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Ⅳ. 연구개발결과
1. 신규소재 개발에 따른 필수 분석법 정립
본 연구는 신규한 소재개발과 관련된 것으로서, 원료 유단백질로부터 NANA제조 전후의 분석방법 확립을 통하여 개발제제의 안전성 및 특성을 명확하게 구명할 필요가 있다. 즉, 개발간 필요에 따라 영양성분(단백질, 지방, 탄수화물등 )분석, 목적개발제제인 NANA의 장단기 보관, 내열, 내산 및 내염기조건 확인을 위한 물리이화학적 물성(분자량 등)분석조건을 정립하였다. 그리고 목적유해균에 대한 NANA 항균성 평가와 더불어 항균성 저하와 관련되는 킬레이팅 등의 간

Ⅳ. 연구개발결과
1. 신규소재 개발에 따른 필수 분석법 정립
본 연구는 신규한 소재개발과 관련된 것으로서, 원료 유단백질로부터 NANA제조 전후의 분석방법 확립을 통하여 개발제제의 안전성 및 특성을 명확하게 구명할 필요가 있다. 즉, 개발간 필요에 따라 영양성분(단백질, 지방, 탄수화물등 )분석, 목적개발제제인 NANA의 장단기 보관, 내열, 내산 및 내염기조건 확인을 위한 물리이화학적 물성(분자량 등)분석조건을 정립하였다. 그리고 목적유해균에 대한 NANA 항균성 평가와 더불어 항균성 저하와 관련되는 킬레이팅 등의 간섭효과 및 제품 적용성 확보, 유해미생물 제어효율 검정 및 NANA소재의 동물안전성 평가시에 장내미생물총 변화를 확인하기 위한 미생물 검사 및 동정법 등을 일관되게 정립하였다.

2 Neuraminidase(NANA생산효소)생산 및 대량생산시스템 정립
가. 현재 영유아식품(조제분유 및 이유식 등)내 감염되어 공중보건학적인 피해를 일으키고 있으나 뚜렷한 대책이 없는, 고질적인 병원성 세균(Bacillus cereus, Entrobacter sakazakii)에 대하여, 항균능력(경제성 확보)을 보유한 유단백질(GMP)을 원료로 기원성 천연 항균제로서 NANA를 개발하였다.
나. 기질인 유단백질에서 NANA를 효소적 처리법으로 분리하기 위한 효소인 Neuraminidase는 식품첨가물로 등재되어 있는 식품미생물중 Arthrobacter ureafaciens를 선발하고, 대량생산시스템조건에서 효소생산 및 이를 적용한 NANA 대량생산시스템 정립을 일련의 시스템으로 완료하였다. 시작품에 대한 결과는 다음과 같다.
다. 결과
1) 경제성이 확보되는 분해효소를 생산하기 위하여 상업효소(17종), 식품첨가물로 등재된 식품미생물을 수거하여 이들에 대하여 Neuraminidase를 스크리닝 과정을 실시하였다. 결과로서, Arthrobacter ureafaciens를 Neuraminidase생산 유효균으로 선발하였다.
2) 기질 GMP내 NANA 생산을 위해 선발된 Arthrobacter ureafaciens를 대상으로 실험실적 반응조건 등 NANA생산조건을 정립하였다.
3) 효소와 NANA의 대량생산시스템 정립을 위하여, 효소생산(3톤 반응조) 및 이를 이용한 NANA 생산(10톤, 기질GMP 대비 효소첨가량 1% 기준)을 위한 효소생산 및 NANA생산성을 검정하였다. 결과는 다음과 같다.
가) 반응조내 최종 효소생산성은 0.16unit/ml였는데, 이때 총 432,000unit의 Neuraminidase가 생산되었다(p<0.05).
나) 기질인 GMP 1g을 효소분해시켜 NANA를 생산하기 위한 Neuraminidase효소 역가치는 0.5unit/g(GMP)였다(p<0.05).
다) Neuraminidase 432,000unit를 적용시, GMP(NANA 4% 함유)는 864Kg을 분해 시킬 수 있었으며, 이때 NANA생산량(100%순도 기준)은 25.9Kg였다.
라) 100%순도 NANA를 생산시, Neuraminidase비용은 386,100원/Kg, 25%의 경우는 96,525원/Kg이 소요되었다.
마) 개발 Neuraminidase효소를 적용한 유단백질 GMP(NANA 4%)로부터 생산된 NANA(순도 25% 기준)의 생산량은 GMP 1Kg당 99g(동결건조)였고, 이때 생산수율은 63%였다. 이는 기질로서 GMP내 NANA함유량이 4%임을 감안하면 Neuraminidase에 의해 분해되는 NANA의 이론치 생산수율은 75%임에 비교하여 실제 생산수율은 63%였다. 이는 분해반응공정(침전물 제거시) 약 8%, 에탄올 침전물 제거 공정시 액 33%가 손실됨으로 인한 것이였다. 이를 감안하고 순도 25% 기준으로 1Kg NANA의 생산가는 674,471원(생산비용 125,000원/Kg 포함)이였다.
바) 대량생산을 위한 공정소요시간으로서 Neuraminidase 생산소요시간은 18시간, NANA는 112시간(동결건조 시간 제외)으로 총 130시간이 소요되었다.
사) NANA생산수율(63%)증가를 위한 방법을 검정한 결과, 분해반응공정단계에서는 침전물 회수 및 물세척 회수공정, 에탄올 침전물 제거공정에서 에탄올첨가량 최적화후 필터프레스 또는 원심분리공정을 거쳐 수율을 최대 73%까지 증대하였다(p<0.05).
아) 결론적으로, 잉여 미이용 자원인 유청단백질에서 분리한 유단백질(GMP)로부터 NANA생산을 위한 효소(Neuraminidase)생산용 미생물(식품첨가 미생물) 확보, 이를 이용한 3~10톤 규모의 Neuraminidase 대량생산 및 생산된 Neuraminidase를 이용한 10톤 규모의 NANA대량 생산시스템을 일련되게 정립하였다.

