보고서 정보
주관연구기관 |
소망화장품(주) |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2014-01 |
과제시작연도 |
2012 |
주관부처 |
산업통상자원부 Ministry of Trade, Industry and Energy |
등록번호 |
TRKO201400019417 |
과제고유번호 |
1415125526 |
사업명 |
산업집적지경쟁력강화사업 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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키워드 |
두충.아토피.항아러지.항염.에토좀.피부투과율.
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초록
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2. 개발내용 및 결과
○ 두충 추출물 담지 에토좀의 제조 및 최적 조건 확립
1-1 에토좀 제조
- Egg PC 1%, 각 비율별 (0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05%) 두충 ethyl acetate 분획 담지 에토좀은 층분리, 응집과 같은 물리적 변화 없이 입자 크기가 150nm 이하인 단분산 형태로 안정하게 제조되었다.
1-3 에토좀 입자크기 측정
- 4주간 에토좀의 입자크기 변화를 살펴본 결과 제조 1주차에 급격하게 증가하였지만 4주차까지 200nm 이하로 단분산 형태의 입자 크기
2. 개발내용 및 결과
○ 두충 추출물 담지 에토좀의 제조 및 최적 조건 확립
1-1 에토좀 제조
- Egg PC 1%, 각 비율별 (0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05%) 두충 ethyl acetate 분획 담지 에토좀은 층분리, 응집과 같은 물리적 변화 없이 입자 크기가 150nm 이하인 단분산 형태로 안정하게 제조되었다.
1-3 에토좀 입자크기 측정
- 4주간 에토좀의 입자크기 변화를 살펴본 결과 제조 1주차에 급격하게 증가하였지만 4주차까지 200nm 이하로 단분산 형태의 입자 크기를 나타내었다.
- 0.01~0.05% ethyl acetate 분획 담지 에토좀은 4주간 물리적 변화 없이 안정함을 확인
1-3 에토좀 포집효율 측정
- 0.01%~0.05% 두충 ethyl acetate 분획을 담지한 에토좀의 포집효율은 각각 66.15%, 76.35%, 76.27%, 74.05%, 81.79%를 나타내었다.
- 0.05% 두충 ethyl acetate 분획을 담지한 에토좀은 실질적으로 가장 많은 양을 포집하였다.
○ 두충 추출물 담지 에토좀의 피부투과 증진 확인
2-1 franz diffusion cell 실험
- 4주간 안정하고 포집효율이 높은 0.05% 두충 ethyl acetate 분획을 담지한 에토좀을 이용하여 피부투과 실험을 진행하였다.
- 대조군으로는 0.05% 두충 ethyl acetate 분획을 담지한 리포좀과 0.05% 두충 추출물을 녹인 에탄올 용액을 사용하였다.
- 24h 후의 피부 누적 투과량 (Transdermal)은 에토좀이 44.91 ± 1.14ug/cm2 으로 가장 높고, 그 다음 리포좀(32.47±1.53 ug/cm2, 에탄올 용액(22.16 ± 1.81 ug/cm2 순으로 나타났다.
- 각질층에 남아있는 두충 추출물의 양(Tape) 은 에토좀 (38.35 ± 0.04 ug/cm2) > 에탄올 용액 (27.28 ± 0.06 ug/cm2) > 리포좀 (25± 0.048ug/cm2) 순으로 나타났다.
- 피부 투과 실험에 사용한 두층 추출물의 양은 모든 체형에서 157.18ug/cm2 이었고, 두충 추출물의 총 피부 투과량은 에토좀 (121.38 ± 0.65 ug/cm2) > 리포좀 (98.6 ± 0.67 ug/cm2) > 에탄올 용액 (66.01 ± 0.78 ug/cm2) 순으로 나타났다.
- 에토좀의 투과 효율은 77.22 % 로 리포좀 (62.73%)과 에탄올 용액 (42%) 보다 높게 나타났다. 따라서 0.05% 두충 추출물을 피부로 전달하는 능력은 에토좀이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
○ 두충 추출물의 성분분석
- TLC, HPLC, LC/MS, NMR 을 이용하여 성분 분석한 결과 geniposide, geniposidic, aicd, chlorogenic aicd, genipin 이 존재하는 것을 확인 하였다.
