초록 ▼

○ 연구결과
2001년부터 2003년까지 우리나라 전국 12개 지역의 고추, 토마토, 오이의 재배 포장과 식물뿌리에서 내생근권세균 439균주를 분리하였으며, 이 중 고추의 radicle, seedling과 성체식물에서 고추 역병에 대하여 병억제 효과가 뛰어난 5균주 (CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, ISE14)를 포장에서 root-dip처리와 관주처리하여 고추 역병에 대한 생물적 방제 효과를 검증하였다. 2005년과 2006년 선발세균을 관주처리한 인위병접종 포장검증에서 선발된 3균주(CCR04, CCR80,

○ 연구결과
2001년부터 2003년까지 우리나라 전국 12개 지역의 고추, 토마토, 오이의 재배 포장과 식물뿌리에서 내생근권세균 439균주를 분리하였으며, 이 중 고추의 radicle, seedling과 성체식물에서 고추 역병에 대하여 병억제 효과가 뛰어난 5균주 (CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, ISE14)를 포장에서 root-dip처리와 관주처리하여 고추 역병에 대한 생물적 방제 효과를 검증하였다. 2005년과 2006년 선발세균을 관주처리한 인위병접종 포장검증에서 선발된 3균주(CCR04, CCR80, ISE14)가 고추 역병에 대하여 병억제 효과가 있었다. 2006년과 2007년 선발세균을 root-dip 처리한 자연병발생 포장에서는 4균주 (CCR04, CCR80, GSE09, ISE14)가 지속적인 병억제 효과를 나타내었다.
ISE13균주는 2006년도 실험에서 고추 역병을 억제하지 못하였다. 2007년도 고추 수량 평가에서는 CCR80과 ISE14 균주가 고추의 수량을 증가시켰으며, 세균을 포장에 처리하는 방법과 관계없이 처리된 세균은 병평가 결과와 유사하게 고추 역병에 의한 감염율이 감소되었다. 또한 처리된 세균은 근권토양에 존재하는 세균과 미생물의 밀도에 영향을 주지 않았다. 그러므로 순차적 선발방법에 의해 선발된 길항 세균은 고추 뿌리에 정착함으로써 역병으로부터 보호할 것이며, 이 선발 내생근권세균은 관주처리나 root-dip 처리에 의해 고추 역병을 방제하는 생물적 방제제로써 효과적이다. 선발된 내생 근권세균은 16S rDNA 염기서열, FAME 분석과 biolog 분석, 생리생화학적 분석을 통하여 KJ9C8은 Chryseobacterium wanjuense, KJ2C12는 Bacillus luciferensis, CCR04와 CCR80은 Pseudomonas corrugata, GSE09는 Flavobacterium sp. ISE13은 Lysobacter enzymogenes이고, ISE14는 Chryseobacterium indologenes로 동정되었다. 선발 내생 세균의 병억제 기작을 밝히기 위하여 선발 세균이 항생물질과 세포외 효소 분비, biofilm, HCN, siderophore을 형성하는지 특성을 조사하였으며, 식물 뿌리에서의 정착률과 고추 역병균과의 경쟁 관계를 평가하였다. 선발 세균 중 ISE13 균주는 항생물질과 세포외 효소를 분비하는 능력이 있었으며, CCR04와 CCR80균주는 biofilm 형성과 swarm 능력과 식물 뿌리에서의 정착률이 매우 뛰어났다. 다른 GSE09, ISE13, ISE14균주도 대조균으로 사용한 E. coli 균주에 비하여 식물 뿌리정착률이 현저하게 뛰어났으며 이러한 결과로 보아, 선발 세균은 식물 뿌리와 근권에 효과적으로 생존 및 정착함으로써 고추 역병으로부터 감염부위를 보호할 것이라 예상된다.