3. 목적 유해균에 대한 항균스펙트럼 효과
배지로서 생리적 식염수와 우유내 구별하고, 세균종류별로 각각 감염 시킨후 개발 NANA를 농도별 첨가한 후, 이어서 공시세균별, NANA처리 농도별 및 시간경과에 따른 항균성 더불어 항균저하에 관계하는 간섭요인 등을 병행하여 검정하여 보았다. 결과는 다음과 같다.
가. NANA제제는 그람음성균에 대하여는 사멸효과를 보였으나, 그람양성균에 대하여 는 사멸효과 보다는 정균효과를 보이는 경향의 항균효과를 보였다(P<0.01).
나. 생육저지농도(MIC)를 비교하여 본 결과, MIC는 2.5~5ppm범위였으며 역시 그람음성균의 MIC수치가 낮게 나타나는 경향을 보였다(P<0.01).
다. 대조배지로서 생리적식염수를 비교실험구로서 멸균유에 공시균을 감염시킨후 동일 농도의 NANA를 처리 후 항균성을 비교하여 보았더니, 유의한 차이가 인정되지 않았다. 이는 NANA제제가 우유내 여러인자(단백질류, 지방류, 탄수화물류, 미네럴류, 효소류 등)와 간섭반응이 일어나지 않는 소재임이 확인되었다(P<0.01). 사전예비 시험에서, 생리적 식염수에서 항균성이 인정된 키토산이 멸균유내에서는 첨가농도에 비례하여 우유단백질과 결합되어 침전현상이 발생되면서역시 항균성도 소실되었는데, 이와 비교할 때 NANA소재는 우수한 항균소재임이 확인되었다(P<0.01).
라. NANA처리농도 대비 항균성과 관련된 시간을 비교하여 보았더니, 농도와 시간은 비례적 결과를 보였는데, 0.5%(w/w)NANA 농도를 기준으로 3분이내에 99%이상의 항균효과를 보였다(P<0.05)

4. 유산균에 대한 항균효과를 유해균과 동일한 과정으로 검정하여 보았더니, 공시 유해균과 유사한 항균결과를 보였다. 즉, 생리식염수 및 멸균유 조건에서 NANA농도가 1.0%이상 첨가시 1시간이후부터 20%로 유산균의 급격한 감소가 이루어지고 16시간이 경과시는 생존 콜로니는 검출되지 않았다.

5. 유해세균에 대하여, 37종의 항균제를 대상으로 먼저 내성여부보유여부를 확인한 후 NANA제제를 처리시 항균성을 검정한 결과, 내성보유균에 대하여도 유의한 항균제임이 확인되었다(P<0.01)

6. 유해세균(E.coli O157:H7)만을 대상으로, NANA를 동일농도(0.25%)로 처리조건에서 1세대에서 생존한 콜로니를 채취한 후, 이를 10세대동안 반복처리시 항균차이를 비교함으로서 NANA로 기인한 내성이 유발되는지를 검정결과에서, 전체세대에서 항균성 차이는 인정되지 않았다. 따라서, NANA기안성 내성은 유발되지 않는 것으로 인정되었다(P<0.01).

