보고서 정보
주관연구기관 |
(주)더멋진바이오텍 |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2005-07 |
과제시작연도 |
2004 |
주관부처 |
해양수산부 Ministry of Oceans and Fisheries |
등록번호 |
TRKO201400023306 |
과제고유번호 |
1520001503 |
DB 구축일자 |
2014-11-10
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초록
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Ⅵ. 연구개발결과
○ 베타글루칸 대량생산 공정을 확립
1) 돌연변이주 개발: Agrobacterium 속 모균주보다 생산성이 20% 향상된 돌연변이주를 개발하였다.(대한민국 특허 450277)
2) 발효 최적화 : 탄소원으로는 설탕, 질소원으로는 염화암모늄을 선정하고, 세포성장시기와 베타글루칸 생산시기(베타글루칸은 질소원이 고갈된 후 생산이 됨) 를 나누고, 질소원이 고갈되는 시점에서 pH를 7.0에서 5.5 로 전이하는 이단계 회분식 배양법을 개발하였다.
이 결과 5리터 발효조에서 5일간 배양 후 베타그루칸을
Ⅵ. 연구개발결과
○ 베타글루칸 대량생산 공정을 확립
1) 돌연변이주 개발: Agrobacterium 속 모균주보다 생산성이 20% 향상된 돌연변이주를 개발하였다.(대한민국 특허 450277)
2) 발효 최적화 : 탄소원으로는 설탕, 질소원으로는 염화암모늄을 선정하고, 세포성장시기와 베타글루칸 생산시기(베타글루칸은 질소원이 고갈된 후 생산이 됨) 를 나누고, 질소원이 고갈되는 시점에서 pH를 7.0에서 5.5 로 전이하는 이단계 회분식 배양법을 개발하였다.
이 결과 5리터 발효조에서 5일간 배양 후 베타그루칸을 60g/L 이상 고농도로 생산할 수 있었다.
3) Scale-up 기술개발로 베타글루칸 발효공정 확립
Agrobacterium 은 호기성 균주로 산소 요구도가 크기 때문에 산소전달을 원할히 하기 위하여, 교반속도를 올리거나 (5리터 교반조에서는 700rpm) 공기 공급을 충분히 (공기부양형 배양기에서 0.75vvm) 하였을때 생산성은 대규모 발효조에서도 큰 차이가 없었다.
이 연구를 위하여 각각 300리터 교반형 발효기, 6톤과 34톤의 공기부양혈 발효기 (air lift fermentor) 를 사용하였다. 대량생산을 위하여 34톤 발효조를 이용하였다. 플라스크에균주를 접종하여 24시간 배양하고 7리터 발효조로 전이하여 20시간, 300리터로 전이하여 12시간, 그리고 6톤 발효조에서 15시간 발효한 배양액 3톤을 30톤에서 배양부피를 22톤으로 하여 온도 30℃, 통기량 0.75vvm 으로 하여 배양하였다. 세포성장은 초기 12시간 지속되고 질소원이 고갈되면 세포성장이 중단되고 베타글루칸이 생성되기 시작한다. 최종 120시간 배양후 베타글루칸 농도가 60g/L 를 상회하였다. 배양액 부피는 증발로 20톤 정도로 감소하였으나, 최종 베타글루칸 생산량은 1200kg 에 달하였고, 이때 설탕의 베타글루칸에로의 전환률은 0.42g/g 이었다.
4) 베타글루칸 분말 생산 공정을 확립:
베타글루칸 분말을 대량으로 생산하기 위해서는 발효액으로부터 베타글루칸의 분리, 건조, 그리고 분쇄 공정이 필요하다. 베타글루칸은 수용액에서 불용성이므로 원신분리에 의해서 삼등액으로부터 분리된다. 이를 위하여 ecanter 연속원심분리기를 선정하였으며 유속을 300리터/hr로 하여 1기 당 일간 200kg의 베타글루칸을 생산할 수 있으며 이때 수율은 80%를 상회한다. 열풍건조기에서 50℃로 건조한 시료는 경도가 높기 때문에 햄머밀(hammer mill) 분쇄기가 적합하고, 시간 당 300kg 이상 생산할 수 있었다. 이렇게 조분쇄한 시료는 최종적으로 에어밀로 미분쇄한다. 미분쇄된 시료중의 베타글루칸 함량은 75% 이며 분말의 입도는 150um 이었다. 이렇게 확립한 공정은 베타글루칸 함량 기준으로 월 2000kg 이상 대량생산할 수 있다.