- TLC 와 HPLC 결과 두충 ethyl acetate 분획이 주성분은 genipin 으로 확인 되었다.
○ 두충 추출물의 항알러지 효능 평가(히스타민 방충 억제 평가)
- 아토피 피부염을 유발시키는 원인으로는 비만세포, T임과 구등의 면역관련세포의 사이토카인과 기타생성물질에 의한 염증 및 비정상면역반응이라고 알려짐. 이에 따라 면역관려세포에 대한 두충 추출물의 다양한 항염증 또는 면역억제 효능을 확인하고자 함
1) 비만세포 (Mast cell, RBL-2H3) 에 대한 히스타민 방출 억제 및 항염 효능 확인
- 천식, 고초열, 아토피성 습진등의 증식형 알레르기반응을 유발하는 세포인 비만세포(Mast cell, RBL-2H3) 로 부터의 히스타민 유리 억제작용이나 면역억제작용, 항산화, 항염 효능을 평가
가) RBL-2H3 cell 에 대한 두충 추출물의 세포 독성 평가 - MTT assay
- 두충추출물의 경우, 80% 이상의 생존율을 보이는 10, 20, 50ug/ml 농도 중에서 적합한 농도를 선정하여 다음 실험을 진행함
나) RBL-2H3 cell 에 대한 두충 추출물의 항알러지 효능 평가 - histamine release inhibitioon assay
- 두충 추출물을 적정 농도로 처리하였을 때, Control 대비 히스타민 방출이 억제되는 것을 확인할 수 있었음. 20ug/ml 농도에는 양성대조군이 Quercetin 20uM 과 같은 저해율을 보이는 것을 확인하였음. 따라서 두충 추출물이 히스타민 방출을 억제하여 항알러지 효능을 보이는 것으로 사료됨.
다) RBL-2H3 cell 에 대한 두충 추출물의 항알러지 효능 평가 -β-hexosaminidase release assay
-β-hexosaminidase 방출 저해능에 대하여 두충 추출물의 효과를 확인한 결과 두충 추출물 20ug/ml 은 양성대조군인 Quercetin 보다는 약하지만 80% 정도의 방출 저해 효과를 보였으므로 항알러지 효능이 우수한 것으로 사료됨.
라) RBL-2H3 cell 에 대한 두충 추출물의 COX-2 활성 억제 확인 -Westem blot - COX-2 발현 억제 효능을 단백질 수준에서 확인한 결과 두출 추출물에서 COX-2 발현 억제능을 확임함.
2) T 임파구 (T lymphocyte, Jurkat cell) 에 대한 세포 증식 및 IL-2 억제 효능 확인
- 다양한 분자들에 의해 매개되는 신호전달체계에 의해 최종적으로 IL-2 농도가 증가되어 T 임파구세포의 증식과 분화가 촉진된다고 알려져 있으며, T 임파구는 분화와 성숙과정을 통해 류마티스성관절염과 아토피, 천식 등의 자가면역성질환을 발생시킴. 이에 따라 T 임파구에 독성을 나타내지 않는 농도에서 IL-2 억제 효능을 평가하고자 함.
가) Jurkat cell 에 대한 두충 추출물의 증식능 및 세포 독성 평가 -WST-1 assay
- 두충 추출물이 T 임파구의 Jurkant cell 에 대해 세포 증식능을 억제하는지 확인해 본 결과 두충추출물 200ug/ml에서 44%의 cell 증식 억제를 보임을 확인함
나) Jurkat cell 에 대한 두충 추출물의 IL-2 억제 확인 - ELISA assay
- 자극원을 처리하여 IL-2 를 생성시킨 대조군을 100으로 봤을 때 두충 추출물을 처리함으로써 IL-2의 생성이 감소하는 것을 확인할 수 있었음. 이러한 결과는 IL-2의 생성이 감소되어 T 임파구의 분화와 성숙과정 또한 억제되게 되고 따라서 최종적으로 아토피 발생을 억제시키는 것으로 확인됨.