7. NANA이 항균성 관여하는 항균메카니즘을 검정하여 보았더니, NANA는 세포막에 직접적으로 lysis 또는 damage를 주지 않았다. 그러나, MIC농도이상에서 세포 내부유입이 극대화됨으로 인하여 이차적으로 삼투압현상을 교란을 시켜, 최종적으로 세포막을 파괴시킴으로 인한 항균성을 나타내는 메카니즘을 갖고 있는 것으로 파악되었다(P<0.05)

8. 개발NANA소재의 제품적용성 평가
NANA소재개발의 최종목표가 천연항균제로서 고부가 제품개발임에 따라 제품화를 위한 주요항목별 평가를 실시하였다. 평가항목으로서는 내열성, 보관조건별(상온 및 냉장), 기간별(최초 대비 7일, 37일 및 10개월)로 구분하여 제품화를 위한 적용성 평가를 실시하였다.
결과로서, NANA소재를 천연항균제로서 사용에 있어 액상제형보다는 고상제형이 적절함을 알 수 있었다. 따라서, 생산 NANA소재는 제품화 원료시는 분말 혹은 고상제형이 적절함을 알 수 있었으며(P<0.01), 제품적용성 평가를 종합하여 최종적으로 제품화 제형은 액상첨가형(과립형)과 섭취형(정제형)로 구분 제조레시피를 정립하므로 서 제품 상용성을 극대화 하였다.
개발NANA소재의 세부항목별 제품적용성 평가결과는 다음과 같다.
가. 1% 농도로 조성한 NANA는 두개의 분자량[저분자 : 37.4min.(85%), 고분자 : 37.5min.(15%)을 보유하는 패턴을 보유하고 있었다(FPLC분석).
나. 보관(상온 및 냉장)조건에 따른 물성변화 조사 결과
1) NANA소재는 상온보관 조건에서 시간이 경과하면 할수록(2일 이상), 갈변화 현상과 침전 및 부착현상이 심하게 진행되었다. 이 경우 NANA는 고분자량 분포대가 15%에서 72%증가하였는데, 동시에 저분자량 분포는 85%에서 오히려 28%대 감소하는 패턴을 보이는 물성변화가 발생하였다(P<0.01).
2) 냉장보관시, 단기간(30일이내)에서는 갈변화 및 분자량 변화등 물성변화는 발생하지 않았으나, 이후 시간이 경과하면 경시적인 변화는 발생하는 것으로 파악되었다(P<0.05).
3) 상온 및 냉장보관 조건에서 기간경과에 따른 항균성 저감여부를 확인하여 보았더니, 차이가 인정되지 않았다. 따라서, 보관조건과 시간경과에 따른 물성변화가 항균성 저하에 미치는 효과는 없는 것으로 인정되었다(P<0.01).
4) 결론적으로, NANA소재는 제품적용에 있어 항균성을 제외한 성상변화를 기준으로 평가한다면 액상보다는 고상제품에 보다 적합함을 확인하였다. 그러나, 액상에 적용시는 첨가후, 냉장보관조건에서 30일 이내에 소진하는 조건을 반드시 준수하여야 할 것으로 판단되었다(P<0.01).
다. NANA소재의 내열성 및 항균성에 미치는 영향조사
1) NANA소재에 대한 내열성 평가를 위하여, 대조구 대비 비열처리구 및 열처리구(75℃, 90℃ 및 121℃)로 구분 분자량 및 물성변화를 검정하여 보았다.
결론으로, NANA소재는 온도조건이 높을수록 갈변화 현상과 고분자량 분포대(RT : 37.5min.)로 이동하는 패턴 또한 매우 빠른 것으로 조사되어 NANA소재는 열안전성은 인정되지 않았다(P<0.01).
2) NANA소재에 대한 내열처리가 항균성 저하에 미치는 영향이 있는지를 검토하여 본 결과, 균 종류에 따라 항균효과는 다소 차이가 있었으나, 전체적으로는 열처리 및 비열처리조건에서 항균성 차이는 나타나지 않았다(P<0.01).
3) 결론적으로, NANA소재의 기본구성 분자량은 저분자와 고분자로 구성되어 있는데, 온도와 보관조건의 차이에 따라 분자량 변화(고분자대로 이동)와 동시에 갈변화 현상이 발생하는 패턴을 보였지만, 이러한 물성변화가 항균성 저하 효과와는 무관한 것으로 인정되었다(P<0.05).

9. NANA의 내산 및 내염기성 평가
산성(HCl, Acetic acid, H2SO4, HNO3) 및 염기성(NaOH) 시료를 농도별로 희석한 후 동일농도의 NANA를 첨가 한 후 시간경과시 NANA의 분자량 변화패턴을 보사함으로서 NANA의 내산 및 내염기성을 평가하여 보았다.
결과로서, NANA소재는 내알카리성은 다소 안정되었으나, 산성조건에서는 NAN소재의 고유분자량이 붕괴되는 패턴을 보여 내산성은 인정되지 않았다(P<0.01). 그러나, 경과시간이 길면 길수록 알카리 조건에서도 동일하게 분자량이 변하는 패턴을 보였다.

