보고서 정보
주관연구기관 |
한국식품연구원 Korea Food Research Institute |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2012-01 |
과제시작연도 |
2011 |
주관부처 |
산업통상자원부 Ministry of Trade, Industry and Energy |
등록번호 |
TRKO201500002018 |
과제고유번호 |
1415118820 |
사업명 |
한국식품연구원연구운영비지원 |
DB 구축일자 |
2015-05-09
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201500002018 |
초록
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IV. 연구개발의 결과
1. 시료전처리 융합형 바이오센서 응용기술 개발
식중독균의 검출은 시료에서 특정미생물만을 분리하는 방법과 검출감도 증가를 목적으로 연구되어 왔다. 미생물을 검출하는데 시료전처리와 배양과정을 포함여하여 24시간에서 48시간 정도이며 분석을 위해서는 최대 3일 정도까지 일반적으로 소요된다. 이러한 미생물을 신속히 검출하기 위하여 형광염료가 포함된 다 기능성 silica 자성입자를 합성하였으며 이를 동정하였다. 또한 시료에서 미생물을 분리와 동시에 검출하는데 합성한 입자를 사용하여 성능을 평가하였다. 결
IV. 연구개발의 결과
1. 시료전처리 융합형 바이오센서 응용기술 개발
식중독균의 검출은 시료에서 특정미생물만을 분리하는 방법과 검출감도 증가를 목적으로 연구되어 왔다. 미생물을 검출하는데 시료전처리와 배양과정을 포함여하여 24시간에서 48시간 정도이며 분석을 위해서는 최대 3일 정도까지 일반적으로 소요된다. 이러한 미생물을 신속히 검출하기 위하여 형광염료가 포함된 다 기능성 silica 자성입자를 합성하였으며 이를 동정하였다. 또한 시료에서 미생물을 분리와 동시에 검출하는데 합성한 입자를 사용하여 성능을 평가하였다. 결론적으로, 5 nm 크기의 Fe3O4 자성입자를 core로 사용하여 40 nm 두께로 SiO2 shell을 형성시켜 80 nm 크기의 형광자성입자를 제작하였다. 그 입자는 588 nm 부근에서 형광을 나타내며 1분이내 자석에 포집되는 특성을 나타내었다. 이를 이용하여 미생물 분리 및 검출에 응용하였다.
선행연구에서 합성된 것보다 더 경제적이고 우수한 제랄레논 또는 데옥시니발레놀 형광추적자를 합성하고 현장에서 오염도 여부를 검출하는데 광학기반 분석법의 일종인 형광분석법을 응용하고자 하였다. 제랄레논의 경우, 합성된 ZEN-4AMF 추적자를 이용하여 민감도 (Sensitivity)를 측정하기 위해 옥수수-공시료 추출액 (n=10)을 이용하여 제조한 제랄레논 표준용액으로부터 정량곡선을 작성하고 검출한계를 측정하였다. 제랄레논 검출 범위는 100-5000 μg/kg 으로 나타났고 검출한계는 77 μg/kg 으로 측정되었다. Intra-day 실험에서 100, 300, 500, 1000 μg/kg으로 spiking 된 옥수수 시료의 회수율은 각각 112.9, 89.2, 94.0, 105.8%로 각각 나타났고 평균 회수율은 100.5±10.8% 이었다. 그리고 상대 표준 편차 (%)는 각각 16.2, 17.0, 7.5, 5.1% 이었다. 또한 5일간의 inter-day 회수율은 각 농도에서 112.7, 100.7, 108.9, 113.0%로 평균 108.7±5.6%로 나타났고 상대 표준 편차는 각각 8.9, 11.4, 7.6, 2.0%이었다. 본 형광편광분석법에 대한 intra-day와 inter-day 재현성의 회수율과 상대 표준 편차를 종합하여 볼 때 100±20%, 20% 미만으로 나타나, 전년도에 나타났던 저농도 범위에서의 높은 상대표준편차가 많이 개선되어 ZEN-4AMF를 이용한 형광편광면역분석을 이용한 옥수수 시료의 제랄레논 분석의 정확성 및 재현성이 많이 개선된 것을 확인할 수 있었다. 제랄레논 83 μg/kg 농도의 옥수수 인증표준물질을 이용하여 측정된 진도 (Trueness)는 122.4%로 나타났고 상대표준편차 9.2%로 조사되었다. 또한 안전성 제고 및 비용절감을 목적으로 모사체 (β-resorcylic acid (RA), quercetin)를 이용한 형광추적자를 제조하여 응용성 살펴본 결과, 모사체를 이용한 모든 형광추적자에서는 단클론 항체와의 반응성이 거의 나타나지 않았다. 나아가 형광편광계측장치를 경제성, 재현성 및 감도 측면에서 좀 더 개선하고자 dual 광원 (P광원 및 S광원) 및 단일 편광자를 사용하여 광의 intensity 손실을 감소시키고 편광순도를 향상 시키고자 하였다. 그 결과 개선된 형광편광 계측기는 신호 재현성이 높고 고가시약을 적게 요구하여 경제적인 것으로 나타났다.
