보고서 정보
주관연구기관 |
세계김치연구소 |
연구책임자 |
김태운
|
참여연구자 |
박해웅
,
이종희
,
최학종
,
장자영
,
김현주
,
오영준
,
박선영
,
김유진
,
그외 다수
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2014-09 |
주관부처 |
농림축산식품부 |
사업 관리 기관 |
농림수산식품기술기획평가원 |
등록번호 |
TRKO201400030020 |
DB 구축일자 |
2015-07-25
|
초록
▼
Ⅳ. 연구개발결과
1. 김치의 품질 개선을 위한 우수 미생물 자원 확보
∙ 발효 후기단계의 김치에서 분리한 균주 중 배양액의 pH가 낮은 균주들인 Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei을 김치 산패 지시균으로 선정하였음
∙ 이들 균주에 대한 생육억제능이 우수한 Lactococcus. lactis WK11, Lactobacillus brevis WK12를 항균활성 우수 균주로 선발하였음
2. 김치용 미생물 첨가제 개발
Ⅳ. 연구개발결과
1. 김치의 품질 개선을 위한 우수 미생물 자원 확보
∙ 발효 후기단계의 김치에서 분리한 균주 중 배양액의 pH가 낮은 균주들인 Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei을 김치 산패 지시균으로 선정하였음
∙ 이들 균주에 대한 생육억제능이 우수한 Lactococcus. lactis WK11, Lactobacillus brevis WK12를 항균활성 우수 균주로 선발하였음
2. 김치용 미생물 첨가제 개발
∙ Lc. lactis를 MRS broth에 배양한 후 원심분리하여 균체를 농축하고 균액과 동량의 2% alginate를 첨가하여 최종적으로 1% alginate 용액을 제조하였음. 이러한 유산균과 alginate 1% 혼합용액을 2.0 mm의 비드로 코팅하여 10% 콩가루 수용액과 함께 48시간동안 동결건조 하여 미생물 첨가제를 제조하였음
3. 미생물 첨가제를 이용한 김치 발효 속도 조절 기술개발
∙ Lc. lactis 1×107 CFU/g와 김치 중량 10% Lc. lactis 배양액을 첨가하여 처리한 김치군은 대조군에 비해 적숙기가 2배 이상 연장되었음
∙ Bead 형태로 제조한 미생물첨가제도 생균을 배양하여 첨가했을 때와 유사한 효과를 나타내어 Lc. lactis를 제제화 하여 이를 김치에 적용하여도 대조군과 비교하여 품질유지기한이 연장된 김치를 제조할 수 있을 것으로 사료되었음
∙ 양념을 65℃에서 30분 열처리하거나 젖산을 첨가시 또는 병행할 경우, 연장 효과가 조금 향상 되었음
4. 저염김치의 위생학적 안전성 향상 기술 개발
∙ 종균 첨가 김치의 대장균군 균수 변화를 살펴본 결과 담금 당일에는 대조군과 유사한 균수를 나타내었지만 김치 발효가 진행됨에 따라 종균을 첨가한 실험군에서 대조군보다 그 감속 속도가 빠른 것으로 나타났음
5. 개발 미생물 첨가제를 이용한 전통발효식품의 최적 발효공정 개발
∙ 시판용 소독수(차아염소산나트륨액 100ppm)와 저온살균 처리 후 원부재료의 미생물 균수변화를 살펴본 결과 소독수의 경우 2분 이상 처리시 저감 효과가 있었으며 5분 처리시 초기 균수가 더욱 저감되었음. 양념의 경우 65℃에서 30분간 처리시 저감효과가 있는 것으로 나타났음
∙ 초기 종균 접종량을 Lc. lactis 1×103 CFU/g, 1×105 CFU/g, 1×107 CFU/g으로 각각 달리하여 접종한 결과 1×107 CFU/g으로 접종한 김치에서 품질유지기한 연장 효과가 있었음. 또한 종균 첨가시기에 따른 차이를 알아본 결과 추가적인 숙성과정 없이 김치를 담글 때 양념에 종균과 함께 배양액을 잘 섞어 김치를 제조하는 것이 효율적이었음
6. 젓갈발효의 우점종 도출
∙ 멸치젓갈의 우점종: 멸치젓갈로부터 분리한 315 균주의 동정 결과, Virgibacillus halodenitrificans를 포함하는 내염성 Bacillus 근연종이 우점하는 것으로 확인
∙ 새우젓갈의 우점종: 새우젓갈로부터 분리한 295 균주의 동정 결과, Staphyococcus equorum을 포함하는 coagulase-negative staphylococci가 우점하는 것으로 확인
∙ 오징어젓갈의 우점종: 오징어젓갈로부터 분리한 121 균주의 동정 결과, 내염성 Bacillus 속이 가장 우점하고, coagulase-negative staphylococci가 우점하는 것으로 밝혀짐
7. 식중독균(황색포도당구균, 장염비브리오균) 생육저해활성 보유 오징어젓갈용 종균 확보
∙ 6% NaCl 농도에서 황색포도당구균 및 장염비브리오균의 생육저해가 가능한 오징어젓갈 발효용 종균 후보 6균주 확보: Bacillus pumilus ANR7, Bacillus pumilus RM010, Bacillus siamensis RM502, Bacillus tequilensis AM5R3, Bacillus tequilensis MA504, Bacillus tequilensis MS503
8. 안전한 젓갈발효용 종균 도출
∙ 본 연구에서 우점종으로 도출된 Staphylococcus equorum 균주들의 안전성 평가 수행
- 본 연구에서 확보한 185 S. equorum 균주 중, ampicillin 내성을 나타낸 균주를 제외한 126균주를 대상으로 항생물질 내성 평가, 혈청분해(hemolysis) 확인, 혈청분해 관련 유전자 존재 확인, biofilm 형성 확인, enterotoxin 생성 유전자 존재 확인
- 39 S. equorum 균주가 위해성이 없는 것으로 평가됨
∙ 안전성이 검증된 S. equorum 39 균주들을 대상으로 한 기능성 평가: biogenic amines 생성 평가, protease, lipase, nitrate reductase 활성 평가
