보고서 정보
주관연구기관 |
성균관대학교 SungKyunKwan University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2007-05 |
과제시작연도 |
2006 |
주관부처 |
농림부 Ministry of Agriculture and Forestry |
등록번호 |
TRKO201400022834 |
과제고유번호 |
1380000487 |
사업명 |
농림기술개발 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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초록
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○ 연구결과
1) 인삼 (panax ginseng C.A. Meyer)은 약용식물로써 수 천년 전부터 사용되어 왔다. 특히,한국 야생 인삼은 병과 건강 개선의 넓은 범위 안에서 그것의 우수한 효과 때문에 다른 인삼 들보다 가치가 높게 평가 되고 있다. 현재, 야생 인삼과 재배 인삼간의 성분 (ginsenoside)에 관한 연구는 보고 되어있으나 분자 수준에서의 연구는 보고 되어있지 않은 실정이다. 그리고 야생 인삼과 재배 인삼의 구분은 전통적으로 전문가에 의한 감정에 의해 분류되고 있다. 우리는 유전학적 분석을 위해 한국 야생
○ 연구결과
1) 인삼 (panax ginseng C.A. Meyer)은 약용식물로써 수 천년 전부터 사용되어 왔다. 특히,한국 야생 인삼은 병과 건강 개선의 넓은 범위 안에서 그것의 우수한 효과 때문에 다른 인삼 들보다 가치가 높게 평가 되고 있다. 현재, 야생 인삼과 재배 인삼간의 성분 (ginsenoside)에 관한 연구는 보고 되어있으나 분자 수준에서의 연구는 보고 되어있지 않은 실정이다. 그리고 야생 인삼과 재배 인삼의 구분은 전통적으로 전문가에 의한 감정에 의해 분류되고 있다. 우리는 유전학적 분석을 위해 한국 야생 인삼, 재배 인삼 및 외국 인삼 (중국 야생 인삼, 재배 인삼, 미국 야생 인삼, 캐나다 야생 인삼 그리고 일본 재배 인삼)등을 사용하였다. 첫 번째, RAPD는 DNA 다 형성을 보기가 용이하고 실험 조작이 간편하고 빠르며 단 하나의 DNA 절편까지도 증폭되어 밴드로 나타날 수 있을 정도로 그 감응도가 높기 때문에 인삼과 산삼 개체간의 유전적 다양성을 분석하는데 사용되었다 (Lin et al., 1994). 야생 인삼은 자가수분을 통해 번식하여 형태진화를 하지 않은 화석 식물로 RAPD-PCR를 통해 산삼과 인삼을 분석해 보면 산삼과 인삼이 유전적으로 다른 양상을 나타내었고, 산삼끼리도 다양한 환경에 따라 유전적 다양성을 나타내었다. 또한 인삼도 자가수분을 하지만 재배 인삼끼리는 변이가 거의 없었는데 야생 인삼은 변이가 많은 것으로 보아 인삼보다 야생 인삼이 먼저 자생하기 시작하였다는 것을 알 수 있다. 두 번째, 좀 더 정확한 변이 분석을 위해 엽록체, 미토콘드리아, genomic DNA의 목표 유전자를 정해 증폭하여 sequencing을 하였다. 야생 인삼을 재배 인삼과 비교하여 종간의 변이를 찾아 볼 수 있었으며, 야생 인삼간에서의 변이도 확인할 수 있었다. 야생 인삼간의 변이는 서식하는 지역 간에 유전적인 교류가 거의 없이 유전적 격리가 일어난 상태로 진화해 온 것이라고 추정된다. 마지막으로, 종간의 유전적 차이를 비교 분석할 수 있는 방법으로 특이적인 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 분자 마커들을 개발 하였다.
이와 같은 분자 마커들을 이용함으로써 시료에 대한 동정이 가능하게 되었고 현재 대량으로 재배되고 있는 재배 인삼의 유전적인 증명과 중국산 재배 인삼의 유전자 검사에도 사용될 수 있을 것이며, 야생 인삼과 재배 인삼의 구별이 용이하게 할 수 있었다. 본 연구를 통하여 20가지의 marker set를 개발하였고, 다양한 분석을 통해 각 개체들을 분석할 수 있었다. 앞으로 인삼과 야생삼의 유전적 차이를 비교 분석 할 수 있는 방법을 더욱 구축해야 할 것이며, 많은 연구를 통해 두 개체간의, 종간의 변이 분석을 용이하게 해야 할 것이다.