역병 방제용 미생물농약의 개발을 위해 Chryseobacterium sp. ISE14 균주를 갖고 배양적 특성분석 및 제제화, 대량배양 그리고 시생산한 제품의 소면적 포장활성검정을 실시하였다. ISE14 균주는 10회 연속 계대배양 후에도 7.5×10⁸ cfu/㎖ 수준의 생존균수를 유지하였으며, 배양에 적합한 탄소원은 glucose 1%, 질소원은 yeast extract 2%를 선발하였다. 선발된 배지조성으로 5L jar fermentor에서 30℃, 600rpm, 1vvm 조건으로 24hr 배양한 결과 2×10⁹ cfu/ml 수준의 최대생존균수를 확보하였으며, 이 균주를 50L Jar fermentor(working volume 30L)에서 배양 중 2차례의 glucose (50g/150㎖)를 feeding한 결과 O.D.(optical density)값이 21.3에서 37.0으로 상승하였으나 최대생존균수의 증가는 발생하지 않았다. 이 균주의 원제는 고상과 액상의 형태로 검토하여 균주의 생존에 유리한 형태인 고상으로 결정하였다. 동결건조된 고상원분의 생존균수는 8×10⁹ cfu/g이며, 이 원분의 제형은 고상의 수화제, 입제, 입상수화제, 액상의 액상수화제를 검토하였으며, 그 결과 제제의 경시안정성시험을 통해 균주 생존력이 우수한 고상의 수화제를 선발하였으며, 부재 및 계면활성제를 검토하여 규조토와 음이온 계면활성제인 PX를 선발하였다. 선발된 수화제는 50℃보관 7일 후 5.2×10⁴ cfu/g, 14일 후 2×10² cfu/g이었으며, 이후에는 생존균수가 나타나지 않았다. 실온보관의 경우 7일 후 6.7×10⁶ cfu/g, 14일 후 2.8×10⁵ cfu/g이었고, 처리56일까지 9～5.6×10³ cfu/g수준의 생존균수를 유지하였다. ISE14의 원제 및 시제품에 대해 급성경구독성, 급성
경피독성, 어독성을 검토한 결과 급성경구, 급성경피 독성시험에서 반수치사약량(LD50)은 5,000mg/kg이상으로 독성분류상 저독성으로 확인되었으며, 어독성시험의 경우 반수치사농도 (LC50, 48hrs)는 10ppm이상으로서 독성분류상 어독성Ⅲ급으로 확인되었다. ISE14균주의 대량생산은 산업용 발효기(5톤)와 동결건조기를 이용하여 2.7×10³ cfu/g의 원제를 생산한 후 혼합기에서 부자재와 혼합하여 30%수화제를 시생산하였다. 생산된 원제의 생물활성 결과 온실 51.3%와 소규모 포장 49.0%의 역병 방제효과를 보였으며, 시제품의 경우 역병 다발생 노지포장(경북 의성 소재)에서 검증하였으며, 그 결과 500배 희석처리시 최종약제처리 8일후 36.4%, 29일후 16.5%의 낮은 방제효과를 나타내었다.