∙ 안전성과 기능성이 확보된 젓갈발효용 종균 후보 S. equorum 5 균주 확보(C4X11, C6037, KS1035, KS1039. KS2036)
∙ 선발된 균주들은 20% 이상의 NaCl이 첨가된 배지에서 생장이 가능하여 젓갈용 종균으로서의 안전성과 기능성을 모두 확보한 것으로 평가됨
9. 젓갈발효용 종균의 첨가법 개발
∙ 새우를 이용한 종균 첨가용 배지를 개발하고 그 효용성을 확인
∙ 동결건조에 의한 종균의 사멸률 및 회복률을 확인하여 종균 보급법으로써의 적용성 확인
10. 젓갈용 미생물 첨가제의 효과 분석
∙ 135일간의 새우젓갈 숙성과정 중의 bacteria 군집 천이 분석을 통하여 종균 후보 균주 S. equorum이 숙성과정 중에서의 우점화를 규명하였기에 젓갈용 종균으로의 유효성을 검증함
∙ 확보한 종균 후보균주들이 25% NaCl이 첨가된 액체배지에서 사멸하지 않고 증식함을 확인하여 젓갈 발효용 종균으로써의 효용성 규명
∙ 젓갈 유래 bacteria 분석용 최적 배지 도출: 기존의 연구에서 사용된 실험실용 배지대비 marine agar의 유용성 규명
11. 식품첨가용 미생물의 안전성 평가법의 확립
∙ 유산균과 같은 식품용 미생물은 최근까지 안전성에 대한 의문 없이 기능성에 근거하여 식품용으로 사용되었으나, 최근에 식품용 미생물에 대한 위해성이 제기되면서 안전성 평가의 필요성이 증가하고 있음
∙ 본 연구과제에서의 S. equorum 균주의 안전성 및 기능성 평가 결과, 이들 균주의 안전성 및 기능성 관련 특성이 균주 특이적으로 나타남을 확인하였기에 식품용 미생물에 대한 안전성평가의 필요성이 확인되었음. 본 연구에서 확립된 안전성 평가 기준은 향후 식품용 미생물의 안전성 평가에 필요한 기초자료로 활용될 수 있음
12. 미생물 첨가제 제제화를 위한 배지 조성 개발
∙ 절임배추 착즙액을 기본배지 성분으로 활용하여 탄소원, 질소원, 미량성분을 조절
∙ Box-Behnken experimental design을 통하여 질소원들을 스크리닝하여 반응표면실험법을 실시함
∙ 미량성분들의 결핍이 유산균의 성장에 미치는 정도를 측정하여 필수 성분을 선발
∙ 질소원으로는 peptone 4%(w/v)첨가를 최적 배합으로 결정함
13. 미생물 첨가제의 제제기술 개발
∙김치 미생물 생존율이 보장된 단기형(액상형, 냉동형) 및 장기형(건조형) 제제기술 개발
∙미생물 첨가제 제형별 저장기간에 따른 생존율 검정
14. 미생물활성 및 생존율향상을 위한 보호제 선정
∙ 식품첨가등급의 소재를 사용하여 첨가제의 생존율을 높일 수 있는 동결보호제 선발함
∙ Weissella cibaria SW1-1, Lactobacillus plantarum A-1, Lb. sakei 2-12 24, Leuconostoc citreum 3526 균주를 콩가루를 사용한 처리구에서 생존율을 조사한 결과 90%이상의 생존율 나타내어 본 연구의 동결보호제로 선정함
∙ 동결보호제로 10% 콩가루를 사용 시, Lb. brevis A101 균주의 경우 92.7% Lc. lactis CHJ10 균주의 경우 94.7%의 높은 생존율을 나타냄
15. 미생물 첨가제 대량 배양기술 개발
∙ 식품첨가 등급의 주요 영양원 탐색_실험균주의 균체량 생성에 유리한 주요 영양원으로 포도당 및 효모추출물 선정_MRS 배지 대비 경제성 확보
∙ 배양 중 산도와 미생물 생육특성에 관한 상관관계 구명
16. 모의 유통조건을 통한 미생물 첨가제 활성 유지조건 확립
∙ 유통조건에 따른 활성변화 분석
∙ 유산균 제제를 –20℃에서 28일 보관한 경우의 생존율이 가장 우수함
∙ 실온에서 유산균 제제를 보관할 경우 생존율은 급격히 감소하여 0~19.1%의 생존율을 나타냄
∙ 알지네이트 1%를 사용한 비드와 동결보호제로써 10% 콩가루의 혼합은 저장기간 중 생존율의 향상되는 것을 확인함
17. 온라인과 오프라인을 통한 보급 시스템 구축 및 분양관련 관리 매뉴얼 작성
Abstract
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Ⅳ. Results of Research
1. Secure the microorganism resources for improving quality of kimchi
∙ Among the isolates from kimchi, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei are selected as indicator bacteria in sour kimchi, which are lower the pH of culture medium
∙
Ⅳ. Results of Research
1. Secure the microorganism resources for improving quality of kimchi
∙ Among the isolates from kimchi, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei are selected as indicator bacteria in sour kimchi, which are lower the pH of culture medium
∙ Lactococcus lactis WK11, Lactobacillus brevis WK12 are selected, which exhibits inhibitory activity against the bacteria associated with acidification of kimchi
2. The development of microbial additives for kimch
