초록 ▼

○ 연구결과
본 연구는 DGGE 방법을 통해서 전통 발효식품인 청국장의 발효미생물상 조사하였으며,청국장 미생물들의 특성을 분석하여 식품위해 미생물 및 유해물질로부터 안전성이 확보되고 기능성을 보유한 특화된 청국장을 생산할 수 있는 청국장 발효용 기능성 종균을 개발하는 연구를 수행하였다.
1.DGGE 방법 및 배양방법에 의한 청국장 발효미생물 군총 비교분석
전통식 방법으로 제조하고 있는 서일농원,미륵산농원,김점례 할머니,풀목산농원에서 수집한 청국장과 볏짚으로부터 배양방법을 사용하여 미생물을 분리하였고 동시에 비배양방법

○ 연구결과
본 연구는 DGGE 방법을 통해서 전통 발효식품인 청국장의 발효미생물상 조사하였으며,청국장 미생물들의 특성을 분석하여 식품위해 미생물 및 유해물질로부터 안전성이 확보되고 기능성을 보유한 특화된 청국장을 생산할 수 있는 청국장 발효용 기능성 종균을 개발하는 연구를 수행하였다.
1.DGGE 방법 및 배양방법에 의한 청국장 발효미생물 군총 비교분석
전통식 방법으로 제조하고 있는 서일농원,미륵산농원,김점례 할머니,풀목산농원에서 수집한 청국장과 볏짚으로부터 배양방법을 사용하여 미생물을 분리하였고 동시에 비배양방법인 DGGE 방법을 이용하여 청국장 발효미생물 군총을 조사하였다.Trypticsoy agarplate당 100개 colony 정도가 얻어진 plate의 미생물은 모두 순수분리한 후,16S rDNA 동정을 수행하였고 청국장과 볏짚시료로부터 DNA를 직접 추출하여 PCR 증폭 후,DGGE 방법에 의한 청국장 발효미생물을 분석하였다.배양방법과 DGGE 방법을 이용하여 청국장 발효미생물 군총을 조사한 결과,서일농원의 볏짚과 청국장 시료에서는 Pantoea agglomerans와 B.subtilis가 각각 우점하였고,미륵산농원의 볏짚과 청국장 시료에서는 Pantoea ananatis와 B. licheniformis가 각각 우점하였고,김점례 할머니의 볏짚과 청국장 시료에서는 B.subtilis,Mycobacterium sp.와 B.licheniformis가 각각 우점하였고,풀목산농원의 볏짚과 청국장 시료에서는 B.subtilis,uncultured bacterium와 B.licheniformis가 각각 우점하였다.그 외에는 Bacillus,Enterococcus,Pseudomonas,Rhodococcus,uncultured bacterium,Carnobacterium 속 미생물들이 볏짚과 청국장 시료에 존재하는 것으로 확인되었다.
2.청국장 발효용 특화미생물 발굴
청국장 발효용 특화미생물은 단백질 분해활성,혈전분해 활성,γ-glutamyltrans peptidase 활성, decarboxylase 저활성,Bacillus cereus에 대한 길항성이 우수한 미생물을 각각 선발하였다.단백질 분해활성은 isolated soy protein (ISP)를 기질로 사용하여 측정한 결과,청국장과 볏짚시료로부터 단백질 분해활성이 우수한 Bacillus subtilis KC83,Bacillus amyloliquefaciens HC188,Bacillus licheniformis MC138,Bacillus subtilis PS23,Bacillus PS46과 같이 총 5균주를 최종 선발하였다. 혈전 분해활성은 fibrin을 기질로 사용하여 측정한 결과,청국장과 볏짚시료로부터 분리한 Bacillus amyloliquefaciens HC188와 Bacillus subtilis SC14균주를 혈전분해 활성이 우수한 미생물로 최종 선발하였다. γ-Glutamyltrans peptidase 활성은 γ-L-glutamyl-3-carboxy -4-hydroxyaniline을 기질로 사용하여 측정한 결과,청국장과 볏짚시료로부터 분리한 Bacillus amyloliquefaciens KC41와 Bacillus subtilis MC118균주가 γ-GTP 효소활성이 가장 높아 γ-glutamate생성량이 높은 미생물로 최종 선발하였다.아미노산을 첨가한 decarboxylating medium에서 배양한 후,아미노산의 탈탄산화 반응은 pH 에 의한 indicator의 변화로 확인한 결과,배양 60-72시간까지 음성반응을 유지하여 Bacillus subtilis PS8,B.subtilis MC108,B.subtilis PR55을 biogenic amines 저생성 미생물로 최종 선발하였다. Decarboxylase활성이 낮은 선발 균주들의 decarboxylase gene함유 여부를 조사한 결과,선발균주에 서는 histidine decarboxylase (hdc) gene이 확인되지 않았으나 B.subtilis PR55균주에서만 tyrosine decarboxylase(tdc)gene이 확인되었다.