2) 본 연구는 한국산 인삼, 중국산 산양삼으로부터 한국산 산양삼만의 성분적 특성을 연구하기 위해 수행하였다. 먼저 한국산 인삼, 중국산 산양삼, 한국산 산양삼을 70% EtOH로 추출하였으며, 이 각각의 70% EtOH extract를 n-Hexane, CHCl3, n-BuOH, H2O 순으로 용매 분획하여 활성팀에 시료를 제공하였으며, 각각의 n-Hexane, CHCl3, n-BuOH, H2O분획에 대하여 TLC (thin layer chromatography), HPLC, LC-MS 패턴 분석을 수행한 결과 특별한 차이는 발견되지 않았다. 그리고 이 중 가장 활성이 우수한 한국산 산양삼의 n-BuOH 분획으로부터 각종 분리 정제 기술 (sephadex LH-20, LPLC system, HPLC system)을 이용하여 10종의 saponin (1-10)을 분리하였으며 NMR, MS등의 기술을 이용하여 (1), ginsenoside Re (2), ginsenoside Rc (3), ginsenoside Rb1 (4), ginsenoside Rb2 (5), ginsenoside Rd (6), (20S)-ginsenoside Rg3 (7), ginsenoside F2 (8), ginsenoside Rb3 (9), compound O (10) 로 구조를 규명하였다. 또한 UPLC/MS/MS를 이용하여 70% EtOH extract, n-BuOH 분획에 대하여 위의 10종의 saponin의 정량 분석을 수행한 결과 한국산 인삼, 중국산 산양삼, 한국산 산양삼에서 함량의 차이점은 발견되지 않았다.
3) 본 연구는 한국산 인삼, 중국산과 한국산 산양삼을 용매별로 추출한 분획이 생리활성에 미치는 영향을 검토하고자 시행하였다. 각 분획들의 SOD유사활성을 측정한 결과 한국산 산양삼의 H2O 분획에서 24.3%의 활성을 나타내었다. 전자공여능력은 시료의 분획 모두 농도의존적이였으며 hexane 분획이 가장 높은 전자공여능력을 나타내었고 한국산 산양삼의 경우에는 600㎍/mL의 농도에서 71.4% 가장 높은 전자공여능력을 보여주었다. ACE 저해효과는 한국산 산양삼(III)의 분획이 24.8%로 ACE 저해효과가 가장 높았고 그 다음이 한국산 인삼(I), 중국산 산양삼(II) 순으로 나타났다. 세포독성을 통한 항암효과는 실험한 모든 암세포주에서 용매추출물별 시료 농도가 증가함에 따라 세포독성이 증가하는 경향을 나타내었고 시료들의 butanol과 hexane 분획이 강한 세포독성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이들 추출물 중에서 강한 생리활성을 나타내는 한국산 산양삼의 butanol 추출분획을 2가지의 세부분획(B1, B2)으로 분획하여 실험한 결과, 각 세부분획의 생리활성은 부탄올 추출분획 자체보다 낮은 생리활성을 나타내어 부탄올 추출물의내의 복합적인 성분이 생리활성에 영향을 미치는 것으로 나타내는 것으로 나타났다. 산양삼 추출물들이 마우스의 생체에서의 면역활성에 미치는 영향은 마우스의 복강 대식세포에서는 추출물의 농도가 높아짐에 따라 hydrogen peroxide, nitric oxide의 생성과 탐식작용이 증가하였다. 또한 산양삼 추출물은 복강대식세포에서 TNF와 IL-6와 같은 cytokine의 분비유도를 가능하게 하였다. 특히 마우스 비장세포에서의 T cell, B cell의 증식능력에 한국산 산양삼 추출물의 효과가 높았으며 NK cell의 활성에도 영향을 미치는 것으로 측정되었다. 따라서 항산화활성과 ACE저해효과, 항암효과 및 면역활성 모두에서 한국산 산양삼의 분획이 높은 활성을 나타낸 결과는 한국산 산양삼의 우수성을 입증하는데 기초자료로 이용할 수 있을 것이다. 강한 생리활성을 나타내는 이들 물질 중에서 한국 사과의 butanol 추출물을 2개의 성분으로 나누어 실험한 결과, 성분의 생리활성은 부탄올 추출물 자체보다 낮은 생리활성을 나타내었다.
4) 인삼은 오랫동안 자기 환경에 알맞게 진화해왔다. 조금씩 자기가 처한 환경에서 잘 살수 있도록 적응해 왔으며 그 환경에 맞게 자신을 변화시켜 왔다. 그러므로 인삼이 자연조건에서 살아온 환경을 만들어 주면 가장 좋아하고 그래서 가장 잘 클 것이다. 따라서 산삼의 생태에 대한 지식은 산삼생산 재배에 크게 활용할 수 있다. 인삼의 자생지는 삼국의 강토(고구려, 신라, 백제)에만 분포한다(1). 그래서 조상들은 먼 옛부터 인삼을 사용했고 4000여년 전에 인삼의 11가지 효능을 정립하였다(2). 그런데 지금 우리나라는 인삼의 자생지이지만 인삼자생지에 대한 조사, 보고가 없다. 해마다 산삼을 캤다고 신문에 나오지만 산삼이 자란곳의 환경조사 논문은 한 건도 없다. 백두산이 있는 장백산맥 일대(고구려땅)에서 산삼이 많이 채취되고 이들에 관한 연구보고가 중국에 있으며 우리나라와 소련이 접해있는 소련영인 연해주(발해강토)에 인삼이 자생하므로 소련에서 야생인삼의 조사 보고가 있다. 우리 조상들이 산삼을 많이 관찰하였으며 그 결과로 오늘의 재배법이 발전해왔다. 조상들의 기록은 있으나 상당히 간단하다. 종삼보(種蔘譜)와 같은 단행본 재배책도 있었지만 기록이 없어지고 원리만 요점적으로 남아있다. 이제 현대과학으로 조사기록을 해놓아야 하고 그것을 바탕으로 재배방법을 발전시킬 수 있게 해야 한다.