∙ Lc. lactis cultured in MRS broth were mixed with an equal volume of 2% alginate solution, the final concentrations were 1% alginate. This lactic acid bacteria and alginate 1% mixed solution was coated with 0.2 mm beads, soaked with 10% bean flour and lyophilized to 48 hours
3. Control of the fermentation rate using microbial additives
∙ Kimchi treated with Lc. lactis 1×107 CFU/g and 10% Lc. lactis culture medium(% of kimchi) prolonged optimal fermentation period (pH 4.2, acidity 0.6–0.8%) up to more than 2 times
∙ Microbial additives prepared in the form of beads, exhibited a similar effect to that of the addition of viable cells, may facilitate the formulated manufacture of kimchi with a longer shelf life
∙ Heat treated at 65℃-30 minutes with kimchi sauce or addition of lactic acid, have a slightly effect on extending shelf life
4. Improvement of hygienic safety for low-salted kimchi
∙ The initial counts of coliform bacteria in non-starter kimchi and starter kimchi were showed similar counts. However, depending on the fermentation progresses, it declined rapidly in starter kimchi due to the inoculated starter bacteria
5. The development of optimal fermentation processes for traditional fermented food using microbial additives
∙ Considering commercial antiseptic solution (100 ppm sodium hypochlorite solution) and the case of pasteurized result, antiseptic solution has microbial reduction effect more than 2 minutes treatment and 5 minutes treatment was better. In case of pasteurization condition of kimchi sauce, at 65℃ for 30 minites showed microbial reduction effect
∙ The initial number of Lc. lactis inoculated differently, 1×103 CFU/g, 1×105 CFU/g, 1×107 CFU/g each, the kimchi adapted 1×107 CFU/g as initial inoculum level prolonged shelf life. Futher, improve efficiency with inoculation method, mixed gently with culture medium, starter and kimchi sauce without additional aging periods at process for preparing kimchi
6. Identification of the dominant bacteria in jeotgal fermentation
∙ Jeotgal or jeot, a traditional Korean salted and fermented food, is made by adding 20–30% (w/w) salt to various types of seafood. To develop a more complete overview of the bacterial community present in jeotgal, 610 pure colonies were isolated from Myeolchi-jeotgal and Saeu-jeotgal , the most commonly consumed varieties of jeotgal, which are made with anchovy (Engraulis japonicas) and tiny shrimp (Acetes japonicas), respectively. The bacterial isolates were identified by 16S rDNA sequence analysis. A total of 104 species comprising 47 genera and 31 previously unknown species were identified. Eleven genera were isolated from both jeotgal samples, including species in the genera Staphylococcus, Bacillus, Halomonas, and Kocuria, with Staphylococcus spp. constituting the highest number. The most populous genus detected in Myeolchi-jeotgal was Bacillus and its relatives, while the most populous in Saeu-jeotgal was Staphylococcus mainly identified as S. equorum. They may be the major organisms involved in jeotgal fermentation and the future starter candidates.