Abstract ▼

Currently, yield and quality of marketable peppers are frequently limited by Phytophthora blight caused by the oomycete pathogen Phytophthora capsici in Korea. The control for Phytophthora blight of pepper is dependent on use of chemicals such as metalaxyl, phenlyamide fungicide or fosetyl-Al. Howev

Currently, yield and quality of marketable peppers are frequently limited by Phytophthora blight caused by the oomycete pathogen Phytophthora capsici in Korea. The control for Phytophthora blight of pepper is dependent on use of chemicals such as metalaxyl, phenlyamide fungicide or fosetyl-Al. However, consistent application and misuse of these chemicals can cause development of fungicide resistant pathogen, destruction of an ozone layer, residue problems of agrichemicals. Therefore, as an alternative for these control measures, biological control with many different types of microorganisms has been regarded as an attractive, environmental-sound alternative for plant disease control. In addition, consumers prefer environmental friendly vegetables and concerns and demands on environmentally friendly biocontol agents have been increased. Therefore we will produce a higher value added in agriculture and environmentally friendly growing procedures through development of biocontrol agents using antagonistic rhizobacteria against Phytophthora blight of pepper.
In this study, we isolated 439 rhizobacterial strains from soil of cucumber, pepper and tomato of 12 regions of Korea from 2001 to 2003. Out of 439 bacterial strains, 16 potentially antagonistic strains were screened through radicle and seedling assays and in planta trials, and five candidate strains, CCR04, CCR80, GSE09, ISE13, and ISE14, were selected for field tests. we conducted a sequential screening procedure to select antagonistic rhizobacteria against Phytophthora capsici and evaluated control efficacy of drench or root-dip treatments with the selected strains against Phytophthora blight of pepper in the field. In 2005 and 2006 tests, the control efficacy of the five strains was examined against Phytophthora blight of pepper plants drenched with the bacterial suspension in artificial pathogen inoculation. Three strains, CCR04, CCR80, and ISE14, consistently reduced the disease in both tests. As another form of application, the control efficacy of root-dip treatment was examined on pepper plants just prior to transplanting in the field with natural inoculation in 2006 and 2007. In these tests, four strains, CCR04, CCR80, GSE09, and ISE14, showed consistently good control efficacy against P. capsici, and strains CCR80 and ISE14 increased pepper fruit yield. The strain-treated roots had less infection rates by P. capsici compared with control roots regardless of drench or root-dip treatments. In addition, the strains did not affect the populations of bacteria and fungi in the rhizosphere soil. Therefore, the antagonistic strains selected from the screening procedure provided significant protection against P. capsici through pepper root colonization. These strains could be applied by either drench or root-dip treatment as alternatives to agricultural chemicals to control Phytophthora blight of pepper. We identified previously selected antagonistic bacteria KJ1R5 as Chryseboacterium sp., KJ9C8 as Chryseobacterium wanjuense, KJ2C12 as Bacillus luciferensis and CCR04 and CCR80 as Pseudomonas corrugata, GSE09 as Flavobacterium sp., ISE13 as Lysobacter enzymogenes, and ISE14 as Chryseobacterium indologenes. For estimation of disease suppressive mechanisms of antagonistic rhizobacteria, production of antibiotics, extracelluar enzyme, biofilm, HCN, siderophore and root colonization and competition by the selected antagonistic rhizobacteria were tested. Strian ISE13 produce antabiotics and extracellular enzyme such as proteinase and chitinase, and strain CCR04 and CCR80 have biofilm production, swarming ability and effective root colonization ability. Strain GSE09, ISE13, ISE14 also have root colonization ability compared to E. coli as control strain. Therefore, the selected antagonistic rhizobateria will effectively colonize on pepper roots and protect infection courts against Phytophthora capsici and have biocontrol effects.
For the development of biological control agents to Phytophthora blight, culture characteristic analysis, formulation, industrial fermentation and field test were conducted with Chryseobacterium sp. ISE14. Strain ISE14 was maintained of 7.5×10⁸ cfu(colony forming unit)/ ㎖ after ten times of subculture. 1% glucose as a carbon source and 2% yeast extract as a nitrate source were selected to optimized culture condition. Strain ISE14 was cultured on 5L jar fermentor in selected medium for 24hr at 30℃ (600rpm, 1vvm).
This culture broth has 2×10⁹cfu/㎖ of survival colony unit. Twice glucose feeding were conducted during the strain ISE14 culture on 50L jar fermentor.
From the fermentation test, cultured broth's OD (optical density) was increased from 21.8 to 37.0, but maximum survival colony units were not increased. Solid type was selected as strain ISE14 technical type because this type have advantage of colony survival compared with liquid type.
Survival colony units of freeze-dryed solid technical powder in strain ISE14 was 8×10⁹cfu/g. This technical powder was examined in wettable powder, granule, water dispersible granule and suspension concentrate formulation.
Through the aging test of each formulation, wettable powder was selected.
After it was examined to change inerts and surfactants, diatomaceous earth as inert and anion surfactant PX as surfactant were selected. CFU at 50℃ was maintained 5.2×10⁴cfu/g during 7days and 2.8×10⁵cfu/g during 14days in wettable powder formulation, but cfu was decreased after 14days. Survival cfu at room temperature was maintained 6.7×10⁶cfu/g during 7days, 2.8×10⁵cfu/g during 14days and 9-5.6×10³cfu/g during 56days.
Technique and formulation of strain ISE14 were examined to acute oral toxicity, acute dermal toxicity and fish toxicity. As a results, each lethal dose 50 (LD50) of acute oral toxicity and acute dermal toxicity were over 5,000mg/kg. In case of fish toxicity, lethal concentration (LC50,48hrs) was over 10ppm, these results not have any problem of toxicity.
Through the fermentation of strain ISE14, 2.7×10⁸cfu/g of technical was produced by using five ton industrial fermenter and freeze dryer and then 30% wettable powder was produced after mixed with co-fomulants. Efficacies of strain ISE14 technical against Phytophthora blight in greenhouse and small scale field were 51.3 and 49.0%, respectively. Strain ISE14 formulation was tested in pepper field of prevalent Phytophthora blight (Uiseong in Korea), but efficacies were low being 36.4% at 8 days after last treatment and 16.5% at 29 days after last treatment, respectively.

