초록 ▼

○ 연구결과
1. DNA 기법을 이용한 고추의 품종식별 및 품종간 최소거리설정
고추 품종간에 다형성을 보이는 AFLP 마커 19개를 개발하여 66품종을 대상으로 다형성 검정을 실시한 결과 125개의 band 중에서 103개가 polymorphism을 보였다.
이를 바탕으로 공시품종을 cluster 분석하였을 때 유전적 유사도 값 0.75를 기준으로 7개 품종군으로 분류할 수 있었다.
고추의 품종 식별에 있어서 SSR 마커의 효율성을 검토하고자, 협동연구과제에서 316개의 primer를 분양받아 polymorph

○ 연구결과
1. DNA 기법을 이용한 고추의 품종식별 및 품종간 최소거리설정
고추 품종간에 다형성을 보이는 AFLP 마커 19개를 개발하여 66품종을 대상으로 다형성 검정을 실시한 결과 125개의 band 중에서 103개가 polymorphism을 보였다.
이를 바탕으로 공시품종을 cluster 분석하였을 때 유전적 유사도 값 0.75를 기준으로 7개 품종군으로 분류할 수 있었다.
고추의 품종 식별에 있어서 SSR 마커의 효율성을 검토하고자, 협동연구과제에서 316개의 primer를 분양받아 polymorphism을 보인 27개를 선발하였다. 품종간 검정에서 다형성을 보이는 89개의 밴드가 증폭되었다. SSR 마커에 의한 전체 유사도 지수는 0.54∼1.00로 나타났고, 유사도 값 0.82를 기준으로 할 때 총 10개의 품종군으로 분류되었다. AFLP와 SSR 마커의 품종간 특성검정에 있어 상관도는 0.82로 높게 나타났다. 고추의 품종간 유연관계 분석에서 PIC 값이 높은 일부 마커는 F₁ 순도 검정에 활용할 수 있는 것으로 조사되었고, F₂ 집단의 경우 마커의 분리양상이 멘델의 이론적 분리비에 적합한 것으로 나타났다.
고추의 품종간 최소거리를 설정하기 위하여 AFLP 유사도 지수와 형태적 특성과의 관계 분석에서 유사도가 96% 이상인 품종들은 형태적 특성조사에서 구별성을 보이지 않았으며, 이 결과는 고추 육종 전문가에 의한 공동 특성조사 결과와도 일치하여, 품종간최소거리를 결정할 수 있었다.
2. DNA 기법을 이용한 참외ㆍ멜론의 품종식별 및 품종간 최소거리설정
기존에 발표된 문헌 등 자료 검색을 통하여 멜론, 오이 등 Cucumis 종 작물에서 유래되어 발표된 137개 SSR 마커를 1차 선발하고, 우리나라 참외 유통품종에서 다형성을 보이는 37개 마커를 최종 선발하였다. 또, 재래종 참외 ‘깐치’를 재료로 5'-anchored PCR과 chromosome walking 방법을 바탕으로 개발된 130여 클론을 대상으로 분석을 진행하여 최종 8개의 참외 유래 고유 SSR 마커를 개발하는 등, 참외품종식별에 활용 가능한 총 45개의 SSR 마커를 개발ㆍ확보할 수 있었다. 이 마커를 활용 ‘금싸라기’ 등 참외 27 품종, ‘VIP' 등 멜론 17 품종 등 참외ㆍ멜론 총 44 품종에 대한 품종간 다형성 검정을 실시한 결과 160개의 allelic band가 분석되었고, 마커들의 평균 PIC 값은 0.580이었다. SSR 마커 특성을 바탕으로 유전적 연관관계를 분석하고 덴드로그램에 의한 품종분류를 실시한 결과, 금싸라기 계통 참외는 similarity distance 0.92 ∼ 1.0에 대부분 포함되는 고도의 유사도를 나타내어, 그간 형태적 특성에서 알려진 유사성을 분자유전학적 측면에서도 확인할 수 있었다. 개발된 마커를 참외ㆍ멜론 F₁ 종자 순도검정에 적용한 결과 그 활용도가 매우 유용하여 기존의 방법들을 대체할 수 있을 만한 신뢰도를 보여주었으며, F₂ 집단에서의 특성도 안정적이어서 1:2:1의 정상적인 분리비를 보여주었다. SSR 마커 특성에 따라 여러 품종조합을 포장에 재배하고 육종가 공동특성조사를 실시하여 밝혀진 품종간 최소거리는 Jaccard's similarity distance 기준 0.91로 설정되었으며, 이 기준은 덴드로그램에 나타난 금싸라기 계통 품종집단의 분류기준과 부합하였다.