∙ The bacterial community present in Ojingeo-jeotgal, which is made with squid. One hundred twenty one bacteria were isolated and identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Among the 121 total isolates, the most populous genus was Bacillus and then followed by coagulase-negative staphylococci.
7. Selection of the starter candidates for Ojingeo-jeotgal fermentation which inhibit the growths of Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus
∙ Six strains of Bacillus species inhibiting the growth of food pathogens, Staphylococcus aureus and Vibrio parahaemolyticus, were selected from the 121 isolates from Ojingeo-jeotgal. They inhibited the growths of both pathogens and showed proteolytic activities on the media containing 6% NaCl and 2% skim milk.
8. Selection of the safe starter candidates for jeotgal fermentation
∙ To select starters for jeotgal, the safety and technological properties of its predominant bacteria isolates, which were identified as Staphylococcus equorum, were assessed. As the result of safety assessments of S. equorum (antibiotic susceptibility test, hemolysis gene identification, biofilm formation test, and enterotoxin gene identification), 39 S. equorum strains cleared all of the tested safety hazards and were adopted for technological property assessments.
∙ Among the 39 strains, five strains (C4X11, C6037, KS1035, KS1039. KS2036) exhibited protease, lipase, nitrate reductase activities and they did not produce four kinds of biogenic amines.
∙ Most of the strains could grow on the agar with 20% NaCl, therefore the selected five strains covers the safety and technological requirements for jeotgal starters.
9. Development of starter culture application methods
∙ Development of food-grade medium made with shrimp for the culture of starters
∙ Evaluation of freeze-drying efficiency for the long-term storage of starter candidates
10. Evaluation of starter culture effectiveness in jeotgal fermentation
∙ Culturable bacterial community analysis of Saeu-jeotgal was performed during ripening for 135 days to prove that a wild-type strain can be used to accelerate and standardize jeotgal. Thirty nine species detected at the day 1 were decreased to 13 species at day 135. The order of dominance in genus level is Staphylococcus, Salimicrobium, Kocuria, and Psychrobacter . The proportions of Staphylococcus and Salimicrobium began 2% and then became 39% and 36% of all isolates at the day 135, respectively. Both strains may be the dominant of Saeu-jeotgal and were shown to grow at 24% salt condition. We confirmed the effectiveness of Staphylococcus species for Saeu-jeotgal fermentation.