10. 개발NANA소재의 제품화 레시피 정립
NANA소재개발의 최종목표가 천연항균제로서 고부가 제품개발임에 따라 제품적용성 평가를 기초로 하여, 액상제형보다는 고상제형이 적절함을 알 수 있었다. 따라서, 생산 NANA소재는 제품화 원료로서 고상제형으로 정하고, 액상첨가형(과립형)과 섭취형(정제형)로 구분 제품화 하였으며 최종 상용성을 극대화 하였다. 제품화를 위한 제형별 레시피(경제성 평가 포함) 정립 결과는 다음과 같다.
가. NANA소제의 목적유해균의 제균성을 확보 되도록 제형을 정제형과 분말형으로 제조 레시피를 구분정립하였는데, 상용시 최종 용해액 100g당 0.5% NANA제제가 함유되도록 고려하여 제형화 레시피를 정립하였다.
나. 제형별 레시피로서, 섭취용으로는 정제형 I(원형, 1정/500mg, NANA함유량 : 2.5mg, 단가 : 약 12원/정)과 정제형 II(봉상형, 정/750mg, NANA함유량 : 5mg/정, 단가 : 20.25원/정) 그리고 액상제제용으로, 과립형(분말형, 1스틱/2,000mg, NANA함유량: 5mg/1Stick, 단가 : 22.25원/Stick)으로 구분하여 최종 레시피를 정립하였다. 이때 제형별 NANA함유량은 정제형(타정형)은 40~50mg, 과립형은 100mg이 함유토록 하였다.

11. 동물임상 실험을 통한 사전안전성 평가(동물임상 섭이농도 설정)
정립된 대량생산시스템 적용 생산된 개발NANA(순도 25%) 대비 합성NANA(대조)의 동물임상 실험 진행을 위한 사전 안전성 평가를 위하여, 0%~1%농도조성 NANA에 대하여 HEK 293(human embryonic kidney cell)과 RAW264.7(macrophage cell) cell를 이용하여 MTT, NO, Cytokines 및 Western blot analysis검정을 거쳐 안전정을 평가하였다. 결과는 다음과 같다.
가. NANA소재는 표준주를 대상으로 안전성 평가 결과, NANA는 0.5%(w/w) 농도이상에서는 독성을 나타내었는데, 이는 대조 NANA 및 개발NANA처리군에서 동일한 패턴을 보였다 (P<0.01).
나. NANA소재는 0.5% 이하의 농도에서는 무독성이며, 항염증 효과(염증완화 효과)를 보유하고 있는 것으로 평가되었다(P<0.01).
1) NANA처리시 iNOS, COX-2와 염증성 cytokine인 TNF-α 발현량을 효과적으로 억제하였는데, 항염증 효과를 나타내기 때문으로 판단 되었다(P<0.05)
2) NANA소재는 LPS에 의해 유발되어지는 메커니즘에 MAPK 신호전달과정을 조절하여 항염증 효과를 나타내는 것이 우수하다는 것을 확인하였다(P<0.05).
3) 따라서, NANA는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단되었으며,사전안전성 평가결과를 기준로 동물안전성 평가시, 사료내 첨가 NANA농도를 0.1%, 0.5% 그리고 고농도 처리구는 1%로 설정하였다.