표준 CMOS 공정으로 제작되어진 MOSFET형 바이오센서를 이용하여 곰팡이 독소인 데옥시니발레놀 및 위해미생물 E, coli O157검출을 시도하였고, 바이오센서의 전기적인 특성도 함께 분석하였다. 실리콘 기반 물질 위에 생체 분자를 고정시키는 방법으로, Au막 위에 싸이올이 자기조립 단분자층 (selfassembled monolayer, SAM)을 형성하는 성질을 이용하여 검출하고자 하는 항원-항체를 쉽게 고정시킬 수 있었다. SAM을 링커로 한 곰팡이독소와 E, coli O157의 항원-항체가 MOSFET형 바이오 센서의 게이트 부분에 부착되면 생물학적 혹은 화학적 반응을 통해 분자가 갖고 있는 전하성분에 의해 MOSFET의 전기적인 특성을 변화시켜 전기 신호로의 변환이 가능하게 된다.
또한 SPR 실험을 통하여 SAM과 항체 및 항원의 반응 여부를 확인할 수 있었다. 본 결과로부터 곰팡이 독소인 데옥시니발레놀과 E, coli O157은 항원-항체반응 및 바이오 물질의 결합으로 인한 드레인 전류의 변화를 통해 검출할 수 있었으며, 이와 같은 사실로 미루어 볼 때 MOSFET형 바이오센서는 다른 곰팡이 독소 및 미생물의 검출에도 적용될 수 있을 것이다. 아울러 본 연구에서 사용된 MOSFET형 센서의 비선형적인 특성을 이해하기 위해서는 향후 전해질/게이트 전극 계면에 대 한 연구가 필요할 것으로 생각된다. 따라서 형광편광검출법은 시간과 비용이 적게 들고 숙련된 기술이 필요 없는 간단하여 곰팡이독소를 포함한 위해물질을 신속하게 스크리링할 수 있는 검출법인 것으로 보인다.
또한 곰팡이독소 신속 검출용 바이오리셉터로서 재조합 단일사슬항체를 생산하기 위해, 형질전환 대장균 또는 효모 발현 시스템을 확립하였고, 발현율 및 활성이 높은 단일사슬항체를 생산하였다. 향후 현장 적용을 위해 발효조 등을 이용한 대량 생산 시스템이 구축되어야 할 것으로 사료되며, 항체 개발 기간의 단축을 위해, 활성이 좋은 항체의 신속한 선별이 가능한 표면 디스플레이법 등의 계속적인 시도에도 노력을 기울어야 할 것으로 보인다.
