgenic cell suspension culture
For improvement of antibody production in transgenic rice cell suspension culture, siRNA of amylase and cys protease was constructed and transformed together with antibody genes into rice embryogenic callus. The secreted amylase and cys protease were reduced in the rice suspension culture medium and the production of antibodies were improved. The purified plant-produced monoclonal antibodies inhibited the binding of P. gingivalis to saliva-coated hydroxyapatite beads, as well as the invasion of oral epithelial KB cells due to the bacterium. The antibodies enhanced the intracellular killing of P. gingivalis by polymorphonuclear neutrophils. These results suggest that FimA-specific monoclonal antibodies produced in a rice suspension culture were easily purified and biologically active against P. gingivalis, and thus may be used for passive immunization to prevent P. gingivalis-induced periodontal disease.
5. Development of technologies to enhance the efficacy of oral vaccine and to assess the efficacy of vaccination
Among the vaccination protocols, oral mucosal vaccine confers feasibility and efficacy in vaccination because it could induce the efficient antigen-specific systemic and mucosal immune responses. However, this method imposes restrictions such as difficulty in antigen delivery and poor immunogenic environment. To overcome these, many studies have been concentrated to develop effective mucosal vaccine adjuvants. In this study, to develop the effective mucosal vaccine adjuvants, we found that 1) antimicrobial peptide LL-37 can act as mucosal adjuvant through enhanced antigen delivery, dendritic cell maturation, and chemotactic effect by FPR-2 on M cells and subepithelial dome and 2) C5aR which is especially expressed on apical surface of human and mouse M cells can play a role as mucosal target receptor by C5aR targeting ligand including OmpH of Y.enterocolitica in mucosal oral vaccine model.
6. Construction of seed- and root-specific promoters and vectors for high efficient gene expression
For develop useful promoter system, novel seed- and root-specific promoters were searched by analyses of microarray data and RT-PCR. A total of 37 seed-specific promoters have been analyzed, and their transient expressions were assayed using soybean and maize seeds. Three patents in the fourth year and three others in the fifth year have been applied, and subsequently, of these, two patents have been registered.
7. Development of a rice with customized N-glycan structure
Customized N-glycan producing plants that can be used to improve delivery and overcome viral contamination of biopharmaceuticals have beeen developed. These plants can be applied to produce biopharmaceuticals including β-glucocerebrosidase an enzyme used to treat ‘Gaucher disease’ in a safe and effective manner.
8. Development of cellular tools for high level protein production in plants
In this project, we aimed to develop cellular tools for high level protein production in plant cells so as to develop plant cells as a protein production system. Protein production depends on many steps starting from the gene expression to the targeting of proteins to a subcellular organelle. Of these multiple steps, we mainly focused on two steps, the translation of mRNA and distribution of proteins to various subcellular organelles after translation because the gene expression has been extensively studied. From this study, we found that the 5'-untranslational region of mRNA had profound effect on translation efficiency; the difference in the translational efficiency was as high as 1000 fold between good 5'-UTR and poor 5'-UTR. We generated expression vectors using a good 5'-UTR in combination with the good ER targeting signal or a good transit peptide of chloroplast proteins. In addition, we investigated the mechanism of protein trafficking through the endomembrane compartments and also protein targeting mechanism to chloroplasts and mitochondria. We identified various protein factors involved in protein trafficking through the endomembrane compartments and investigated their action mechanisms. In addition, we also elucidated the sequence information encoded by the transit peptide and presequence of chloroplast and mitochondrial targeting, respectively. Furthermore, we showed how AKR2A plays a role in protein targeting to chloroplast outer membrane. With these findings, we will attempt to express proteins to high levels for the purpose of commercialization. In particular, we are trying to express swine fever viral protein and haemagglutinin of H5N1 virus to high levels to develop as vaccines. The findings we made in this study will be the foundation for the plant biotech in particular for the molecular farming.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 12
• CONTENTS ... 21
• 목 차 ... 22
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 23
• 제 1절 연구 개발의 목적 ... 23
• 제 2 절 연구 개발의 필요성 ... 26
• 제 3 절 연구 개발의 범위 ... 36
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 44
• 제 1 절 국외의 기술동향 및 수준 ... 44
• 제 2 절 국내의 기술동향 및 수준 ... 52
• 제 3 절 국·내외 관련 시장 현황 ... 53
• 제 4절 정책 및 제도 현황 ... 56
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 57
• 제 1절 연구개발수행 내용 ... 57
• 제 2 절 돼지질병 예방을 위한 벼 신품종 개발 ... 88
• 제 3 절 능성 어류 노다 바이러스 예방 백신용 담배 신품종 개발 ... 171
• 제 4 절 재조합 산업용 효소 생산 신품종 벼 개발 ... 216
• 제 5 절: 식물세포배양을 이용한 항체 대량생산 및 기능분석 연구 ... 294
• 제 6 절 경구백신 효율증진 방안 및 백신 효능 검정 연구 ... 332
• 제 7 절 고효율 발현 종자 및 뿌리 특이적 프로모터와 벡터 시스템 개발 ... 381
• 제 8 절 면역원성이 제거된 인간화 당단백질 생산용 벼 신품종 개발 ... 417
• 제 9 절 식물세포에서 단백질 고축적 기술 개발 ... 455
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 519
• 제 1 절 연구 목표 달성도 ... 519
• 제 2 절 관련 분야에의 기여도 ... 562
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 564
• 제 1절 연구 개발 성과 ... 564
• 제 2 절 성과활용 계획 ... 574
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 577
• 제 1절 연구관련 해외과학기술 수집현황 ... 577
• 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 585
• 제 1절 연구시설, 장비 구입 및 관리 현황 ... 585
• 제 8 장 참고문헌 ... 586
• 끝페이지 ... 597