12. 동물임상 평가(안전성 및 기초효능 평가)
가. NANA 동물임상평가를 통한 안전성 평가를 위한 사료 레시피는 AIN-76A를 기본으로 하여 1Kg당 NANA(100% 순도 기준)는 1g(NANA-L처리구), 5g(NANA-M처리구) 및 10g(NANA-H처리구)로 혼합 조성하였다.
나. 전체시험구는 대조구(AIN-76A사료섭이구)와 비교구(기본사료에 합성NANA첨가구, SNANA) 그리고 시험구로서는 기본사료(AIN-76A)와 개발NANA를 동일농도로 혼합하여 조성하였다.
다. 시험동물에 조성 사료를 자유섭이토록 한 후 4주, 8주 및 13주에 각각 생장관련 및 도살조건하에서 안전성평가 항목별로 조사하였다. 주요 평가항목으로 사료효율(성장), 무게(총무게 및 기관별), 기관별 조직병리, 혈액지표 및 염색체이상 조사, 기관별 및 분변내 미네랄 분포와 장내미생물총 변화로 하여 총 9개 항목으로 대별하였다.
1) 일정별로 구분하여 사료섭취량과 관련한 일일성장률(24시간 단위로 13주동안 측정)을 대조 대비 NANA처리구와 비교하여 보았더니, 차이가 인정되지 않았다.
2) 생체중 및 기관별 무게변화에 미치는 결과를 역시 기간별로 구분하여 대조 대비 NANA처리구와 비교하여 보았다.
결과로서 생체중 및 근조직(5개기관 : Liver, Kidney, Spleen, Heart, Lung)과 골조직(2개 : femur, Backbone) 전체시험구에서 대조구 대비 차이가 인정되지 않았다.
3) NANA제제의 생장관련 안전성 결과를 기초로, 추가적으로 혈액조성과 지표안전성 및 염색체 이상 조사를 통하여 생체내 안전성 결과를 조사하여 보았더니, 역시 차이는 인정되지 않았다.
4) 생장 및 혈액안전성 평가를 기초로 조직검사를 실시함으로서, 8주 및 13주가 경과시에 기관별(7개기관 : Liver, Kidney, Spleen, Heart, Lung, Femur 및 Backbone)로 조직병리학적 안전성 검사를 실시하였다.
(가) 8주 경과시는 전체조직에서 유의한 차이는 안정되지 않았는데, 13주 경과시개발NANA 처리구의 Spleen에서 Necrosis(조직괴사)현상이 발생하였다.
(나) 개발NANA의 농도별 안전성을 평가하여 본 결과, 적어도 8주이상의 섭이조건에서 0.5%이상을 지속적으로 섭이시 안전성이 없는 것으로 판단되었다. 그러나, 동일 분자 및 화학식 구조를 보유하고 있는 비교구(합성NANA)의 경우는 안전성에 있어 문제가 없는 것으로 보아 추가 검정이 필요할 것으로 판단되었다.
5) NANA제제가 중요장기내 미네럴 변화를 유발하는지를 경과시간별로 구분하여 조사하여 보았다.
(가) 주요변화를 유발하는 이온은 칼슘이였고, 7개기관중 골조직에서 유의성이 인정되었다.
(나) 골조직을 중심으로 일정별 칼슘변화를 조사하여 보았더니, 대조 대비 전체 NANA처리구에서 4주 경과시는 10~20% 범위로 감소현상을 보였으나, 8주가 경과하면 오히려 20%범위 이내에서 증가하는 결과를 보였다. 이 결과는 NANA 소재는 생체내 흡수되어 미네럴 이온의 치환과 교체성향을 나타내는 기능성을 보유하는 것으로 판단되었다.
(다) 근조직내에서 주요한 미네럴 변화는 Spleen에서 발생하였는데, 주요 미네럴은철분이온이였다. 검출량을 비교하여 보았더니 대조(150~180ppm) 대비 NANA 처리구에서 약 2배에서 3배로 고농도로 축적되는 경향을 보였으며, 농도에 비례하여 증가하는 경향이였다.
(라) NAN소재 및 처리농도별로 기관별 분포조사 결과, 대조 대비 합성NANA와 개발NANA 농도별 패턴은 유사하였는데, 고농도로 갈수록 감소하는 경향이였으며 NANA소재별 차이는 인정되지 않았다.
(마) 골조직 인장강도
NANA소재별(합성NANA 및 개발NANA), 농도별(0.1%, 0.5% 및 1%) 및 섭이기간(8주 및 13주)에 따라 골조직(건조 Femur기준)의 무게, 생장(길이, 폭), 인장강도 변화를 대조 대비 비교조사 하였다. 결과는 다음과 같다.
(1) NANA섭이시 골조직내 칼슘의 함유량은 4주까지는 10~20%가 감소하였으나, 8주이후 부터는 오히려 약 10~20% 증가하는 결과를 보였다(P<0.05).
(2) NANA처리구의 골조직내 칼슘증가하면 역시 골조직의 무게, 길이생장 및 인장강도 10%이상 증가하는 것으로 조사되었다.
(3) NANA섭이시 농도차에 따른 골조직내 변화에 미치는 영향은 인정되지 않았다(P<0.05).
(4) NANA소재간 골조직내 변화에 미치는 영향은 인정되지 않았다(P<0.05).