2. 고효율 검출 및 제어를 위한 식재료의 위험특성 분석
LOHAS 식재료 중 발생 가능한 위해인자를 선정하고 정성 및 정량 분석을 통하여 식재료 중 미생물 위해인자의 위험성을 확인하는 한편 오염원 추적을 위하여 최신 오염원 분석기술을 확립하고 최적화 하고자 하였다. LOHAS 식재료 (n=102)에서 6종 위해미생물의 정성 및 정량 분석한 결과 대장균(9.4%)과 황색포도상구균(5.2%)은 검출되었으나 살모넬라, 비브리오균, 리스테리아 모노사이토제네스균은 검출되지 않았다. LOHAS 식재료 중 신선편의 샐러드의 84.8%는 신선편의식품에 대한 바실러스 세레우스 정량규정(1,000/g)에 적합하였으나 15.2%는 기준을 초과하였으며, 특히 새싹 채소는 총균수 기준 및 바실러스 세레우스 기준을 초과하는 비율이 특히 높았다. LOHAS 식재료의 하나인 신선편이샐러드 생산 공정(3개 공장)별 위해 미생물을 분석한 결과, 대체로 원료에서 완제품 단계로 진행될수록 정량 미생물의 오염도가 감소하였으며 미생물마다 감소되는 정도는 달랐다. 전년도 확립된 유전자지문 분석기술을 이용하여 실제 식재료 제조공정단계에서 분리된 바실러스 세레우스 균주를 대상으로 genotyping을 수행한 결과, 원료, 용수 등 단계별 오염 가능성을 추적할 수 있었다. 식재료(신선편의샐러드) 중 바실러스 세레우스의 생산-유통-소비단계별 주요 변수 및 분포에 기반한 확률위험분석모델을 개발하였다. 몬테카를로 시뮬레이션 결과 샐러드의 경우 판매단계에서 증식가능성이 가장 높은 것으로 추정되었으며 새싹제품의 경우도 유사한 경향이었다.
여러 가지 오염원 분석 기술 중 DNA 구조에 근거한 PFGE 법과 PCR 법에 근거한 유전자 분석 방법 rep-PCR(repetitive extragenic palindromic sequence -based PCR analysis) RAPD (Random amplified polymorphic DNA) 에 의한 실험방법을 확립하고 최적화하였으며, 본 연구에서 확립된 미생물 오염원 확립 기술이 위해 미생물의 식재료 유입 경로 추적에 활용할 수 있음을 확인하였다. 식품시료의 오염 여부 분석에서 많은 시간이 소모되는 전통적 배양 방법 보다 신속하게 위해미생물의 존재 가능성을 확인할 수 있는 방법으로 6개의 위해미생물 (S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., E. coli O157:H7, B. cereus와 V. parahaemolyticus) 을 한 개의 PCR 튜브 내에서 동시에 확인할 수 있는 multiplex PCR법을 확립하여 신선편이 채소 및 양념치킨 등의 식품에서 6종 위해미생물의 동시분석 능력을 확인하였다.
3. 환경유래 위해 미생물 제어를 위한 항균제 응용기술 개발
식품 가공 현장에서 살균 소독의 목적으로 반복적으로 항균제를 사용함으로해서, 식품에 오염된 위해미생물은 항균물질에 저항성이 생겨 효과적인 제어가 어렵다. 따라서 본 연구에서는 식품에서 분리된 위해미생물 분리주의 항균물질 감수성 평가를 통하여, 항균물질 저항성 균주를 선발하고, 이들 균주의 성장 특성과 살균 특성을 평가하였다. 본 연구에 사용된 위해미생물 분리주는 신선편이 샐러드와 유기농 채소류 등에서 분리된 것으로 이들 위해미생물 분리주에 대해 항균력을 평가하였다. 유기산등의 다양한 천연 항균물질과 현재 주로 많이 사용되는 차염소산 등 화학적 항균물질에 대한 감수성을 평가한 결과 위해미생물 종류에 따라 항균물질에 대한 감수성이 달랐다. 유기산 저항성 분리주는 차염소산와 같은 화학적 항균물질에 감수성이 높았으며, 차염소산 같은 화학적 살균물질에 저항성을 보인 위해미생물 분리주는 유기산에 대해 높은 감수성을 보여주었다. 특히 신선편의 샐러드와 채소류에 대해 높은 오염도를 보인 Bacillus cereus 분리주의 온도별 성장 kinetic 분석 결과, 모든 B. cereus 항균제 저항균주는 7℃이하의 온도에서 모두 사멸하였으며, 10, 15℃에서는 과산화수소와 acetic acid 저항균주의 생장속도가 차아염소계 저항성 균주보다 빠르게 나타났다. 하지만 25, 30, 35oC에서는 B. cereus 항균제 저항균주 간 생장속도에 대한 차이가 관찰되지 않았다. 선발된 항균물질 저항성 B. cereus 분리주를 성장 단계에 따라 항균물질로 처리한 결과, 동일한 균주라 하더라고 exponential phase에서는 차아염소산나트륨 처리에 저항성이 있었으며, 과산화수소는 stationary phase에서 저항성을 보여주었다. 식품표면에 오염된 위해미생물의 저감화을 위해, 항균물질을 aerosol sanitizer로 처리한 결과 작은 양의 sanitizer로도 미생물 저감이 가능하였으며, 특히 천연 항균물질 중 citric acid와 lactic acid가 항균활성이 높은 것으로 나타났다.