∙ Proteolytic bacteria were isolated from Myeolchi-jeotgal and Saeu-jeotgal using high-salt-content media and their growths in high-salt-content media were checked to draw the role of bacteria during the ripening of jeotgal. Among the isolates, Virgibacillus halodenitrificans from Myeolchi-jeotgal and Halobacillus trueperi from Saeu-jeotgal showed proteinase activities. Vb. halodenitrificans and Staphylococcus equorum, the dominant species from Myeolchi-jeotgal and Saeu-jeotgal , showed growths at the nutrient broth containing 25% NaCl. They may play a significant role in the ripening of jeotgal and have a high possibility to be used as the starter.
11. Establishment of microbial safety assessment system
∙ Through this research study, we reconfirmed the necessity of characterization in the functionality and safety of S. equorum for starter development because all of the tested phenotypic characteristics were expressed in strain-specific manners. The methods applied for the safety assessments of S. equorum will be a good example for the safety assessment of starter candidates.
12. Development of Medium composition for microbial additive formulation
∙ Pickled cabbage juice solution by utilizing basic medium components, carbon source and nitrogen source, adjust the trace elements
∙ Box-behnken experimental design and screening of nitrogen through the reaction surface conducted experiments
∙ Nitrogen sources include peptone 4%(w/v) was added to determine the best formulation
13. Formulation Development of microbiological additives
∙ LAB starter can be liquid form, frozen form and powder form, liquid form is difficult to keep it and to maintain quality in the process of distribution but powder form is easy. Consequently in this study, in order to develop a formulation of the LAB starter,
∙ LAB starter(liquid form, freezed form, powder form) was evaluated during storage period
14. Screening of cryoprotectants to increase survivability of lactic acid bacteria
∙ Improvement of ciability of freeze-dried lactic acid bacteria using good-grade protective agents
∙ The viability of freeze-dried lactic acid bacteria (LAB), including Weissella cibaria SW1-1, Lactobacillus plantarum A-1, Lb. sakei 2-12 24 and Leuconostoc citreum 3526 was evaluated with food grade protective agents (e. g., skim milk, yeast extract, soy powder and trehalose)
∙ Soy powder showed a strong protective effect upon the viability of both LAB species, followed by skim milk and yeast extract.
∙ The viability of LAB species was not dose-dependent with soy powder, showing the highest rate of 92.7% for Lb. brevis A101 and 94.7% for Lc. lactis CHJ10 when 10% soy solution was used as a protective agent.
∙ Soy powder was best among protective agents, showing approximately 90%
15. Development of microbial additive mass culture technology
∙ Improvement of viability of freeze-dried lactic acid bacteria using food-grade protective agents
∙ Correlation on pH and microbial growth characteristics of the culture
∙ Glucose and yeast extract medium contrast selected _MRS broth MRS medium compared to ensure afford ability
16. Survivability of powder type starter during storage period
∙ According to the study, in case of Keeping the lactobacillus in -20℃ for 28 days, the survival rate was best. Results suggest the possibility of producing freeze dried powders of LAB starter with high viability for the food industry
∙ During storage of freeze-dried lactic acid bacteria, those survival rate decrease rapidly, reaching 0∼19.1% in room temperature.
∙ There was synergetic effect of soy powder to improve viability of LAB when Ca-alginate beads were soaked in 10% of soy powder solution before freeze-drying. No significant -rate was observed for both LAB
∙The highest survival rate was observed with 1% alginate solution, 10% soy powder solution showing 95.1%, 96.6% of survival rate right after freeze drying
17. Distribution system construction and supply management manual written by the online and offline
목차 Contents
- 표 지 ... 1
- 제 출 문 ... 2
- 요 약 문 ... 3
- SUMMARY ... 11
- CONTENTS ... 17
- 목 차 ... 18
- 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 19
- 제 1 절 연구개발의 목적 ... 19
- 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 19
- 제 3 절 연구개발의 범위 ... 24
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 25
- 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 33
- 1세부: 김치발효용 미생물첨가제 개발 및 발효조절기술 개발 ... 33
- 2세부: 김치발효용 미생물첨가제 개발 및 발효조절기술 개발 ... 72
- 협동: 젓갈용 우수미생물 선발 및 미생물 첨가제를 이용한 젓갈발효 조절 기술 개발 ... 143
- 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 187
- 제 1 절 목표달성도 ... 187
- 제 2 절 관련분야에의 기여도 ... 192
- 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 193
- 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 197
- 제 7 장 참고문헌 ... 200
- 끝페이지 ... 242
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