13. 장내미생물 분포변화 조사
NANA소재별(합성NANA 및 개발NANA), 농도별(0.1%, 0.5% 및 1%) 및 섭이기간(4주, 8주 및 13주)에 따라 장내미생물총 변화를 유발하는지를 총균수(TSA 배지) 대비 대장균구(MacConkey배지) 및 유산균(BCP 배지)으로 구분하여 호기조건하에서 확인하였다. 결과는 다음과 같다.
가. 14주간 평균 사료섭취량은 관찰한 결과, 실험구간의 농도별 섭취량은 유의적인 차이가 없으나 대조 대비 실험구의 사료섭취량이 최대 21±5% 감소하였으며 유의적인 차이가 인정되었으나, 생체중감소와 기관별 무게 및 안전성과 관련한 유의성은 없었다(P<0.05)
나. NANA의 섭취여부와 섭이기간은 장내미생물총의 변화유발과 밀접한 관계를 보였으며, 이때 대장균구와 유산균구가 변화유발 미생물로 인정되었다(P<0.01).
다. NANA의 섭이기간에 따른 조사결과는 다음과 같다.
1)전체적인 경향으로서, NANA섭이후 8주이내에서는 총균중 대장균구는 대부분 검출되지 않았으며, 대신에 유산균총이 유의하게 최대 9배까지 증가하는 패턴을 보였다(P<0.05). 그러나, 8주이상의 장기섭이시는 대조구 대비 차이가 인정되지 않아 결국 장내균형을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
2) 최초 NANA섭취 및 생체전이메카니즘을 통해 장내에 유입된 NANA의하여, 장내 미생물총의 변화가 유발되었으나, 섭이기간이 길면 길수록 장내 미생물총이 안정화 되는 것으로 판단되었으며, 결론적으로, NANA섭이가 장내미생물총의 변화를 유발하는 기간은 최대 8주이내였다.
라. 동일 화학 및 분자구조를 보유하고 있는 합성NANA와 개발NANA가 장내미생물 분포조사에 영향(8주 섭이기준)을 미치는지를 조사하여 보았다. 결과로서, NANA 소재중 개발NANA가 합성NANA보다, 약 7~10배의 장내미생물총 변화를 유발하는 것으로 인정되었다. 이는 동일성분의 NANA라 할지라도 체내 흡수 및 생체전이 메카니즘 및 최종 배설경로인 장내축적과 이로 인한 항균성 차이 등의여 복합적인 결과로 인한 것으로 판단되므로 추후 세세한 연구가 필요하다.
마. NANA소재의 섭이여부와 기간에 따른 장내미생물의 변화유무와 이들에 의하여 흡수되고 배출되는 분변내 영양소 분포변화와의 상관관계를 대조 대비 비교하였다.
비교결과를 통하여, 대조구 대비 NANA섭이로 인하여 유도된 미생물의 변화와 더불어 영양원의 분포를 기준으로 Probiotic제제 및 대장균등 장기원성 질병에 대하여 Synbiotic 소재(예방 및 치료관련)로의 개발 가능성을 확인 하고 져 하였다.
1) NANA섭이이후 장내미생물의 분포변화가 심한 경우는 분변내 영양원 분포 역시 유의하게 감소되는 경향을 보였다.
2) NANA섭이에 따른 장내미생물의 변화와 분변내 배출영양원 감소에 미치는 결과를 조사하여 보았다.
가) 장내미생물의 변화가 심한경우(8주섭이)는 역시 분변내 영양원의 배출농도도 감소하였다.
나) NANA소재의 장기간 섭이(8주 이상)에 따라 장내세균총이 정상으로 전환시,역시 분변내 배출영양원의 구성은 차이가 인정되지 않았다.
바) NANA섭이시 장내 미생물의 변화와 배출되는 분변내 영양소 분포변화와의 상관관계를 비교하여 NANA의 용도․용법 및 관련 이용성을 확인하여 보았다.
즉, 8주 경과시 채취한 대조구 분변 중 일정량을 취한 후, 80% EtOH용액으로 지방류 및 단백질류만을 침전을 유도하였다. 다음으로 원심분리 과정을 거쳐 최종 상등액(수용성 탄수화물류 및 NANA)만을 취하여 HPLC분석과정(NANA분석법 기준)실시하였다. 이를 위한 시험구로서는, 대조구 대비 NANA처리구중 유산균의 검출되지 않고 대장균만이 증가된 분변시료, 대장균은 검출되지 않고 유산균만이 증가된 분변시료를 대상으로 분변내 영양성분(단백질류 및 지방류 및 수용성 탄수화물류 등으로 구분) 비교하였다. 결과는 다음과 같다.
1) NANA섭이후 체내에 흡수된 NANA는 생체대사 메카니즘을 거쳐 최종 배설경로인 장내분변으로 축적되면서 Triger로서 장내미생물의 변화를 점진적으로 유발하는 것으로 판단되었다(P<0.01).
2) 장내 축적된 NANA는 Probiotic 혹은 Synbiotic패턴으로 장내미생물의 변화를 유발하였는데, 섭이기간과 섭이농도 증가에 따라 Probiotic(유산균 증가) 패턴에서 Synbiotic(유산균증가 및 대장균구 감소)패턴으로 전환되는 경향으로 인정되었다(P<0.05).
3) NANA소재의 섭이기간별 장내미생물의 패턴변화에 미치는 경향을 살펴보았다.
가) 섭이기간별로 8주이내는 전체시험구(NANA섭이)에서 대부분이 Probiotic과 Synbiotic패턴을 동시에 보였다. 그러나, 8주이상 경과시 장내미생물총은 정상적인 균형을 회복하는 경향을 보였다(P<0.01).
나) 세균총의 변화(대조 대비)는 8주이내에서, 분변내 총균수는 최대 약 5배까지 감소와 더불어 대장균은 대부분 거출되지 않았으나, 유산균은 최대 10배까지 증가하는 패턴을 보였다(P<0.01).
다) NANA제제별로 Probiotic 및 Synbiotic패턴 변화에 미치는 효과를 비교하여 보았더니, 단기간(8주 이내)에 대부분이 Probiotic패턴과 동시에 Synbiotic패턴을 유의하게 높게 유발하였던 개발NANA가 합성NANA보다 정상적인 장내미생물의 정상적인 회복도 높은 것으로 인정되었다(P<0.05).
라) NANA섭이시 장내미생물의 변화 패턴(Probiotic과 Synbiotic패턴)에 따른 분변내 영양원(단백질류, 지방류 및 탄수화물류 등)의 변화를 비교함으로서 NANA기인성 영양이용성을 판단하여 보았다. 그 결과는 다음과 같다.
(1) 대조구의 경우, 분변내 영양원(단백질류, 지방류 및 탄수화물류, 수용성 단백질류 및 수용성 탄수화물류별 검출량 합계 100기준)이 골고루 검출되었다. 그러나, 장내미생물의 변화가 심하였던 전체NANA섭이구에서는 이들의 활동에 의하여 분변내 영양원은 높은 수치로 감소하였다. 즉, 합성NANA섭이구는 약 26%~97%가 감소하였으며, 개발NANA경우도 약12%에서 최대95%까지 농도별로 비례하여 감소하는 경향을 보였다(P<0.01).
(2) NANA섭이에 따라 유산균 혹은 대장균이 우점균으로 증가하면, 공통적으로 분변내 영양원은 감소하는 결과를 보였다(P<0.01)
(3) 대조구 대비 NANA섭이에 의하여 단기간(8주 이내)에 Probiotic패턴과 Synbiotic패턴을 동시에 보였던 장내미생물이 13주 경과후에 정상회복후의 분변내 영양원은 검출되지 않았다(P<0.01).
(4) 총균수와 유산균등도 동시에 활성화 됨으로 인하여, 장내애서 영양분해 및 영양원으로 사용됨에 따라 대조구에서 검출되었던 단백질류 및 지방류등은 검출되지 않았다. 이는 유산균이 증가되면 단백질류 및 지방류가 대부분 분해 및 체내흡수되어 영양원으로 재사용되는 메카니즘으로 인한 것으로 판단되었다(P<0.05).
(5) 결국, NANA소재는 섭이농도 및 기간 등을 적절히 배분하여 활용시 Probiotic 및 Synbiotic소재로의 제품화 및 용도용법 확대가 가능한 소재로 판단되었다(P<0.01)