Abstract
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Title : Establishment of classified system between Korean cultivated wild ginseng and Chinese cultivated wild ginseng and studies on its property
Ⅰ. Korean Wild Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) has been used as medicinal plant for many thousand years. Especially, Korean Wild ginseng is the most
Title : Establishment of classified system between Korean cultivated wild ginseng and Chinese cultivated wild ginseng and studies on its property
Ⅰ. Korean Wild Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) has been used as medicinal plant for many thousand years. Especially, Korean Wild ginseng is the most famous ginseng among others because of its superior effectiveness in the broad range of illness and health improvement. However, generic analysis of Korean wild ginseng has not been intensively studied yet.
Traditionally, the authentication of Korean ginseng has relied upon morphological and histological inspection. Furthermore, the roots of Chinese ginseng and Korean ginseng are very similar in morphological appearance. In order to research the genetic characteristics of Korean wild ginseng, we compared the genetic differences among Korean wild ginseng, Korean cultivated ginseng, Chinese cultivated ginseng, American wild ginseng and Canadian wild ginseng. First, we used method of PCR-RAPD (randomly amplified polymorphic DNA). PCR-RAPD analysis was carried out using a 10mer-random primer. In many cases, in the authentication of different Panax species, such an approach is hardly reliable. Furthermore, next goal of studies is to reveal genetic characteristics of Korean wild ginseng through variation analysis of Mitochondria DNA regions, Chloroplast DNA regions and Genomic DNA regions. We detected sequence variations, between Korean wild ginseng and other various ginsengs. Finally, using these data, we are going to develop genetic markers for identification of Korean wild ginseng and other various ginsengs.
Ⅱ. This study was conducted to research characteristic constituents of Korea cultivated ginsengs, Chinese mountain ginsengs and Korea mountain ginsengs. by using various chromatographic analysis. The TLC (thin layer chromatography), HPLC and LC-MS analysis were performed to compare their compounds in Korea cultivated ginsengs, Chinese mountain ginsengs and Korea mountain ginsengs. It showed little difference in CHCl3, n-BuOH and H2O fractions in TLC, HPLC and LC-MS pattern. The chromatographic separation of n-BuOH fraction of Korea mountain ginsengs led to the isolation of ten saponins (1 - 10). Their structures were determined to be ginsenoside Rg1 (1), ginsenoside Re (2), ginsenoside Rc (3), ginsenoside Rb1 (4), ginsenoside Rb2 (5), ginsenoside Rd (6), (20S)-ginsenoside Rg3 (7), ginsenoside F2 (8), ginsenoside Rb3 (9), and compound O (10) by physicochemical and spectroscopic methods. The quantitative analysis of these compounds (1 - 10) was studied in Korea cultivated ginsengs, Chinese mountain ginsengs and Korea mountain ginsengs by UPLC/MS/MS. The difference in the amount of ten isolated saponin were not characteristic among three samples.
Ⅲ. This study was conducted to investigate the physiological effects of Korean ginseng, Chinese-cultivated wild ginseng and Korean-cultivated wild ginseng by using various solvent extractions. We measured SOD-like activity of each fraction, and A H2O extract of Korean-cultivated wild ginseng showed SOD-like activity of 24.3%. Electron Donating Ability(EDA) in a dose-dependent manner in all fractions, and a hexane extract showed the highest EDA. Among them, that of Korean-cultivated wild ginseng showed the highest EDA of 71.4% at 600㎍/mL. The extract of the Korean-cultivated wild ginseng showed the highest ACE inhibitory effect of 24.8%, and Korean ginseng, Chinese-cultivated wild ginseng showed higher ACE inhibitory effect one after another. Anti-cancer effect through cytotoxicity had a tendency to increase by increasing of samples' concentration in all extract fractions and cancer cell lines. Besides, it was observed that butanol extracts and hexane extracts showed strong cytotoxic effect. As a result of two detailed Korean-cultivated wild ginseng fractions'(B1,B2) experiments,, each fraction showed lower physiological effect than butanol extracts itself. Thus, it showed that complex constituents in butanol extracts have biological effects. Phagocytosis and the production of hydrogen peroxide and nitric oxide increase in the fractions' dose dependent manner. Besides, the fractions made possible fractions' secretory induction of cytokines like TNF-α and IL-6 in peritoneal macrophage.