4. 식재료의 미생물 제어를 위한 산업현장형 초고압 기술 개발
유기농 과일 및 채소 제품의 안전품질향상을 위하여 비가열 살균기술인 초고 압기술을 적용하였다. 풋고추, 대파, 양파, 감자, 오이, 당근, 파프리카, 토마토 쥬스에 초고압을 300MPa 에서 5분간 처리한 결과 풋고추, 대파, 파프리카, 오이에서 살균효과가 우수하게 나타났다. 파인애플, 골드 키위, 토마토 쥬스에 초고압 처리를 한 다음 저장하고 품질을 분석한 결과 외관변화는 저장일에 따른 차이가 없는 것으로 나타났다. 마늘은 한국 식생활에서 매우 중요한 비중을 차지하는 양념이지만 마늘의 초기 균수가 높아 (5~7 log cfu/g) 실제 즉석 마늘 제품의 저장성이 좋지 않고 기존의 살균방법 적용시 마늘 자체의 향기성분이 손실되어 신선한 향을 유지할 수 없다. 이러한 문제점을 해결하기 여러 가지 비가열 살균기술 중에서도 초고압 기술에 의한 살균이 가장 생마늘 향을 유지할 수 있는 기술임을 확인하고 조건을 확립하였다.
대표적인 전통발효식품의 하나인 막걸리 제품에 비가열 살균기술인 초고압을 단독 적용하여 제품의 품질은 유지시키면서 저장성을 향상하기 위한 기술을 개발하였다. 초고압 적용 후 막걸리에서 주로 검출되는 Bacillus spp.로 압력 저항성이 높은 포자 상태로 존재하는데 recovery 및 저장 중 여러 가지 조건에서 생화학적․ 형태학적 특성 변화 자료를 확보하였다. 막걸리에서 분리된 B. subtilis의 특성을 파악하고자 영양유무(buffer와 broth), pH (pH 7과 4 -막걸리 pH 4-), adaptation 조건에 따라 초고압에 의한 저감 효과를 살펴보았다. B.subtilis 포자는 영양유무, pH에 관계없이 환경 적응력이 있었고, 초고압에 의한 저감효과도 관찰되지 않았다. B.subtilis 영양세포는 영양유무와 pH 에 따라 non-treatment (0.1 MPa)의 접종된 균수 차이가 관찰되었고, 초고압에 의한 저감 효과도 다르게 나타났다. B.subtilis 영양세포는 저온에서 영양과 pH가 불리한 환경에서 endospore를 형성하여 적응을 하게 되고 초고압에 의한 저감효과는 감소하는 것으로 나타났다. 특히 막걸리에 접종한 경우 pH 4인 buffer와 TSB 보다 적응력이 약한 것으로 관찰되었다. B. subtilis를 접종한 막걸리를 12일간 10과 25℃에서 저장 실험 결과, 내열성이 있으며 균의 증식이 관찰되지 않았다. 결론적으로, 막걸리에서 B. subtilis는 포자상태로 존재하며, 포자는 초고압에 대한 저항력이 큰 것을 알 수 있었다. Proteomics study를 통하여 막걸리 유래 Bacillus subtilis 포자에서 초고압 적용 후 & recovery 과정 후 down regulated & recovered proteins 동정을 통하여 down regulated protein은 Metabolism에 관여하는 단백질 ketol-acideductoisomerase와 malate dehydrogenase, Genetic information processing 그룹에 분류되는 단백질인 elongation factor Tu와 chaperonin GroEL 등이고 Oxidative-stress response에 관여하는 superoxide dismutase와 alkyl hydroperoxide reductase small subunit 등이었다. Microbial community study를 통하여 초고압 처리가 막걸리내 균총 변화를 분석한 결과 Bacteria의 경우 초고압 처리로 Pediococcus의 비율이 감소하였다. 초고압 처리 후 Weissella가 증가하였으며 Clostridium이 증가하는 것으로 나타났다. Fungi의 경우 초고압 처리 전후 모두 Saccharomyces가 우점균이었다. 초고압 처리로 막걸리 제품의 이화학적 특성 분석 및 관능 특성 분석을 실시하여 초고압 처리 막걸리 제품의 산업화를 위한 제품 특성 자료 확보 하였다.
