초록 ▼

■ 연구결과
○ 유산균배양용 분말유청배지는 유청분말 10%,유기질소원 1% 이상 첨가하는 것이 유산균 배양 시가장 우수하였음.
○ 총 12개의 실험실 분리 유산균의 lactase 활성을 ONPG disc를 통해 측정한 결과 김치 유산균을 제외한 대부분의 유산균에서 lactase 활성이 존재하였음.
○ 12주의 공시 유산균주 중 probiotics 미생물로 이용하고 있는 L. paracasei FBT314, L. helveticus FBT1,L. acidophilus KCCM32820, Lc.lactis ATCC114

■ 연구결과
○ 유산균배양용 분말유청배지는 유청분말 10%,유기질소원 1% 이상 첨가하는 것이 유산균 배양 시가장 우수하였음.
○ 총 12개의 실험실 분리 유산균의 lactase 활성을 ONPG disc를 통해 측정한 결과 김치 유산균을 제외한 대부분의 유산균에서 lactase 활성이 존재하였음.
○ 12주의 공시 유산균주 중 probiotics 미생물로 이용하고 있는 L. paracasei FBT314, L. helveticus FBT1,L. acidophilus KCCM32820, Lc.lactis ATCC11454를 선별하고 각각의 lactase의 활성을 측정한 결과 L.paracasei 유래의 lactase의 활성이 1,053 Unit으로 가장 우수하였으며,그 비활성(specific acti vity)은 206U/protein,mg임
○ L.paracasei FBT314유래 lactase조효소액의 최적 pH는 6.5-7.0으로 나타났고,온도는 30℃에서 가장 우수한 효소활성이 나타났음.
○ L.paracasei FBT314유래의 lactase의 갈락토올리고당 생성 최적 조건은 분말유청 내의 유당의 농도가 30%,온도는 30℃에서 4시간 이상 배양하는 것임.
○ L.paracasei FBT314유래의 lactase를 처리하여 생산한 갈락토올리고당을 HPLC를 이용하여 분석한 결과 수율은 최대 19.1%정도임
○ L.paracasei FBT314유래의 lactase를 고정화하기 위하여 고정화 물질로는 1.5% sodium alginate 가 가장 우수하였으며 고정화효소를 처리하여 생산한 갈락토올리고당을 HPLC를 이용하여 분석한 결과 수율은 최대 15.4%로 나타났음.
○ Alcalase, Neutrase, Pancreatin 3종류의 효소로 유청단백질을 가수분해 한 결과 pH 8.0에서 Alcal ase는 50℃에서 180분간 반응시켰을 때 가수분해도는 12.5,Neutrase는 50℃에서 180분간 반응시켰을때 가수분해도는 15.15,Pancreatin은 50℃에서 180분간 반응시켰을 때 21.73으로 다른 반응시간보다 가수분해도가 가장 높았음.
○ Alcalase, Neutrase, Pancreatin 3종류의 효소로 50℃에서 180분간 유청단백질을 가수분해한 분자량 3,000이하의 펩타이드 profile이 각 효소별로 펩타이드 양상이 다른 특징을 나타내므로 이러한 다양한 펩타이드가 생리활성 기능 연구에 크게 기여 할 것으로 생각됨.
○ 산생성속도와 유산균 생균수를 종합하여 볼 때 효소분해 유청농축액은 탈지분유와 효모엑기스의 중간 정도의 발효 촉진 효과가 있었고,탈지분유보다 1.6배 높은 생균수를 나타내어 발효촉진물질로서 기대됨. 효모엑기스를 실제 사용가능한 농도까지 낮출 경우에는 유청효소분해액과 비슷한 효과를 보일 것으로 추정됨