Especially, the fractions have good effects on T cell and B cell proliferation of mouse splenocytes, and it also showed the positive effect on NK cell activity. Consequently, the result that Korean-cultivated wild ginseng showed high activity of anti-oxidation, ACE inhibition, anti-cancer and immune activities can be of utility value as a basic data to demonstrate the superiority of Korean-cultivated wild ginseng.
목차 Contents
- 제출문 ... 1
- 요약문 ... 2
- SUMMARY ... 9
- CONTENTS ... 12
- 목차 ... 15
- 제1장 연구개발과제의 개요 ... 18
- 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 18
- 1. 기술적 측면 ... 18
- 2. 경제·산업적 측면 ... 19
- 3. 사회·문화적 측면 ... 20
- 제2절 연구개발의 내용 및 범위 ... 21
- 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 24
- 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 25
- 제1절 한국산 장뇌산삼과 중국산 장뇌삼의 유전적 비교연구 (제1세부과제) ... 25
- 1. 연구개발 내용 ... 25
- 가. 식물재료 ... 25
- 나. RAPD-PCR ... 25
- 다. 유전자 마커 개발 ... 27
- 라. 유전자 변이 분석 ... 27
- 2. 연구개발 수행결과 ... 28
- 가. RAPD 방법에 의한 유전적 특성 및 유연관계 분석 ... 28
- 나. 유전자 마커 개발 ... 35
- 다. 유전자 변이 분석 ... 41
- 제2절 한국산 장뇌산삼, 인삼 및 중국산 장뇌삼 구성 성분의 정성 - 정량 분석 (제2세부과제) ... 71
- 1. 연구개발 내용 ... 71
- 가. 1차년도 (2004년) ... 71
- 나. 2차년도 (2005년) ... 74
- 다. 3차년도 (2006년) ... 77
- 2. 연구개발 수행결과 ... 87
- 가. 1차년도 (2004년) ... 87
- 1) 추출 조건 결정 ... 87
- 2) TLC 패턴 분석 ... 87
- 3) HPLC 패턴 분석 (Fig. 2-8) ... 89
- 4) GC 패턴 분석 ... 89
- 나. 2차년도 (2005년) ... 97
- 1) LC MS 패턴 분석 ... 97
- 2) HPLC 분리조건 확립 ... 107
- 다. 3차년도 (2006년) ... 107
- 1) 10종 물질의 화학 구조 해석 ... 107
- 2) 정량 분석 결과 ... 122
- 제3절 한국산 장뇌산삼, 인삼 및 중국산 장뇌삼 추출물의 생리활성 비교 검증 ... 125
- 1. 연구개발 내용 ... 125
- 가. 추출 방식에 따른 한국산 산양삼, 인삼 및 중국산 산양삼 추출물의 일반적 생리활성 비교 검증 ... 125
- 나. 한국산 산양삼 추출물의 분획에 따른 생리활성 비교 ... 126
- 다. in vivo에서의 한국산 산양삼 추출물의 생리활성 검증 ... 129
- 2. 연구개발 수행결과 ... 135
- 가. 추출 방식에 따른 한국산 산양삼, 인삼 및 중국산 산양삼 추출물의 일반적 생리활성 비교 검증 ... 135
- 나. 한국산 산앙삼 추출물의 분획에 따른 생리활성 비교 ... 143
- 다. in vivo에서의 한국산 산양삼 추출물의 생리활성 검증 ... 152
- 제4절 한국산 장뇌산삼의 평가체계 확립 (제4세부과제) ... 167
- 1. 연구개발 내용 ... 167
- 가. 한국산 산양삼의 재배현황 조사 및 시장조사 ... 167
- 나. 한국산 산양삼의 품질 평가 기준 확립 ... 167
- 2. 연구개발 수행결과 ... 167
- 가. 한국산 산양삼의 재배 현황 조사 및 시장조사 ... 167
- 나. 한국산 산양삼의 품질 평가 기준 확립 ... 169
- 다. 산삼의 자생지 특성 ... 171
- 라. 산양삼 재배방법 ... 174
- 마. 산양삼 재배하기 ... 176
- 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 179
- 제1절 목표달성도 ... 179
- 제2절 관련분야에의 기여도 ... 180
- 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 181
- 제1절 활용계획 ... 181
- 제2절 추가연구의 필요성 ... 181
- 제3절 타 연구의 응용성 ... 182
- 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 183
- 제7장 참고문헌 ... 186
- 끝페이지 ... 192
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