3. 고추 SSR 마커 개발
고추에서 이러한 SSR 표지를 개발하기 위해, 2개의 small-insert genomic library와 GenBank 데이터 베이스로부터 표지를 개발하였다. (AT)15, (GA)15, (GT)15, (ATT)10, (TTG)10을 탐침으로 하여 library로부터 SSR 클론을 분리한 후 염기서열을 분석하였다. 이렇게 분리된 130개 클론중, 염기서열 분석결과 77개의 클론에서 SSR 염기서열을 확인하였고, 이를 통해 40개의 SSR 표지가 개발되었다. 염기서열 분석결과 (GA)n, (GT)n, (TTG)n, (AT)n 순으로 고추 게놈 내에 SSR이 존재함을 알 수 있었다. 추가적으로 36개의 SSR 표지가 GenBank와 이미 보고된 결과를 통해 개발되었다. Library에서 개발된 SSR 표지의 PIC 값은 평균 0.76으로 GenBank에서 개발된 것보다 2배가 높았다. 총 46개의 SSR 표지는 Capsicum annuum "TF68"과 C. chinense "Habanero" 이종간 교배를 통해 얻어진 집단으로 만들어진 고추 SNU-RFLP 유전자 지도에 위치 시켰다. 새로운 SNU2 유전자 지도는 46개 SSR와 287개 RFLP로 만들어진 총 333개 표지가 15개 연관군, 평균거리 5.3 cM, 총 1,716.5cM로 구성되었다.

Abstract ▼

Part Ⅰ: Development of DNA Marker Systems and Variety Description of Peppers
This study was carried out to assess the potential of variety identification using AFLP and SSR markers and to establish minimum distance among varieties through relationship between DNA marker and morphological traits f

Part Ⅰ: Development of DNA Marker Systems and Variety Description of Peppers
This study was carried out to assess the potential of variety identification using AFLP and SSR markers and to establish minimum distance among varieties through relationship between DNA marker and morphological traits for testing distinctness, uniformity and stability of pepper (Capsicum annuum L.) varieties.
Sixty-six cultivars were analyzed by AFLP using EcoRⅠ/MseⅠprimer combinations. Nineteen combinations of AFLP primer led to the amplification of 125 scorable fragments ranging from 79 to 748 bp and among these 103 (82.0%) were polymorphic. Based on band patterns, UPGMA cluster analysis was conducted. These cultivars were separated into seven distinctive groups corresponding to varietal types and genetic distance of cluster ranging from 0.49 and 1.00.
Three hundred sixteen SSR markers were employed for fingerprinting for 66 pepper varieties. Twenty seven SSR markers were polymorphic, revealing a total of 89 alleles.
The number of alleles at a locus ranged from 2 to 7, with a mean of 3.29. The average PIC value was 0.529 and it ranged from 0.03 to 0.877. Dendrogram of pepper variety obtained from SSR markers was constructed from genetically similarity data. As in the dendrogram based on AFLP, the 66 pepper variety are differentiated by the SSR genotypes. The dendrogram generated after the UPGMA using SSR-based genetic distances was similar to the dendrogram constructed with the AFLP data. The Mantel matrix correspondence test was used to compare the similarity of the matrices and the correlation coefficient value was 0.82.