○ 12종 유산균 및 3주의 Saccharomyces cerevisiae에 대한 lactase활성을 screening 한 결과 유산균 중에서는 Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteriodes, Weissella kim chii가 검출되지 않을 정도로 매우 낮았고,효모 중에서는 실험실 분리균주인 Saccharomyces cerevisiae SD1,Saccharomyces cerevisiae MG3균주가 낮은 활성을 보였음.
○ 활성이 비교적 강한 요구르트용 유산균 4종류(Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei)의 lactase활성을 상업용 효소 Lactozyme 3000(Novo)과 비교한 바 L.paracasei가 시판 효소와 비슷한 정도의 강력한 균체 내 lactase활성을 나타냄.따라서 이 조효소에 대한 추가적인 연구를 수행하였다.그 결과 pH는 7.0에서 최대의 활성을 나타냈고,온도는 30℃가 최적임.이 조효소액은 10% 유당을 10시간 만에 약 70%정도 분해하였음.
○ 최적온도인 30℃에서 갈락토올리고당의 생산을 검토한 바 갈락토올리고당 혼합물이 생성되는 것을 TLC를 통하여 확인 할 수 있었음.
○ L.paracasei조효소액을 encapsulation 방법으로 고정화 하였음.산업적 이용성을 검토하였음.코팅제는 예비실험을 통하여 5종의 hydrocolloid물질 중에서 alginate와 modified starch를 선정하였고,alginate를 단독으로 사용한 것이 혼합사용하는 것 보다 우수하였음.Sodium alginate의 최적 농도는 1.5% 였고,30℃에서 측정한 점도는 38.4cP(mPa・s)임.
○ 유청분말의 염도(NaCl)는 유청배지를 제조하거나 유청을 효소의 기질로 사용할 때 고려되어야 할 사항으로 본 연구에서 사용한 유청분말(삼익유가공)의 염도를 Volhard법으로 측정한 결과 평균 3.55%로 나타났음.
○ Alcalase, Neutrase, Pancreatin 3종류의 효소로 유청단백질을 가수분해 한 분해물을 이용하여 엘러지 저해 인자 기능 여부를 RBL-2H3세포를 이용하여 측정한 바 유청단백질 가수분해물 전체,3KD이상,3KD 이하로 구분한 결과 모두 엘러지 저해 기능은 아주 미약하거나 없는 것으로 확인되었음.
○ 락토페린은 여러 가지 생리활성기능이 보고된 바 있음.본 연구에서 U937,NK92,수지상세포의 분화된 상태인 mutz-3와 muDC를 이용하여 과민반응과 천식,면역 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 측정 한 결과 의미 있는 결과를 도출하였음.락토페린을 단독 또는 면역증강물질인과 혼합하여 처리한 경우 상승효과 작용으로 과민반응과 천식,면역 관련 유전자의 발현을 강하게 유도하였음.
○ 효소분해유청분말을 제조하여 여기에 효모추출물을 혼합한 것과 혼합하지 않은 조성물을 액상요구르트와 호상요구르트,치즈 제조 시에 1% 수준으로 첨가한 결과 대체로 유산균의 생육에 효과가 있었으며,효모추출물을 혼합한 것이 더 효과적이었음.
○ 유청농축액을 효소분해하여 분무건조 또는 진공건조로 효소분해유청분말을 제조하였는데,흡습력이 강하여 caking을 방지할 필요가 있었음. 그리고 효소분해를 위한 반응탱크는 살균 및 냉각과 반응을 Batch식으로 하기에 용이하도록 3중 자켓 타입으로 설계하여 제작하였으며,Pilotscale로 시험한 결과 살균과 효소반응공정에 소요되는 총시간이 8시간 20분이었고 만일 불활성화를 생략하면 6시간 40분이었다. 실제 현장에서 HTST 살균기를 사용하지 않고 Batch식으로 살균 냉각할 경우 이 정도의 시간이 소요될 것으로 예상됨. 또한 현재의 삼익유가공회사의 유청처리 공장에서 효소처리공정을 추가하는 Layout을 검토하였음.