14. 연구목표 대비 세부 항목별 연구개발성과
핵심연구목표 대비 세세한 연구개발성과는 다음과 같다.

Abstract ▼

Ⅴ. Result of Research and Plan of utilization
1. Result of research
a. Patent application(4)
1) Patent application No. 10-2011-0029609 : Producing method of N-Acetylneuraminic using Neuraminidase seperated from microbes for food
2) Patent application No. 10-2011-006459 : Natural antimi

Ⅴ. Result of Research and Plan of utilization
1. Result of research
a. Patent application(4)
1) Patent application No. 10-2011-0029609 : Producing method of N-Acetylneuraminic using Neuraminidase seperated from microbes for food
2) Patent application No. 10-2011-006459 : Natural antimicrobial composite using Glycomacropeptide Neuraminidase resolvent including N-Acetylneuraminic as active constituent
3) Resolvent for colon bacillus diarrhea cure using N-Acetylneuraminic as active constituent
4) Resolvent for oral periodontitis cure using N-Acetylneuraminic as active constituent
b. New personnel hire (3 masters, 1 doctor) : Senior Research, Rresearcher of central laboratory
c. masters training (2 masters) : Gyeongsang university (Cho seon jeong, Sim heui yeon)
d. Thesis(1) : Non SCI level, Korean J. Dairy Sci. Technol.
- Research on the safety of NANA separated from milk serum protein GMP and clearing up the inflammation soothing mechanism. Vol29,No2.pp17-23. 011
e. significance : Finished action of restriction on secret distribution
-Expecting to present thesis after securing intellectual property rights(Basis : research written agreement as standard, registering result of research·intention to donate)