Microsatellite markers were used for genetic purity of F1 hybrid. Three SSR markers, HpmsF015, HpmsF037, and HpmsF053, differentiated all the hybrids derived from ‘Chilseongcho/AC2258' and ‘Chilseongcho/KC350-2'. To determine the inheritance mode of SSR marker in F2 population derived from ‘Chilseongcho/AC2258' and ‘Chilseongcho/KC350-2', F2 plants were screened by SSR markers. The segregation ratio of the SSR markers (HpmsF015, HpmsF037, and HpmsF053) was fitted to the theoretical segregation ratio of 1:2:1 or 3:1.
The relationship between morphological characters and genetic similarity through AFLP analysis was analyzed. The highly related varieties (above 96%) based on AFLP analysis was not showed distinctness among pepper cultivars. However, the varieties with less than 96% to genetic similarity was dissimilar from several character such as predominant number of locules in fruit, attitude of peduncle in flower, green color in leaf, etc. Therefore, the molecular genetic distance was consistent with the morphological traits measured for distinctiveness tests. Moreover, hot pepper breeders did not recognized distinctness for varieties with above 96% genetic similarity in comparison of morphological traits and genetic distance through AFLP analysis.
These results could be utilized to complement of DUS test of candidate variety and to select complimentary variety through pre-screening of existing variety in the context of protection of new variety of pepper.
Part Ⅱ: Development of SSR Marker System and Variety Description of Oriental Melons and Melons
Oriental melon is a variety of melon (Cucumis melo L. ver. makuwa) and has broad distribution around Oriental region including Korea, China and Japan. Korea has cultivated the crop since nearly 1500 years ago and also has large varieties of landrace.
Ever since the advent of 'geumssaraki' in 1980s, it has renovated the consumption and made nearly all the market varieties a single line. Therefore, though the crop has become a major fruit vegetables now, the market varieties have narrow genetic distances with high similarity in morphology. However, the reality of genetic similarity in oriental melon varieties has not yet examined systematically. At the present study, we developed SSR marker system and determined genetic distances and minimum distances between varieties of C. melo including major market classes of oriental melon and melon.
In order to get useful SSR　markers for description of oriental melon (Cucumis melo L.), we primarily selected 37 markers from 137 SSRs which were previously reported in Cucumis sepcies plants such as melon and cucumber. Also, new 8 SSR markers were developed from oriental melon, a landrace 'gganchi'. The total of 45 SSR markers were used for the characterization of 44 oriental melon and melon varieties, producing 160 allelic bands with average PIC value of 0.580. Based on the marker patterns, the Jaccard's similarity coefficient were calculated and genetic similarities were determined.
The resulting dendrogram showed two main branches of melon and oriental melon with two sub-branches on each of oriental melon and mixed type, and net-type and no-net type, respectively. Most geumssaraki type varieties clustered in very narrow genetic distances of 0.92 ∼ 1.0, which reassured the known phenotypic similarities in the varieties. The markers were also proved to be very useful when used for the purpose of purity check in F1 seeds in a variety of oriental melon and melon. The inheritance of the marker showed stable and Mendelian segregation mode of 1:2:1 in F2 generation.
The dependence of phenotypic characteristics on molecular genetical characteristics of SSR markers showed high correlation of 0.826 in qualitative traits and 0.878 in quantitative traits. By combining the results of breeder's test and molecular genetical characteristics of SSR markers, the minimum genetic distances between oriental melon varieties were determined at the Jaccard's coefficient of 0.91.
Part Ⅲ : Development of SSR Markers in Pepper
Microsatellites or simple sequence repeats are highly variable DNA sequences that can be used as informative markers for the genetic analysis of plants and animals.
For development of microsatellite markers in Capsicum, SSRs were isolated from two small-insert genomic libraries and GenBank database. Using five types of oligonucleotides, (AT)15, (GA)15, (GT)15, (ATT)10, and (TTG)10, as probes, positive clones were isolated from the genomic libraries, and sequenced. Out of 130 positive clones, 77 clones showed SSR motifs, out of which 40 reliable SSR markers were developed. (GA)n and (GT)n sequences were found to occur most frequently in the pepper genome, followed by (TTG)n and (AT)n. Additional 36 SSR primers were also developed from GenBank and other published data. To measure the information content of these markers, the polymorphism information contents (PICs) were calculated.