3) 각질형성세포에 대한 각질 분화 실험
- 아토피 피부염 환자의 대부분은 피부장벽손상에 따른 피부 건조함, 각질분화이상의 현상을 나타남. 이에 따라 두충 추출물의 각질분화촉진에 따른 피부장벽강화 및 보습인자를 증대실험을 통해 아토피 피부 증상 완화 효능을 확인하고자 함.
가) HaCaT cell 에 대한 두충 추출물의 세포 독성 평가 - WST-1 assay
- 50ug/ml 농도에서 80% 이상의 생존율을 나타냄
나) HaCaT cell 에 대한 두충 추출물의 각질 분화 유도 시험 - Cormified envelop
- 두충 추출물을 50ug/ml 의 농도로 처리하였을 때 cormified envelop이 증가하는 것을 확임함.
표피 내에 존재하는 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진함으로써 각질층 및 피부 장벽을 구성하는 골격성분인 각질세포를 정상적으로 유도하여 외부로부터의 물질적인 자극으로부터 피부를 보호할 수 있음.
다) HaCaT cell 에 대한 두충 추출물의 피부 보습 인자 및 분화촉진 효능 확인 - RT-PCR & Western blot
- RT-PCR 수행 결과 피부보습인자인 FILAGGRIN 과 각질 세포팍에 효소작용을 하는 TGasel에서 모두 (-) control 대비 (+) control에서 mRNA의 양이 증가함. 이러한 결과로서 두충 추출물들이 피부에 보습효과를 주어 아토피에 효능을 보일것으로 사료됨. Western blot을 수행한 결과 역시 피부보습인자인 filaggrin, involucrin 모두 (-) control 대비 (+) control에서 발현이 증가함. 따라서 두충 추출물은 아토피에 대한 피부 보습효과를 나타내는 시료로서 사용이 가능할 것으로 사료됨.
라) HaCaT cell 에 대한 두충 추출물의 피부 turn over 주기 정상화 평가 - transglutaminase 1 assay
- 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘 (1.2 mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘 농도에 두충 추출물을 첨가하여 실시함. 그 결과, 두충 추출물에서 음성대조군 대비 transglutaminase 1 발현 증가 양상을 나타냄. 따라서 두충추출물이 피부의 turn over 주기 정상화를 증가시킬 것으로 사료됨
○ 두충 에토좀/ 두충 추출물 소재의 안전성/ 안정성 및 지표 성분 분석
- 피부 안전성 평가 : 피부 안전성 평가를 in vivo 실험인 인체 첨포 시험을 통해 실험한 결과, 두충 추출물과 두충 에토좀이 피부 자극을 유발하지 않는 다는 것을 확임함.
-제형 안정성 평가 : 두충 추출물과 두충 에토좀 제형 안정성을 pH와 Ethanol 과 온도로 평가한 결과, 두충 추출물은 모두 안정하였으며 두충 에토좀의 경우, pH 2~4에서 불안정하지만 다른 조검에서는 안정함을 확인함.
- 지표성분 분석 : 두충 에토좀 내의 탄닌(Tannin)과 제니포사이드(Geniposide) 성분 함량 분석함.
○ 두충 에토좀 소재의 피부 투과율 확인
- TEM image 를 통하여 지표성분을 함유하여 제조된 두충 에토좀의 입자를 확인함. 확인 결과 구형으로 에토좀이 제조 되었으며 사이즈는 140~150 nm 로 확인됨
- 인공피부를 이용하여 두충 에토좀의 투과도를 확인한 결과, 에토좀으로 제조한 제형에서 빠른 투과속도와 많은 투과율은 나타냄.