Abstract
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IV. Results and Recommendation
1. Development of application technology for biosensor coupled with sample pretreatment
Detection methods of forborne pathogene have been developed based on magnetic separation of the target pathogene from samples and several sensing systems. The conventional met
IV. Results and Recommendation
1. Development of application technology for biosensor coupled with sample pretreatment
Detection methods of forborne pathogene have been developed based on magnetic separation of the target pathogene from samples and several sensing systems. The conventional methods for detecting the pathogens take 24 – 48 hr. for sample preparation including separation and enrichment and up to 3 days for a final characterization. To promptly detect the pathogene, we was to synthesize and characterize the silica-coated iron magnetic nanoparticles including fluorescence dyes. And the target pathogene was separated and detected using the fluorescence magnetic nanoparticles, simultaneously. Consequently we could fabricate the fluorescence magnetic nanoparticles consisting of Fe3O4 core particles having less 5 nm diameter and SiO2 shell having around 40 nm thickness. The particle emitted the visible around 588 nm and could totally attract to the magnet within 1 min, simultaneously. Using these characters of the particles, we investigated the feasibility of rapid detection and confirmed the particle binding specifically on the target pathogens using TEM and SEM.
The purpose of this study was to develop a highly sensitive fluorescence polarisation immunoassay (FPIA) for the detection of zearalenone (ZEN). The method was optimized and validated to examine the feasibility of performing FPIA using several tracers synthesised from different fluorescence labels and chemicals structurally mimicking ZEN. Optimum extraction conditions were determined, and 4-(aminomethyl) fluorescein-labelled ZEN tracer (ZEN-4AMF) was selected as the tracer. None of the tracers mimicking ZEN gave a favourable response with the monoclonal anti-ZEN antibody. When tested on a corn matrix, the FPIA showed a detection limit of 77 lg kg) 1 within 3 min, excluding extraction time. Recovery of ZEN averaged 101% (intraday) and 109% (interday), and trueness averaged 111%. Ruggedness was satisfactory but crossreactivity with ZEN analogues was relatively high. In addition, sensitive, cost-effective and portable instrument for measuring fluorescence polarisation was also developed. These results suggest that the current FPIA for the detection of ZEN has a potential as an easy and rapid screening tool for ZEN and its analogues in corn.
In this study, we have detected deoxynivalenol(DON) and E, coli O157 using a metal-oxide-semiconductor field-effect-transistor(MOSFET)-based biosensor. The MOSFET-based biosensor is fabricated by a standard complementary metal-oxide-semiconductor(CMOS) process, and the biosensor's electrical characteristics were investigated. The output of the sensor was stabilized by employing a reference electrode that applies a fixed bias to the gate. Au which has a chemical affinity for thiol was used as the gate metal to immobilize a self-assembled monolayer(SAM) made of 16-mercaptohexadecanoic acid(MHDA). The SAM was used to immobilize anti-deoxynivalenol or anti-E, coli O157 antibody. The carboxyl group of the SAM was bound to the anti-deoxynivalenol or anti-E, coli O157 antibody. Anti-deoxynivalenol antibody and deoxynivalenol, and anti-E, coli O157 antibody and E, coli O157 were bound by an antigen-antibody reaction. In this study, it is confirmed that the MOSFET-based biosensor can detect deoxynivalenol and E, coli O157 at concentrations as low as 0.1 μg/ml and 102 cell/ml, respectively. The measurements were performed in phosphate buffered saline(PBS; pH 7.4) solution. To verify the interactionamong the SAM, antibody, and antigen, surface plasmon resonance(SPR) measurements were performed.