Capsicum SSR markers from genomic libraries have shown a high level of PIC value, 0.76, twice the value for markers from GenBank data. Forty six SSR loci were placed on the SNU-RFLP linkage map, which had been derived from interspecific cross between Capsicum annuum "TF68" and C. chinense "Habanero". The current "SNU2" pepper map with 333 markers in 15 linkage groups contains 46 SSR and 287 RFLP markers covering 1,761.5 cM with average distance of 5.3 cM between markers.
As ESTs and genome sequencing projects are achieved, these resources can be exploited for gene discovery and marker development. Through analyzing non-redundant 10,232 expressed sequence tags (ESTs) in pepper, 1,201 SSRs were found in these sequences, which represents one SSR in every 3.8 kb in the ESTs. Sixty six percent of the SSRs was trinucleotide repeats, with AAG motif most abundant. Eighteen percent of the SSRs was dinucleotide repeats, sixty nine percent of which was AG motif. Among tetranucleotide repeats AAAG motifs comprised 22% and AAAT 21%. AAAAG was the most abundant (21%) motif of the pentanucleotide repeats. With respect to the average length dinucleotide repeats were the longest. Among 1,201 SSRs, 812 primer pairs were designed, which satisfied melting temperature condition and PCR product size. Five hundred and thirteen SSRs were successfully amplified. One hundred and fifty SSR markers were mapped onto SNU2 pepper map.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• CONTENTS ... 12
• 목차 ... 16
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 20
• 제1절 연구개발 목적 및 필요성 ... 20
• 1. 품종보호 - 품종의 유사성과 구별성 문제 ... 20
• 2. DNA 마커를 이용한 품종식별 ... 21
• 3. 고추, 참외·멜론 작물의 DNA 지문연구 ... 21
• 제2절 과제의 구성 및 내용 ... 22
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 23
• 제1절 국외 연구현황 ... 23
• 제2절 국내 연구현황 ... 24
• 제3장 DNA 기법을 이용한 고추의 유사품종 식별 ... 25
• 제1절 서론 ... 25
• 제2절 재료 및 방법 ... 26
• 1. AFLP 분석을 이용한 품종간 유연관계 분석 ... 26
• 2. SSR 마커 선발 및 고추의 품종간 유연관계 분석 ... 26
• 3. AFLP와 SSR 마커와의 상관관계 분석 ... 28
• 4. F1 순도 검정용 primer 선발 및 SSR 마커의 유전양상 ... 28
• 제3절 DNA 기법을 이용한 고추의 유사품종 식별 ... 28
• 1. AFLP 마커를 이용한 고추의 유연관계 분석 ... 28
• 가. AFLP primer 선발 ... 28
• 나. 유전적 유사도 검정 ... 30
• 2. SSR 마커를 이용한 고추의 유연관계 분석 ... 32
• 가. 고추 SSR primer 선발 ... 32
• 나. SSR 마커를 이용한 고추의 유연관계 분석 ... 35
• 3. AFLP 분석과 SSR 마커와의 상관관계 분석 ... 37