○ 두충 추출물 소재의 특허 출원 1건 및 국내 논문 2건 투고
- 특허출원번호(출원일) : 10-2013-0150360(2013. 12. 05)
발명의 명칭 : 두충과 원자추출물을 함유하는 아토피 피부용 화장품
- 국내논문 투고 2건
1) 학회지명 : 대한화장품학회
논문제목 : “β-hexosaminidase 분비 억제 및 각질형성세포 분화에 대한 두충 (Eucommia ulmoides Oliver) 추출물의 효과”
논문번호 : SC나-13-27
채택일 : 13.09.29
2) 학지명 : 한국공업화학회
논문제목 : “두충 추출물을 담지한 에토좀의 특성 및 경피 전달”
논문번호 : Vol 24, No. 6, Demcember 2013, 639-644
○ 두충 추출물을 함유하는 아토피 개선용 화장료의 최적 제형 개발
1) 저자극 제품개발
- 아토피 개선을 위해 세정 단계에서 사용할 수 있는 바디클렌저와 보습제로 이용되는 바디로션 제형실험이 완료되었다.
- 기본적으로 바디 클렌저와 바디로션의 제형 실험이 완료되어, 경시 안정도(실온(25℃), 고온(45℃), 저온(-5~0℃))를 지속적으로 진행 관찰하고 있으며, 현장 적용이 실험을 실행하였다.
- 처방의 구성은 자극을 유발할 수 있는 성분들을 최소화한 저자극 제품으로 개발하기 위해 Paraben 류의 방부제나 Benzophenone 류, 타르색소 등의 자극성 성분들을 제외하여 처방하였다.
2) 제형 내 유효 성분의 경시 안정도 측정
- 개발된 제품을 온도별로 실온(25℃), 고온(45℃), 저온(-5~0℃)의 BOD Incubator 에 보관하면서 경시에 따른 역가측정을 실시하고, 광 및 UV 에 대한 경시안정도도 측정하였으나 이상이 발견되지 않았다.
○ 두충 추출물을 함유하는 아토피 개선 제품에 대한 점임상 시험
1) 1차 전임상 시험(켐온)
- 본 시험은 시험물질 두충추출물을 DNCB 로 아토피성 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에 21일간 도포하였을 때, 아토피성피부염에 미치는 영향을 평가하기 위하여 수행하였다.
본 시험조건하에서 비오스타 AD 연고로 아토피를 유발한 NC/Nga 마우스 모델에서 치료제를 20일간 피부도포한 결과, 피부변화검사에서 음성대조군과 차이를 보였다. 두충 추출물이 들어간 항 아토피 치료제를 처리한 군들의 경우 5일간 도포하였을 때 아토피 유발로 인한 상처가 눈에 띄게 감소하였으며 시료처리 15일이 경과하였을 땐 상처가 거의 마물고 털이 자라나는 것을 확인 하였다. 이와 대조적으로 음성대조군의 경우 자연 치유가 일어났으나 그 속도가 실험군들에 비해 미미 하였다. 따라서 시험물질인 두충추출물은 비오스타 AD 연고로 유발한 아토피성 피부염에 효력이 있는 것으로 판단되기에 좀 더 정확한 효능 탐색을 위한 보완 실험이 필요할 것으로 사료된다.
2) 2차 전임상 시험(래디안)
- 1차 전임상 시험 결과를 토대로 좀더 정확한 효능 탐색을 위한 보완 실험을 실시하였다.
- 본 시험은 시험물질 두충추출물을 비오스타 AD 연고로 아토피성 피부염을 유발한 NC/Nga 마우스에 20일간 도포하였을 때, 아토피성피부염에 미치는 영향을 평가하기 위하여 수행하였다.
군구성은 4가지군(G1-G4)으로 구성하였다. 음성대조군(멸균주사용주 G1) 과 크림 제형 치료제군 (G2), 로션 제형 치료제군(G3) 그리고 오일 제형 치료제군(G4) 으로 설정하였다. 각 군당 동물은 2마리로 실시하였다.
시험항목으로는 사망동물, 일반증상, 체중변화, 피부변화 검사를 실시하였으며, 음성대조군과 비교하였다. 시험 결과는 다음과 같다.
1. 본 시험에서 사망동물은 관찰되지 않았다.
2. 일반증상 관찰 결과, 시험물질 투여와 관련된 이상증상은 관찰되지 않았다.
3. 체중변화 관찰 겨과, 시험물질 투여와 관련된 체중변화의 이상은 관찰되지 않았다.
4. 피부변화 관찰 결과, 시험물질 투여군은 음성대조군과 비교하여 차이를 나타내었다.