Abstract ▼

Results:
Cheese whey is a by-product from natural cheese-making process, containing disaccharide lactose and whey proteins as the main ingredients. This study was conducted for development of growth-stimulant of LAB, functional whey-based peptides, and GOS preparation from the cheese whey. Major

Results:
Cheese whey is a by-product from natural cheese-making process, containing disaccharide lactose and whey proteins as the main ingredients. This study was conducted for development of growth-stimulant of LAB, functional whey-based peptides, and GOS preparation from the cheese whey. Major results obtained are described as followe: Sodium chloride in whey powder(Samik) was determined to be 3.55% by Volhard method. Compositions of the whey-based medium for LAB was best at the concentrations of 10% whey powder, 1% arganic nitrogen sources. of the twelve lab isolates, lactase activity was determined with ONPG disc assay to the typical colonies grown on the MRS agar surface. As a result, all the strains were opsitive in lactase activity. Of the 12 strains, probiotics LAB(L. paracasei FBT314, L. helveticus FBT1, L.acidophilus KCCM 32820, Lc. lact is ATCC 11454) were chosen and screened further, selected a single strain of L. paracasei based on the highest lactase activity of 1,053 Unit(206 U/protein, mg of specific activity). Lactase activity from L. paracasei FBT 314 was optimal at pH 6.5-7.0 and 30℃. It has been shown that maximum GOS production was obtained when incubated at 30% lactose, 30℃ for 4 hr and was determined at 19.1% of highest yield by a HPLC analysis. A lactase from L. paracasei FBT314 was successfully immobilized with 1.5% sodium alginate and obtained 15.4% of maximum GOS yield using the immobilized lactase with sodium alginate. Crude lactase enzyme was immobilized using microencapsulation method. Among the hydrocolloids as a coating materials, alginate and starch was primary selected and tested in single and mixed way of treatment, resulted that best activity was obtained with 1.5% sodium alginate(38.4 eP) aat 30℃.
On the other hand, whey proteins were used to digest with three kinds of proteases; alcalase, neutrase, and Pancreatin,resulted that degree of hydrolysis for 180 min at 50℃, pH 8.0 was 12.5 for alcalase(Novo), 15.15 for neutrase(Novo), and 21.73 for Pancreatin(Novo), which was the highest percentage of hydrolysis. Moreover, the peptide profiles was shown less than Mr 3,000 and significantly different each other with the three proteases used, suggested that further studies need in order to find distinct functional properties of the whey-based peptides. In terms of titratable acidity(TA) development and viable cells counts of LAB, whey protein hydrolysate was better nitrogen source than skim milk powder but less than yeast extract. In addition, viable cell counts were 1.6 times higher than that of skim milk opwder, indicated that the whey protein hydrolysate was a promising nitrogen sources, which can substitute the yeast extract, in growth stimulation of LAB. It was highly expected that practical level of yeast extract was comparable to the whey protein hydrolysate in the growth promoting effect on LAB. When used the whey protein hydrolysate, growth stimulanting effect was confirmed on LAB and developed the economical production process in this study.
As for lactase activity, 12 lactic acid bacterial strains, three strains of Saccharomyces cerevisiae were screened, obtained that the activity were very slight in Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteriodes, Weissella kimchii, Saccharomyce cerevisia SD1(ourlabstock), Saccharomyces cerevisia MG3. Lactase activity of four yogurt starters(Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Lactobacill us helveticus, Lactobacillus paracasei) were compared with that of Lactozyme 3000. As a result, lactase activity of L. paracasei was almost similar to the commercial enzyme. Further characterization was performed, resulting that optimal pH and temperature were pH는 7.0, 30℃, respectively. This crude enzyme preparation was able to digest 10% lactose into 70% in 10 hr incubation and confirmed GOS production at 30℃ on TLC.
For the test of anti-allergic effect, proteases(alcalase, neutrase, Pancreatin)-digested whey proteins was subjected to cell-line test using RBL-2H3. Three samples(whole hydrolysate, fraction with 3Kd or above, 3kD or below)was tested and shown to be none to slight in its efficacy. As reported earlier, lactoferrin was effectve in immunomodulation on U937, NK92, dendritic cell line(mutz-3 and muDC), and also in asthma, anaphylactic shock, and allergy. Protease-digested whey proteins were effective in growth promotionof LAB along with yeast extract as a nitrogen source. Protease-digested whey proteins could be manufactured by vacuum-or spray-crieing method but special care needs not to form cake. Reaction tank for the protease-digestion was designed and manufactured triple jacket type, turned out to be an efficient batch-type equipment and taking 8 hr 20 min for whole treatment period in preliminary pilot plant experiments.