2. Research achievement using plan
1.Founding research result of NANA manufactures method and mass production method
1. Expanding applicability to development KNOW-HOW, development of double functional proteinoid food
- natural antimicrobial, Probiotic effect and prevention of osteoporosis etc.
2. Gradual progress according to the result of review of high value manufacturing association usage(approval institution : NVRQS and KFDA)
- Stage 1 : Applying unused surplus food by-product to high-value product(approval procedure is unnecessary, effect indication is impossible)
- Stage 2 : apply to development of health supplement food(mark effect after registeration of observance )
- Stage 3 : apply to medicine product development(apply after observance of standard of human body clinical testing, progress)
3. Active application to development of developed KNOW-HOW new high value manufacturing
- Seperating development material addition type and product development type

2. Research result of NANA manufacturing ( a fixed form and founding recipe)
1. Enlarged application of product family for infant and toddler and the old who is vulnerable to illness
2. Active application to developing weakness strengthening product family of current natural antimicrobial requiring products
3. Actively using as basic data when gradually developing natural antimicrobial strengthened food , the alternative to synthetic antimicrobial(babyfood, health favorite food etc.)
4. connect to development of medicine level high value food based on research result

3. Effect assessment result of animal clinical testing of NANA
1. Tablet type : actively apply to development of solid type high value product family
2. pulp type : actively apply to development of liquid type high value product family
3. actively apply to expanding usage applicability : animal field and fishery field
4. Actively use as a new material, developing and upgrading quality of functional product through addition to existing product
5. Application of high value commercialization concept
a. Developing Probiotic and osteoporosis preveting type functional food for the old
b. redevelopment product as a supplement to weakness of existing product
6. Actively using sales and selling strategy of both inside and outside of Korea(profit maximization)

4.commercialization
1. In the point of commercialization, capitalizing the advantage as a fulfill of nation assignment and utilizing technical superiority we will get the most out of the advantage.
2. In developing natural antimicrobial, the objectively proved development result will be deducted, we will actively use the fact that the result of antibacterial functional material development secure the technical superiority both in and out of Korea when it comes to commercialization(marketing and sales).
3. Using making technique KNOW-HOW such as developing and production trial goods, maxing ratio, actively apply to developing usage maximizing product.
4. Utilizing the result of development material animal clinic testing, we will actively apply to support for marketing ability and advance mechanism grasping when developing applications.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 23
• CONTENTS ... 48
• 목차 ... 49
• 제1장 연구개발과제의 개요 ... 50
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 56
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 62
• 제 1 절 NANA소재 개발을 위한 필수분석법 정립 ... 62
• 제 2-1 절 Neuraminidase 및 NANA 대량생산 시스템 정립(실험실적 기초조건 정립) ... 86
• 제 2-2절 Neuramininase대량생산시스템 정립 ... 111
• 제 2-3 절 NANA 대량생산시스템 정립 ... 122
• 제 3 절 NANA소재의 항균 메카니즘 구명 ... 144
• 제 4-1 절 NANA소재의 제품적용성 평가( 내산/내알카리 저항성 조사) ... 185
• 제 4-2 절 NANA소재의 제품적용성 평가(장기보관에 따른 물리이화학적 변화 조사) ... 189
• 제 4-3 절 NANA소재의 제품적용성 평가(장기보관이 항균성에 미치는 변화조사) ... 196
• 제 5 절 NANA소재의 사전안전성(Cell-line) 평가 ... 203
• 제 6-1절 동물임상 평가(일정별 사료섭취량과 일일성장률) ... 218
• 제 6-2절 동물임상 평가(생체중 및 기관별 무게변화) ... 224
• 제 6-3절 동물임상 평가(혈액학적검사, 혈액생화학적 검사 및염색체이상 검사) ... 231
• 제 6-4절 동물임상 평가(중요장기, 골조직 및 분변에서 미네럴분포 조사 ) ... 239
• 제 6-5절 동물임상 평가(조직병리학적 안전성 조사) ... 251
• 제 6-6절 동물임상 평가(장내 미생물 분포변화 조사) ... 256
• 제 7 절 영·유아식내 유해세균 제어형 제품 레시피 정립 ... 265
• 제4장 목표 달성도 및 관련분야에 기여도 ... 271
• 제 1 절 목표달성도 ... 271
• 제 2 절 관련분야의 기여도 ... 275
• 제5장 연구개발성과 및 활용계획 ... 276
• 제 1 절 연구개발성과 ... 276
• 제 2 절 연구결과 활용계획 ... 289
• 제6장 연구개발 과정에서 수집한 해외과학 기술정보 ... 293
• 제7장 참고문헌 ... 301
• 끝페이지 ... 316