○ 베타글루칸의 면역증강효과를 과학적으로 입증
베타글루칸의 면역증강 효과를 관찰하기 위하여 넙치 치어를 대상으로 하였으며, 대조구와 사료 당 베타글루칸을 0.01%, 0.025%, 0.05%, 0.1% 첨가한 실험구를 사용하였다. 베타글루칸을 0.05%이상 공급한 사료구에서 보체 경로 활성 (ACH50)과 혈청의 lysozyme 활성, 그리고 두신 phagocyte의 chemiluminecent (CL) 반응이 가장 높아, 베타글루칸이 비특이적 면역반응을 강화함을 확인할 수 있었다. 베타글루칸이 폐사율 억제 효과가 있는지 알아보기 위하여 Edwardsiella tarda를 접종하여 폐사율을 관찰하였다.
대조구에서는 접종 3일 후부터 폐사가 발생하여 6일 이내에 모든 폐사된 반면 베타글루칸을 함유한 실험구에서는 초기 폐사율이 현저히 감소되었으며 0.05% 이상에서는 7일 경과 후 에도 30% 이상이 생존하였다. 이상의 경과로부터 베타글루칸이 넙치의 면역력을 증가시키는 효과를 확연히 알 수 있었다.
○ 베타글루칸과 성장촉진용 아미노산 복합체로 이루어진 최종 사료첨가제의 설계
양식어의 면역증강뿐만 아니라 성장촉진을 위하여 사료첨가제 배합에 대한 연구를 하였다. 사료첨가제는 베타글루칸과 케라틴 가수분해물로 구성되었다. 케타틴 가수분해물의 아미노산 조성은 아르기닌, 히스티딘, 이소루이신, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 발린, 시스틴, 세린, 프틀린 등을 1에서 7% 함유한다. 넘치치어를 대상으로 최종 급이되는 사료 중 베타글루칸 농도를 0.05%에서 0.15%, 아미노산 복합체 함량을 0.45%에서 1.35%로 조정한 실험구를 급이하면서, 면역증강, 사료효율, 증체에 대한 연구를 하였다. 혈액 및 혈청의 성분 분석에서 헤모글로빈은 베타글루칸이 첨가된 모든 실험구에서 높았으며 헤마토크리트는 베타글루칸 농도 0.1%이상에서 유의적으로 높았다. 혈청내 GOT 양이 베타글루칸 0.1%함유 실험구에서 낮았다. 한편, 베타글루칸을 0.1%에서 0.15%로 하고 아미노산 복합체를 0.9%에서 1.35%한 실험구에서 증체율이 다른 실험구보다 50% 이상 높았으며, 사료효율, 일간성장률, 단백질 전환효율도 높았다. 이상의 결과로부터 최종 사료중급이되는 베타글루칸 함량은 0.1% 아미노산 복합체의 함량은 0.9%로 함이 면역력 강화와 증체에 가장 우수할 것으로 판단되었다.
○ 시제품의 현장적용 시험 및 제품화 연구
최종 시제품의 조성은 이차년도 연구 결과를 토대로 베타글루칸과 아미노산 복합체가 면역증강 및 증체에 유효한 농도와 제품의 가격 경쟁력을 고려하여 배합비를 설계하였다.
시제품을 ‘베타맥스’라 명명하고 그 조성은 베타글루칸 10%, 케라틴 가수분해물 50%, 그리고 3등급 밀가루를 40%로 구성하였다. 제주도 M 양식장을 선정하여 넙치양식현장에 적용하였다. 베타맥스를 MP 사료내 0.5%를 첨가하여 총 2실험구를 8반복으로 나누어 6개월간 사육한, 증체율, 일간성장율과 비만도에 있어서 베타맥스 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다. 헤모글로빈(Hb) 헤마토크리트(hematocrit) 에 있어서 베타맥스 첨가구가 대조구에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다. 육성기 넙치에 있어서 성장 및 사료효율 촉진과 비특이적 면역반응 향상을 위해 면역증강물질과 사료섭취 촉진물질의 혼합제인 베타맥스의 효과를 넙치 양식현장적용이 가능함을 보여주었다.
Abstract
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Ⅵ. Results
○ Development of mass production process of β-glucan
1) Mutant strain: We developed a mutant strain, which showed a higher β-glucan production than the parent strain, Agrobacterium sp. ATCC31750. A maximum β-glucan concentration of 76 g/l was obtained in 120 h of cultivation with th
Ⅵ. Results
○ Development of mass production process of β-glucan
1) Mutant strain: We developed a mutant strain, which showed a higher β-glucan production than the parent strain, Agrobacterium sp. ATCC31750. A maximum β-glucan concentration of 76 g/l was obtained in 120 h of cultivation with the mutant strain, while parent strain produced 64 g/l under the same condition.
2) Fermentation optimization : Sucrose and ammonium chloride were chosen as efficient carbon and nitrogen sources, respectively, for the production of β-glucan. Two-step fed-batch fermentation technique was designed in which biomass was first produced, followed by β-glucan production which was stimulated by nitrogen limitation. pH was controlled at 7.0 at the cell growing stage, and shifted to 5.5 at the time of nitrogen limitation.