목차 Contents

• 표 지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• Summary ... 10
• CONTENTS ... 15
• 목 차 ... 18
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 21
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 21
• 제 2 절 연구개발의 목표 및 내용 ... 23
• 1. 연구개발 목표와 내용 ... 23
• 2. 연차별 연구개발 목표와 내용 ... 24
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 26
• 제 1 절 국내․외 관련기술의 현황과 문제점 ... 26
• 제 2 절 앞으로의 전망 ... 29
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 30
• 제 1 절 제 1년차 연구개발수행 내용 및 결과 ... 30
• 1. 연구범위 및 연구수행 방법 ... 30
• 2. 세부연구수행 결과 ... 33
• 가. 제 1세부과제 ... 33
• (1) 유청 및 그 가공처리물의 검색과 생물공학적 제조기술의 탐색, 문헌조사 ... 33
• (2) 유청의 성분,조성 표준화 및 알코올 발효조건 수립 ... 33
• (3) 유당분해 효소 및 유당분해 미생물의 선별 ... 35
• 나. 제 1협동 과제 ... 42
• (1) 가수분해효소 선정 ... 42
• (2) 유청단백질의 가수분해 ... 42
• (3) 결론 ... 64
• 다. 제 2협동 과제 ... 64
• (1) 유산균의 생육촉진효능 유청 소재 개발 ... 64
• 마.유청으로부터 유산균 생육촉진물질의 제조공정 ... 77
• 제 2 절 제 2년차 연구개발수행 내용 및 결과 ... 79
• 1. 연구범위 및 연구수행 방법 ... 79
• 2. 세부연구수행 결과 ... 80
• 가. 제 1 세부 과제 ... 80
• (1) 효소처리 및 유산균 발효에 의한 갈락토올리고당 생산 ... 80
• (2) 효소 고정화법에 의한 갈락토올리고당(GOS)의 생산,수율 향상 및 발효 제어 연구 ... 93
• (3) 유청분말의 염도(Volhard법) 및 유당, 갈락토올리고당(GOS), 포도당, 자당, 갈락토오스 함량 측정 ... 97
• 나. 제 1협동 과제 ... 98
• (1) 유청 단백질 및 가수분해물의 엘러지 저해 인자 기능 ... 98
• (2) 유청 단백질인 락토페린의 염증반응 효과 ... 101
• 다. 제 2협동 과제 ... 107
• (1) 발효제품 첨가제 완성 ... 107
• 제 3 절 제 3년차 연구개발수행 내용 및 결과 ... 124
• 1. 연구범위 및 연구수행 방법 ... 124
• 가. 제 1세부 과제 ... 124
• 2. 세부연구수행 결과 ... 125
• (1) 갈락토올리고당이 다량 함유된 prebiotic물질 생산 기술개발 ... 125
• (2) 농축유청 발효액으로부터 갈락토올리고당의 분리/정제 기술 개발 ... 127
• (3) 시제품 제조 ... 128
• (4) Prebiotics소재의 유용 미생물 증식 촉진효과 검토 ... 129
• 나. 제 1협동 과제 ... 139
• (1) 유청단백질 및 가수분해물이 염증 및 엘러지 반응에 미치는 영향 ... 139
• (2) 가수분해물의 항산화 기능 ... 140
• (3) 유청단백질 가수분해물의 항원성 저하 효과 ... 142
• (4) 가수분해물의 mouse IgE 분비에 미치는 영향 ... 147
• (5) 유청단백질의 기능성 소재 기반 구축 ... 149
• 다. 제 2협동 과제 ... 150
• (1) 치즈유청으로부터 Growth Promotion 물질 및 생산공정의 개발 ... 150
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 160
• 제 1 절 연도별 연구개발목표 및 달성도 ... 160
• 제 2 절 연구개발 실적 및 기술발전에의 기여도 ... 163
• 1. 연구개발 실적 ... 163
• 가. 연구 결과에 대한 학술논문 발표 ... 163
• 나. 연구 결과에 대한 특허 출원 ... 163
• 다. 연구 결과에 대한 학술대회 발표 ... 163
• 라. 교육 및 지도 활용 ... 164
• 2. 관련분야 기술발전에의 기여도 ... 164
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 166
• 제 1 절 기대 성과 ... 166
• 가. 연구개발결과의 활용방안 ... 166
• 나. 기대 성과 ... 166
• 제 2 절 타 연구에의 응용 및 산업체 활용 방안 ... 167
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 168
• 제 7 장 참고문헌 ... 170
• 끝페이지 ... 177