Paper disc방법과 agar well diffusion방법을 이용하여 독소생산 식중독 미생물인 B.cereus에 대한 청국장 분리미생물의 항균활성을 수행한 결과,가장 우수한 항균활성을 나타낸 B.licheniformis KC105와 B.subtilis HH28균주를 선발하였다.
3.선발미생물을 이용한 청국장 발효 및 품질특성 검토
단백질 분해활성,혈전 분해활성,decarboxylase저활성,γ-GTP 생성량,B.cereus길항성이 우수한 선발미생물을 종균으로 사용하여 청국장을 제조하였다.제조한 청국장 간의 생균수는 9.25∼9.60Log CFU/g 수준으로 유의적 차이가 없었고 수분함량은 모든 청국장이 50∼58%를 유지,pH는 7.6∼8.2, 아미노태 질소 함량은 316.9∼384.6mg%,암모니아태 질소함량은 81.0∼113.0mg/ml이었다.청국장 특유의 점질물 생성과 관련이 있는 γ-PGA 생성정도는 점질물의 길이로 측정하였는데, γ-glutamyltranspeptidase (γ-GTP) 효소활성이 우수한 선발미생물을 이용하여 발효한 청국장에서 점질물 길이가 가장 높은 결과를 나타내었다.청국장의 외관,향기,맛,전체적인 기호도에 대한 관능평가 결과,외관은 점질물 생성에 관여하는 γ-GTP 활성이 높은 미생물인 B.amyloliquefaciens KC41과 B.subtili sMC118,그리고 biogenicamine저감화 발효미생물인 B.subtilis KC16-2을 종균으로 사용하여 발효하였을 때 청국장 점질물 생성량과 점성으로 외관상 더 우수하게 평가하였다.향기에서 는 청국장 간의 유의적 차이가 나타나지 않았다.B.amyloliquefaciens HC188및 γ-GTP 활성이 높은 미생물인 B.amyloliquefaciens KC41과 B.subtilis MC118을 종균으로 사용한 청국장에서 우수하게 평가하였다.전체적인 기호도를 보면 B.amyloliquefaciens KC41로 만든 청국장이 가장 우수한 것으로 판단되었다.
4.청국장 발효용 종균배양 및 제제화 조건 검토
종균의 최대 포자생성을 위한 배양조건 검토한 결과,DSM 배지에서 36시간동안 배양시,5.7×10⁸ CFU /mL으로 최대값에 도달하였다.포자생성은 전체적으로 배양 36시간까지 점차 증가하기 시작하여 3.6×10⁸ CFU /mL로 최대 생성하였으며 포자생성율은 64.9%를 나타내었다.무기염의 영향은 Ca(NO₃)₂,MnCl₂,FeSO₄을 모두 혼합하여 종균을 배양시 포자생성율은 최대 67.7%를 나타내었다.최대 포자생성을 위해 DSM 배지조성에서 초기 pH,무기염 농도,glucose농도,glucose와 ribose첨가량의 영향을 조사한 결과,DSM 배지의 초기 pH는 7.5,무기염 첨가농도는 0.1%,무기염인 Ca(NO₃)₂과 MnCl₂의 농도는 각각 1.0 M과 10 mM,탄소원으로 첨가한 glucose의 농도는 0.1%,glucose와 ribose는 50:50로 첨가하였을 때,포자생성율 77.4%를 생성하였다.5L발효조에서 종균의 포자를 고농도로 생성하기 위해 통기조건을 검토한 결과,1.5vvm 통기조건으로 36시간동안 배양하였을때,포자생성율은 78.7%를 나타내었다.5L발효조를 이용하여 최적화된 DSM 배지 3L에 종균을 1% (v/v)접종하고 37℃에서 250rpm으로 교반해 주며 1.5vvm의 통기조건에서 36시간동안 배양한 후,3L 배양액으로부터 회수한 포자는 동결건조하여 1.21g의 종균제제를 생산하였다.생산한 종균제제를 80℃에서 20분동안 열처리하여 생존율을 측정한 결과,종균제제의 포자생존율은 95.7%로 높은 생존율을 확인하였다.