• 4. F1 순도 검정용 primer 선발 및 SSR 마커의 유전양상 ... 38
• 가. F1 순도 검정용 primer 선발 ... 38
• 나. SSR 마커의 유전양상 ... 39
• 제4장 DNA 기법을 이용한 참외·멜론의 유사품종 식별 ... 41
• 제1절 서론 ... 41
• 1. 우리나라 참외 품종분화와 육종의 역사 ... 41
• 2. 재배와 유통품종 ... 42
• 3. 품종보호제도와 분자생물학적 기술의 이용 ... 43
• 4. 연구의 목적 ... 43
• 제2절 참외·멜론 품종분류 및 명칭에 관한 제고찰 ... 44
• 1. 서론 ... 44
• 2. 품종분류 기준의 변천 과정 ... 45
• 3. 참외, var. makuwa의 분류기준은 ? ... 45
• 제3절 Cucumis 속 작물 유래 SSR 프라이머 선발 ... 47
• 1. 재료 및 방법 ... 47
• 가. 식물체 재료 ... 47
• 나. 개발된 SSR primer를 이용한 참외 품종식별 적용성 검토 ... 47
• 2. SSR 프라이머 선발 및 적용성 검토 ... 49
• 제4절 참외 유래 고유 SSR 마커 개발 ... 52
• 1. 서언 ... 52
• 2. 재료 및 방법 ... 52
• 가. 5′-anchored PCR를 이용한 SSR-enriched Library 제작 및 특이 primer 확보 ... 52
• 나. Chromosome working을 이용한 양 단편 primer의 특이화 ... 53
• 3. 참외 고유 SSR 마커개발 및 적용성 검토 ... 54
• 제5절 SSR 마커를 이용한 참외·멜론 품종특성규명 ... 56
• 1. 재료 및 방법 ... 56
• 2. 참외·멜론 품종별 SSR 마커의 분포 및 특성 ... 57
• 3. SSR 마커에 의한 품종분류 및 유전적 연관관계 분석 ... 63
• 제6절 SSR 마커의 F1 종자 순도검정 이용과 후대 유전분석 ... 66
• 1. 서언 ... 66
• 2. 재료 및 방법 ... 66
• 3. SSR 마커를 이용한 F1 종자 순도검정의 실현 ... 68
• 4. SSR 마커의 F2 세대 유전양상 검정 ... 69
• 제5장 품종간 최소거리 설정 ... 70
• 제1절 서론 ... 70
• 제2절 고추의 품종간 최소거리 설정 ... 71
• 1. 재료 및 방법 ... 71
• 가. 형태적 특성조사 ... 71
• 나. 품종간 최소거리 설정 ... 71
• 2. 고추의 형태적 특성조사 결과 ... 72
• 3. 품종간 최소거리 설정을 위한 형태적 특성조사 ... 73
• 4. 전문가 협의회를 통한 품종간 최소거리 설정 ... 78
• 제3절 참외·멜론의 품종간 최소거리 설정 ... 79
• 1. 재료 및 방법 ... 79
• 가. 형태적 특성조사 ... 79
• 나. 품종간 최소거리 설정 ... 79
• 2. 참외·멜론의 형태적 특성조사 결과 ... 80
• 3. 품종별 형태적 특성과 SSR 마커특성의 연관관계 설정 ... 82
• 4. 전문가 공동특성조사를 통한 품종간 최소거리 설정 ... 84
• 제6장 고추의 SSR 마커 개발 ... 87
• 제1절 서론 ... 87
• 제2절 재료 및 방법 ... 88
• 1. SSR library 구축 및 클론 선발 ... 88
• 2. Primer 선발 및 PCR 증폭 ... 92
• 3. Polymorphic information content (PIC) 분석 ... 92
• 4. SSR primer 개발을 위한 GenBank database 검색 및 고추 EST DB 검색 ... 93
• 5. 고추 SSR 유전자 지도 작성 ... 93
• 제3절 결과 및 고찰 ... 93
• 1. 고추의 SSR 분리 및 동정 ... 93
• 2. GenBank DB에서 고추 SSR 분석 ... 95
• 3. SSR 표지 개발 ... 96
• 4. 고추의 분자유전자 지도 작성 ... 102
• 5. 고추 EST DB를 통한 SSR 분석 ... 102
• 6. EST-SSR 표지 개발 ... 108
• 제7장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 112
• 1. DNA 기법을 이용한 고추의 유사품종 식별연구 ... 112
• 2. DNA 기법을 이용한 참외의 유사품종 식별연구 ... 113
• 3. 고추 SSR 마커 개발 ... 114
• 제8장 연구개발 결과의 활용계획 ... 115
• 제9장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 117
• 제10장 참고문헌 ... 119
• 부록(APPENDIX) ... 125
• 끝페이지 ... 145