목차 Contents

• 제 출 문 ... 1
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 13
• 목 차 ... 17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 21
• 제 1 절. 연구개발의 목적 ... 21
• 제 2 절. 연구개발의 필요성 ... 22
• 제 3 절. 연구개발의 범위 ... 27
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 30
• 제 1절. 국내.외 관련기술의 현황과 문제점 ... 30
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 39
• 제 1절. 연구개발 수행 내용 ... 39
• 제 2절. 연구개발 결과 ... 56
• 제 1 세부과제 : 내생·근권세균 이용한 생물적 방제용 미생물 살균제 개발 ... 56
• 1. 기선발된 내생·근권세균의 고추 역병에 대한 길항효과 재검정 및 포장검정 ... 56
• 가. 길항 근권 세균의 수집 ... 56
• 나. 길항세균의 순차적 선발 - 유근 검정 (radicle assay) ... 57
• 다. 길항세균의 순차적 선발 - 유묘 검정 (seedling assay) ... 59
• 라. 길항세균의 순차적 선발 - 성체식물 검정 (plant trial) ... 59
• 마. 길항세균의 포장 검증 ... 61
• 2. 선발된 내생 · 근권 세균과길항미생물의 생리, 분자생물학적 분류, 동정 ... 78
• 가. 16S rDNA sequence 분석을 통한 동정 ... 78
• 나 고추 역병에 대한 기선발 . 내생·근권 길항 세균의 투과전자현미경 관찰 ... 85
• 다. Biolog 분석 ... 87
• 라. Fatty acid methyl ester (FAME) analysis를 통한 동정 ... 88
• 마. 생리생화학적 특성에 의한 동정 ... 92
• 3. 선발된 내생.근린 세균의 고추병에 대한 병 억제 작용 기작 연구 ... 98
• 가. 항생물질 분비 ... 98
• 나. 세포외 효소 분비 ... 103
• 다. Biofilm 형성 ... 106
• 라. HCN 형성 ... 107
• 마. Siderophore 형성 ... 108
• 바. Swarming ability ... 109
• 사. 근권 세균에 의한 식물호르몬 IAA의 생성 ... 110
• 4. 내생·근권 세균을 처리한 고추에서 길항세균의 식물근권 정착 능력 연구 ... 111
• 5. 내생·근권세균의 고추역병균과의 경쟁에 대한 연구 ... 113
• 6. 탄소원 첨가에 의한 생물학적 방제 효과의 증진 연구 ... 114
• 가. ISE14의 탄소원 이용도 조사 ... 114
• 나. 탄소원을 첨가에 의한 생물적 방제균 KJ1R5의 고추 역병 방제 효과 증진 ... 118
• 다. 여러 탄소원의 추가에 의한 KJ1R5의 P. capsici 에 의한 고추 역병 방제 효과 증진 ... 120
• 협동과제 : 생물적 방제용 미생물제제의 상업화 연구 ... 123
• 1. 선발된 균주에 대한 기초배양연구 및 시험용 원제확보 ... 123
• 가. 생산균주의 순계 확인 및 안정화 ... 123
• 나. 선발 균주의 type culture를 통한 배양 양상 구명 ... 124
• 2. Pilot scale 배양수행 및 배양액의 원제형태 결정 ... 125
• 가. 기존배지를 출발점으로 생물적 방제를 위한 최적조건으로 배양법 확립 ... 125
• 나. 대량배양 공정개발을 위한 예비시험 ... 133
• 3. 생물농약 등록에 만족하는 제형화 개발 ... 139
• 가. 기본 제형연구 ... 139
• 나. 제형개발 및 처방개선 검토 ... 143
• 다. 약효증진용 부자재 탐색 ... 144
• 라. 계면활성제의 종류에 따른 안정적인 제형개발 ... 145
• 마. 포장시험 및 제조허가용 시제품 제조 ... 148
• 4. 생물농약 원제 및 제품에 대한 독성시험 ... 148
• 가. ISE14 원제의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 148
• 나. ISE14 원제의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 152
• 다. ISE14 원제의 잉어를 이용한 단회 투여 급성독성시험 ... 156
• 라. ISE14 30% 수화제의 마우스를 이용한 단회 투여 경구독성시험 ... 159
• 마. ISE14 30% 수화제의 랫드를 이용한 단회 투여 경피독성시험 ... 162
• 바. ISE14 30% 수화제의 잉어를 이용한 단회 투여 급성독성시험 ... 166
• 5. 대량생산을 통한 시제품 제작 ... 170
• 가. ISE14 균주의 대량배양 ... 170
• 나. 시제품 제작 ... 170
• 6. 생물약효시험 및 포장시험 ... 170
• 가. in vivo 시험에서 기본제제의 활성 검정 ... 170
• 나. 소포장실험을 통한 기본제제의 활성검정 ... 171
• 다. 포장시험에서 시제품의 활성 검정 ... 173
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 175
• 1. 1차년도 연구개발의 목표 달성도 ... 175
• 2. 2차년도 연구개발의 목표 달성도 ... 176
• 3. 3차년도 연구개발의 목표 달성도 ... 178
• 4. 최종평가의 착안점 및 관련 분야에의 기여도 ... 179
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 181
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 185
• 제 7 장 참고문헌 ... 190
• 끝페이지 ... 198