5.특화청국장 시제품 제조
특화청국장 시제품의 제조는 γ-GTP 효소활성이 가장 높은 B.amyloliquefaciens KC41 선발균주,decarboxylase효소활성이 가장 낮은 B.subtilis MC108 선발균주,혈전분해 효소활성이 가장 높은 B.amyloliquefaciens HC188,B.cereus균주에 대한 항균활성이 가장 높은 B.subtilis HH28분리균주를 특화청국장 발효용 종균으로 사용하였다.48시간동안 발효하여 청국장 시제품을 제조한 후,이화학적 특성을 비교하였다.청국장 발효용 종균 중에서 B.amyloliquefaciens KC41균주가 비교적 많은 점질물을 생산하고 청국장의 맛을 좌우하는 아미노태질소의 생산량이 가장 많을 뿐만 아니라,불쾌취성분의 일종인 암모니아태질소의 생산량이 적은 것으로 나타내었다.청국장 시제품을 제조하고 기호성을 조사한 결과,청국장 시제품 KC41에서 전체적으로 외관,맛,향기,종합적 기호성에서 월등하게 우수하다는 응답을 얻었다.기존에 청국장에 비해 점질물의 생성이 많고 구수한 향과 담백한 맛을 소비자들이 선호하는 것으로 판단되며,γ-GTP 효소활성이 우수한 청국장 발효용 종균을 사용하여 청국장 제조시 우수한 평가를 받을 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Ⅳ.Results
In this study,bacterial community structure of Chungkookjang, a traditional Korean fermented soybean food,was investigated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis. Chungkookjang microorganisms were analyzed a functional characterization. Development of specialized microorgan

Ⅳ.Results
In this study,bacterial community structure of Chungkookjang, a traditional Korean fermented soybean food,was investigated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis. Chungkookjang microorganisms were analyzed a functional characterization. Development of specialized microorganism was performed for Chungkookjang fermentation which ensured a safety against food-borne pathogen and noxious substance.
1. Investigation of bacterial community from Chungkookjang by culture-based and denaturing gradient gel electrophoresis analysis
The bacterial community of Chungkookjang and rice-straw collected from various areas (Gyeonggi, Gangwon, and Jeolla) was investigated using both culture-dependent and -independent methods. Pure cultures were isolated from rice-straw and Chungkookjang on tryptic soy agar plates with 43–121 colonies and identified by 16S rDNA gene sequence analysis, respectively. The traditional culture-based method and DGGE analysis of PCR-amplified 16SrDNA confirmed that Pantoea agglomerans and B.subtilis were identified as predominant in the rice-straw and Chungkookjang, respectively, from Seoil farm, Pantoea ananatis and B. licheniformis were identified as predominant in the rice-straw and Chungkookjang from Mireuksan farm, and B.subtilis or Microbacterium sp. and B. licheniformis were identified as predominant in the rice-straw and Chungkookjang from Kimjeomrae, and B. subtilis or uncultured bacterium and B. licheniformis were identified as predominant in the rice-straw and Chungkookjang from Pulmoksan farm. Other stains, such as Bacillus, Enterococcus, Pseudomonas, Rhodococcus, uncultured bacterium,and Carnobacterium were also present in the rice-straw and Chungkookjang. 2. Excavations specialized microorganisms for Chungkookjang frementation Protease activity was assayed with ISP as substrate. A total of 5 strains (Bacillus subtilis KC83, Bacillus amyloliquefaciens HC188, Bacillus licheniformis MC138, Bacillus subtilis PS23, and Bacillus PS46) which, exhibited strong protease activity were selected among the isolated strains from therice-straw and Chungkookjang. Fibrinolytic activity was assayed with fibrin as substrate. A total of 2 strains (Bacillus amyloliquefaciens HC188 and Bacillus subtilis SC14) which, exhibited strong fibrinolytic activity were selected among the isolated strains from the rice-straw and Chungkookjang. γ-Glutamyltran peptidase activitywas assayed with γ-L-glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilin as substrate. A total of 2 strains (Bacillus amyloliquefaciens KC41 and Bacillus subtilis MC118) which, exhibited strong γ-glutamyltrans peptidase activity were selected among the isolated strains from the rice-straw and Chungkookjang. Biogenic amine-reducing microorganisms assayed with decarboxylating medium. A total of 3 strins (Bacillus subtilis PS8, B. subtilis MC108, and B. subtilis PR55) having the lower decarboxylas activity were selected among the isolated strains from the rice-straw and Chungkookjang. PCR analysis showed that the histidine decarboxylase (hdc) gene was absent in Bacillus subtilis PS8, B. subtilis MC108, and B. subtilis PR55 strains. However, PCR analysis showed that the tyrosine decarboxylase (tdc) gene was present in B. subtilis PR55 strain. Antagonistic activity was assayed with paper disc and agar well deffusion method against B. cereus. A total of 2 strains (B. licheniformis KC105 and B. subtilis HH28) which, exhibited strong antagonistic effect on B. cereus were selected among the isolated strains from the rice-straw and Chungkookjang.