3) Mass production of β-glucan in 34 ton air-lift fermeter
The oxygen transfer rate is a crucial factor in the scale-up of the fermentation since Agrobacterium sp. is a strict aerobic bacterium and β-glucan inhibits oxygen transfer at its higher concentration. When a 34 ton scale air lift fermenter was used for the β-glucan production, air was supplied at aeration rate of 0.75vvm. Under the optimized condition, β-glucan concentration was as high as 60 g/l in 120 h operation. Final production amount of β-glucan was 1200kg by one batch fermentation and conversion ratio from sugar was 0.42g β-glucan/g sucrose.
4) development of β-glucan powder production process
As β-glucan is insoluble in aqueous solution, it can be separated from culture broth by centrifugation. When a decanter type of continuous centrifuge was used, 200kg of β-glucan a day was obtained with a higher than 80% recover yield at the flow rate of 300 l/hr. β-Glucan paste was dried in a hot air dryer at 50℃. It is powdered with a hammer mill at a production rate of 300kg/hr. Fine powder with particle size of 100-200um was obtained by using air mill. With this process, the production amount of β-glucan powder having 75% purity was more than 2000kg/month.
○ Verification of immune stimulatory effect of β-glucan
1) Weight gain and feed efficiency of fish fed G0.1 (0.1% β-glucan) diet were significantly higher than those of fish fed control diet.
2) Chemoiluminescence and lysozyme activity of fish fed G0.1 diet were significantly higher than those of fish fed control diet.
3) Fish fed G0.1 diet showed a significantly lower cumulative mortality than did fish fed control diet.
4) These results implies that dietary supplement with β-glucan enhances the non-specific defense mechanism and increase the resistance to disease infection.
○ Development of feed additive consisted of β-glucan and amino acid complex for enhancing growth
Not only for the stimulation of immune system of fish but also enhancement of fish growth, we studied composition of feed additive consisted of β-glucan and amino acid complex (keratin hydrolyate). Feed additive composition varied as follows: β-glucan concentration ranging from 0.05% to 0.15% and amino acid complex concentration ranging from 0.45% to 1.35%. The levels of hemoglobin and hematocrit in the blood serum of fish fed with 0.1 % β-glucan were significantly higher than those without β-glucan. On the other hand, weight gain, feed efficiency, and specific growth rate of the sample fed with β-glucan ranging from 0.1% to 0.15% and amino acid complex ranging from 0.9% to 1.35% were at least 5.% higher than those of the other groups tested. From this result, it was concluded that feed additive composed of 0.1% β-glucan and 0.9% amino acid complex was significantly efficient for both enhancing immune system and increasing weight gain.
○ Field test with the newly developed feed additives (Betamax), and production of final product
Final product named as 'BetaMax' composed with β-glucan 10% , keratin hydrolyate 50%, and wheat powder 40%. Field tests of the product were carried out over 6 months in aquafarms cultivating oliver flounder in CheJu island and Wando island. BetaMax 5 kg was mixed with 1000kg of moist pellet (MP) feed diet. Weight and, specific growth rate, levels of hemoglobin and hematocrit of fish fed with BetaMax were significantly higher than those with the control group. In conclusion, BetaMax developed in this study was proven as an efficient immune stimulation feed additive for oliver flounder farming, revealing a high potential in the market.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 요약문 ... 3
- SUMMARY ... 8
- CONTENTS ... 13
- 목차 ... 15
- 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
- 제 1 절 서론 ... 17
- 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 32
- 제 3 절 연구개발의 목표 및 내용 ... 36
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 38
- 제 1 절 연구사례의 조사 ... 38
- 제 2 절 세부기술사항의 검토분석 ... 39
- 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 42
- 제 1 절 고효율 발효균주 개발 ... 42
- 제 2 절 베타글루칸 생산을 위한 배지 및 발효공정 최적화 ... 46
- 제 3 절 34톤 공기부양식 발효조에서의 베타글루칸 대량생산 ... 60
- 제 4 절 베타글루칸 분말의 제조공정과 성분분석 ... 64
- 제 5 절 베타글루칸의 면역증강 효과 ... 66
- 제 6 절 베타글루칸과 아미노산 복합제로 구성된 첨가제 개발 ... 77
- 제 7 절 베타맥스의 양식 현장적용 실험 ... 86
- 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 109
- 제 1 절 목표달성도 ... 109
- 제 2 절 기대효과 ... 112
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 116
- 제 1 절 미생물 발효에 의한 생산공정 기술의 활용방안 ... 116
- 제 2 절 면역증강 사료 첨가제의 보급확대 ... 116
- 제 3 절 여러 분야에서의 기능성 소재로서의 활용방안 ... 116
- 제 6 장 참고문헌 ... 120
- 끝페이지 ... 133
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