In order to produce recombinant single-chain antibody against mycotoxin applicable for rapid detection as a bioreceptor, recombinant E.coli or yeast expression system was established. Those systems provided high expression level and binding affinity of single-chain antibody. Further, scale-up production system using fermentor should be constructed in the near future to use for rapid detection in the field, and trial to shorten development period of recombinant antibody should be followed by using surface display techniques allowed for fast screening of promising clones.
2. Risk characterization of food hazard to develop detection and control technology
This study was performed to assess the microbiological quality and potential health risk of fresh-cut produce and organic vegetables sampled from supermarkets and department stores in Korea. A total of 102 samples comprised three types of fresh-cut produce (sprouts, mixed-vegetables, fruit) and three types of organic vegetables (lettuce, perilla leaf, green pepper). The samples were analyzed for total viable cell counts, coliforms, Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, and Staphylococcus aureus. The microbiological counts of fruit were very low. Sprouts were highly contaminated by total viable cell counts, Enterobacteriaceae, and coliforms, and showed a high incidence level of B. cereus (15.2%). E. coli and S. aureus were detected with low detection rate and Salmonella spp., Vibrio parahaemolyticus, and Listeria monocytogenes were not detected in any of the fresh-cut produce or organic vegetables analyzed.
We also determined the microbial hazards for the processing steps of fresh-cut produce. The prevalence of B. cereus was determined in fresh-cut salads and environmental samples obtained from processing steps and swabs of machinery surfaces of the processing. Microbiological contaminations for the samples of processing steps were generally decreased in the final stage. The genetic similarity of B. cereus isolates obtained from various processing steps was compared to identify the sources of contamination using the repetitive-sequence-based PCR method. The prevalence of B. cereus and molecular typing result suggest possible routes of contamination, such as the transfer of clone contaminated in raw materials to the final products and cross contamination during processing. Foodborne pathogens except B. cereus were not detected in the samples from frech-cut produce processing.
We perform the probabilistic risk assessment (PRA) using distribution functions for major variables, as opposed to deterministic risk assessmen
based on single values such as the mean value of contaminations, because PRA could provide detailed outcomes that suggest more informed risk management options. We developed a PRA model for fresh-cut salads from processing to consumption using the contamination data to suggest the change of level of B. cereus along the production to consumption steps. Based on this result, we suggest the scientific background of management options to insure a good hygienic level of products.
Alternative typing methods for DNA fingerprinting have been tested on molecular techniques, such as repetitive extragenic palindromic sequence-based PCR analysis (Rep-PCR), Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and Pulsed-field gel electrophoresis and, developed and optimized methods to analyse the similarity among contaminants using DNA fingerprinting techniques. In this study, the potential of PFGE, rep-PCR typing for tracing contamination from farm to table was tested. The conventional culture methods for detecting pathogens are time consuming. A single tube multiplex-PCR method has the additional advantages of a lower economic cost and rapid processing. The multiplex PCR method was developed for detection of six of the bacterial strains, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., E. coli O157:H7, B. cereus and V. parahaemolyticus, and has been applied in artificially inoculated fresh cut fruits and vegetable, orange juice, milk, and spicy chicken.