3. Chungkookjang fermented with selected microorganism and investigation of quality properties
Chungkookjang were fermented by selected microorganisms producing excellent protease, fibrinolytic, γ-polyglutamat, lower decarboxylase activity and antagonistic effect on B. cereus.Physico-chemical properties (total viable cell count, moisture, pH, amino nitrogen, ammonia nitrogen, and crude protein) were 9.25~9.60 Log CFU/g, 50∼58%,7.6∼8.2, 316.9∼384.6 mg%, 81.0∼113.0 mg/ml, 51.7∼57.0%, respectively. The length of slime materials showed the highest result in the Chungkookjang fermented by selected microorganism producing excellent γ-polyglutamat. Sensory evaluation on appearance, odor, taste, overall acceptability were evaluated by 10 panelists. The appearance and taste of Chungkookjang fermented by B..amyloliquefaciens KC41(γ-polyglutamate activity) and B.subtilis MC118 (γ-polyglutamate activity),was shown to be significantly high. Overall acceptability of CChungkookjang fermented by B. amyloliquefaciens KC41 (γ-polyglutamate activity) was shown to be significantly high.
4. Seed culture of Chungkookjang fermented and investigation of preparation condition
Maxium spore production of Bacillus amyloliquefaciens KC41 was studied through culture medium optmization. Vegetative cells and spores were 5.7×10sup>8 and 3.6×10sup>8 CFU / mL in the DSM medium for 36 h at 37℃, respectively. The conditions of maxium spore production were initial pH 7.5,0.1% (w/v)mineral solution[Ca(NO₃)₂ 1 M, MnCl₂ 10 mM, FeSO₄ 1 mM], and 0.1% glucose:ribose(50:50) in optimized DSM medium. The sporulation efficiency was was77.4% in the optimized culture condition. The effect of aeration rateon the maxium opore production of Bacillus amyloliquefaciens KC41 was also studied in a batch fermentor which was carried out in a 5 L bioreactor with a working volume of 3 L containing optimized DSM medium. As a result, maxium sporulation efficiency of batch culture was 78.7% at 37℃, 250 rpm, pH 7.5 and 1.5 vvm. The results that preparation of seed culture was treated by heat at 80℃ for 20 min, an spore survival rate of preparation of seed culture 95.7%.
5. Manufacture of specialized Chungkookjang prototype
Specialized Chungkookjang prototype were fermented by B.amyloliquefaciens KC41 (γ-GTP activity), B. subtilis MC108 (lower decarboxylase activity), B. amyloliquefaciens HC188(fibrinolytic activity), and B. subtilis HH28 (antagonistic effect on B. cereus). Physico-chemica properties(total viable cell count, moisture, pH, amino nitrogen, and crude protein) of specialized Chungkookjang prototype were studied. B. amyloliquefaciens KC41 produced relatively much slime materials and amino nitrogen, however, little amount of ammonia nitrogen was contained specialized Chungkookjang prototype fermented by B.amyloliquefacien KC41. Preference of Chungkookjang prototypes fermented with specialized microorganisms. The appearance, odor, taste and overall acceptability of Chungkookjang fermented by B. amyloliquefaciens KC41 (γ-polyglutamate activity) was shown to be significantly high.
6. Recovery of enzyme activity from selected microorganism
When Bacillus amyloliquefaciens KC41 highly producing γ-PGA was subcultured, γ-GTPase and proteolytic activities were decreased as 91.9% and 76.9%, respectively. The more subculture number of B. amyloliquefaciens KC41, enzyme activities were reduced. The enzyme activity recovered from the mixed culture with M. luteus KCCM 11905 strain, however, enzyme activity in the culture of B. amyloliquefaciens KC41 was reduced by 50%.
In addition, It confirmed that colony which decreased enzyme activity increased enzyme activity by mixed culture with M. luteus KCCM 11905 strain.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 15
• 목 차 ... 16
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 17
• 제 2 장 국내·외 기술개발 현황 ... 19
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 22
• 제 1 절 DGGE방법 및 배양방법에 의한 청국장 발효미생물 군총 비교분석 ... 22
• 제 2 절 청국장 발효용 특화미생물 발굴 ... 64
• 제 3 절 선발미생물을 이용한 청국장 발효 및 품질특성 검토 ... 78
• 제 4 절 청국장 발효용 종균배양 및 제제화 조건 검토 ... 83
• 제 5 절 특화청국장 시제품 제조 ... 93
• 제 6 절 종균의 효소활성 회복 검토 ... 100
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 145
• 제 1 절 목표달성도 ... 145
• 제 2 절 관련 분야의 기여도 ... 146
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 147
• 제 1 절 연구결과의 활용계획 ... 147
• 제 2 절 연구개발결과의 성과 및 활용목표 대비 실적 ... 148
• 제 6 장 참고문헌 ... 150
• 끝페이지 ... 153