본 시험조건하에서 비오스타 AD 연고로 아토피를 유발한 NC/Nga 마우스 모델에서 치료제를 20일간 피부도포한 결과, 피부변화검사에서 음성대조군과 차이를 보였다. 두충 추출물이 들어간 항아토피 치료제를 처리한 군들의 경우 5일간 도포하였을 때 아토피 유발로 인한 상처가 눈에 띄게 감소하였으며 시료처리 15일이 경과하였을 땐 상처가 거의 아물고 털이 자라나는 것을 확인하였다. 이와 대조적으로 음성대조군의 경우 자연 치유가 일어났으나 그 속도가 실험군들에 비해 미미하였다. 따라서 시험물질인 두충추출물은 비오스타 AD연고로 유발한 아토피성 피부염에 효력이 있는 것으로 판단되기에 좀 더 정확한 효능 탐색을 위한 실험이 필요할 것으로 사료된다.
○ 두충 추출물을 함유하는 아토피 개선 제품에 대한 임상 시험
- 전임상 시험결과를 토대로 아토피성 피부의 가려움증 개선 등에 대한 효능평가를 확인하였다.
- 그 결과 두출추출물을 함유한 시험군에서 피부 수분함유량 (Corneometer CM825), 경표피수분손실량 (Vapometer), 피부온도(Thermometer ST500)), 피부 PH(ph meter PH905), 피부과 전문의 육안평가(SCORAD INDEX), 유효성 설문조사 (Global Assessment of Efficasy), 가려움증 개선도 평가 (VAS)에서 대조군보다 유의미한 개선 효과를 보여 두충추출물이 피부에 자극없이 아토피성 피부의 가려움 개선효과에 도움을 주는 것으로 판명되었다.
○ 두충 추출물을 함유하는 아토피 개선 제품에 대한 안자극 시험
- 버블클렌져의 New Zealand White 계 토끼를 이용한 안점막자극시험안자극 시험을 실시한 결과
1. 시험기간 중 시험물질 적용과 관련한 일반증상의 변화는 관찰되지 않았다.
2. 시험기간 중 시험물질 적용과 관련한 체중변화는 관찰되지 않았다.
3. 시험물질 적용 후 안반응 관찰 결과, 세안군의 모든 동물에서 시험물질 적용 후 1시간째에 미비하게 결막의 발적, 부종 및 배출물 등이 관찰되었으나 24시간후에는 이러한 현상이 사라져 저자극이었다.
안점막자극시험 결과는 세안1시간후에 미세한 자극만이 남고, 특이한 처치없이 24시간이 지난 후에는 자극이 완전히 사라져 정상적인 상태로 돌아와 저자극 제품으로 판명되었다.
○ 두충 추출물을 함유하는 아토피 개선 제품에 대한 인체피부 일차 자극 시험(피엔케이)
- 버블클렌저, 로션, 크림을 성인 80이상 선정하여 24시가 첨포후 피부반응에 대한 육안평가 결과, 비자극성 제품으로 판단되었다.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 생산기술사업화 지원사업 최종보고서 초록(예) ... 3
- 목차 ... 10
- 제1장 서론 ... 12
- 제1절 개발 대상 기술의 중요성 ... 12
- 제2절 국내외 관련기술의 현황 ... 19
- 제3절 기술개발 시 예상되는 파급효과 및 활용방안 ... 27
- 제2장 기술개발 내용 및 방법 ... 29
- 제1절 기술개발 내용 ... 29
- 제2절 최종 목표 및 평가 방법 ... 30
- 1. 최종목표 ... 30
- 2. 평가방법 ... 30
- 제3장 결과 ... 45
- 제1절 연구개발 최종 결과 ... 45
- 1. 연구개발 추진 실적 ... 45
- 2. 연구개발 추진 일정 ... 46
- 3. 기술개발의 내용 및 결과 ... 47
- 제2절 연구개발 추진 체계 ... 114
- 제3절 시장 적용분야 및 기대효과 ... 115
- 1. 적용분야 ... 115
- 2. 기술적측면 ... 115
- 3. 경제.산업적 측면 ... 115
- 끝페이지 ... 116
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