3. The development of antimicrobiol application technology to control of food borne pathogen.
Overuse of antimicrobial substances in food process to reduce food-borne pathogen has led to antimicrobial resistant pathogen. In this study, pathogens isolated from produce and organic vegetable was assessed antimicrobial susceptibility against various antimicrobial substances such as organic acids, alcohols, hypochlorite and so on. Growth kinetic and bactericidal study of antimicrobial-tolerant pathogen isolates were done, too. Antimicrobial susceptibility of food-borne pathogen isolates showed the different result depending on the group of pathogen isolates. Acid-tolerant pathogen isolates were sensitive to hypochlorite. All the antimicrobial-tolerant B. cereus isolates killed all at temperatures below 7℃. Under 10 and 15 ℃, maximum specific growth rate of acid-tolerant and hydrogen peroxide-tolerant B. cereus isolates showed higher than hypochlorite-tolerant B. cereus isolates. Antimicrobial -tolerant B. cereus isolates collected under exponential phase was more resistant to isolates collected under stationary phase. To reduce of contaminated microorganisms to food surfaces, treatment with a small amount of aerosol sanitizer was available as a reduction of microorganisms, especially of natural antimicrobial substances by lactic acid and citric acid showed a high antimicrobial activity.
4. Development of industrial hydrostatic pressure technique to reduce microorganism in Food
To improve safety and quality of organic fruits & vegetables, and Korean traditional liquor, hydrostatic high pressure (HHP) as a nonthermal processing technique was applied. Green pepper, green onion, onion, cucumber, carrot, gold kiwi, and paprika were adapted for HHP treatment. Microbial reduction effect of the HHP treatment (300 MPa for 5 min) were effective in the green pepper, green onion, cucumber, and paprika. HHP treated pineapple, gold kiwi, and tomato juice showed no difference in appearance such as a color depending on the storage day. Garlic is very important seasoning for Korean, but initial microorganism level of grind garlic is very high (5~7 log cfu/g) that cause poor shelf-life. Conventional sterilization methods are not suitable for grind garlic because volatile fl vors lost. HHP treatment is adequate technique to solve this problem and extend shelf-life of grind garlic.
There are two kind of Makgeolli, sterlized (3 log CFU/ml) or non-sterlized (8 log CFU/ml), in the market. In this study HHP was applied to produce shelf-life extended Makleolli. To understand the effect of HHP on B. subtilis isolated from Makgeolli, the survival of B. subtilis after HHP treatment (400 MPa for 5 min) in various substrates-phosphate buffer and tryptone soya broth at pH 7 and 4, and Makgeolli (pH 4)-was evaluated depending on bacterial forms (spores and vegetative cells) and adaptation conditions (25℃ for 3 h, or 10℃ for 24 h). Spores were generally resistant to HHP (<1 log reduction) regardless of conditions. In contrast, vegetative cells were generally susceptible to HHP (up to 3 log reduction) and were more susceptible after 3 h at 25℃ compared to 24 h at 10℃. In vegetative cells inoculated Makgeolli (7 log CFU/ml), the colonies were not detected afte r24 h at 10℃. Consequently, B. subtilis in Makgeolli easily existed as spores and the spores were resistant to HHP. Also, to identify up- and down-regulated and recovered proteins induced by HHP in B. subtilis spore isolated from Makgeolli, protein expression levels were compared in 3 treatment groups of B. subtilis spores samples-the control, HHP treatment (500 MPa for 5 min), and the recovery-by 2-dimensional electrophoresis with mass spectrometry. Common spots in 3 treatment groups chosen by Image Master Platinum 5 were about 220 spots. Among those, the up-and down-regulated proteins in both HHP treatment and there recovery and recovered proteins, which were up-regulated in HHP treatment and then recovered at the level of the control and were down-regulated in HHP treatment and then recovered at the level of the control, were identified. The identified proteins were classified in metabolism, genetic information processing, environmental in formation processing and other unclassified proteins by KEGG data base. The proteins involved glycolysis (gapA, pdhB, pdhD, and fbaA) were up-regulated in HP treatment, and fbaA was recovered in the recovery. And up-regulated murB in both HHP treatment and the recovery involved peptido glycan biosynthesis was observed.
However, heat or oxidative stress response proteins (groEL, catalase, sodA, and ahpC) were down-regulated in B.subtilis spore induced by HHP treatment, and sodA and ahpC were recovered in the recovery. From microbial community study, HHP treated Makgeolli showed lower ratio of Pediococcus, but higher ratio of Weissella and Clostridium.
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