초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 1세부과제 연구결과
가. 올레아난 계열의 사포닌인 인삼 ginsenoside Ro 생합성에 관여하는 사포제닌 합성 유전자의 탐색
○CYP716A52v2유전자의 선발
P. ginseng의 세 유전자(CYP716A47, CYP716A52v2, and CYP716A53v2)는 기내배양 부정근으로 부터 얻은 cDNA 라이버리의 ESTs분석을 통하여 CYP716A 계열로 분류되었다. 최근에 Han et al. (2011, 2012)는 CYP716A 계열의 두 효소 CYP716A47 와 CYP716

Ⅳ. 연구개발결과
1. 1세부과제 연구결과
가. 올레아난 계열의 사포닌인 인삼 ginsenoside Ro 생합성에 관여하는 사포제닌 합성 유전자의 탐색
○CYP716A52v2유전자의 선발
P. ginseng의 세 유전자(CYP716A47, CYP716A52v2, and CYP716A53v2)는 기내배양 부정근으로 부터 얻은 cDNA 라이버리의 ESTs분석을 통하여 CYP716A 계열로 분류되었다. 최근에 Han et al. (2011, 2012)는 CYP716A 계열의 두 효소 CYP716A47 와 CYP716A53v2가 인삼의 사포닌 생합성 과정 중 담마란 타입의 트리터패노이드 생산을 위한 트리터팬 합성효소로써 작용한다고 발표하였다
이전 연구에서 본 연구진은 CYP716A52v2 유전자가 올레아난 타입의 트리터펜 생합성에 관여할 것으로 제안했다(Han et al. 2012). CYP716A52v2의 아미노산 서열은 CYP716A53v2(protopanaxatriol synthase)와 52%의 유사성을 보이고 CYP716A47 (protopanaxadiol synthase)와는 44%가 유사하다. 계통분석 결과 CYP716A52v2가 Bupleurum chinense CYP716A41, Solanum tuberosum CYP716A13, Nicotiana tabacum CYP716A36 같은 그룹을 이루는 것으로 나타났다. CYP716A52v2는 CYP716A12와 73%의 유사성을 공유하고 CYP716A15 와 CYP716A17과는 71% 유사한 것으로 나타났다
○ 이스트에서 PNY1 와 CYP716A52v2의 동시 발현
CYP716A52v2 효소기능을 조사하기위해 PNY1 와CYP716A52v2 두 유전자 모두 yeast에 같이 발현시켰다. PNY1 와 CYP716A52v2 유전자 모두 GAL1 프로모터에 의해 조절되는 Arabidopsis thaliana NADPH-CYP 환원효소가 발현되는 이스트에서 동시 발현시켰다. GC/MS 분석에서 PNY1 와 CYP716A52v2의 동시 발현된 이스트에서 erythrodiol 와 oleanolic acid 표준품과 같은 리텐션 타임인 38.7분과 40.2분에서 2개의 peak가 있음을 확인하였다. 이 두 시그널은 빈 벡터를 지닌 이스트에서는 찾을 수가 없고 PNY1가 단독으로 발현된 이스트에서는 36.45분에 beta–amyrin을 뜻하는 peak가 나타났다. 40.2분 시그널의 MS파편 양식은 oleanolic acid과 똑같고, 38.7분 시그널의 MS 파편 양식은 erythrodiol과 같았다. 이 결과들은 CYP716A52v2가 명백히 beta–amyrin를 oleanolic acid로 전환하는 beta–amyrin 28-oxidase라는 것을 가리킨다.
○ 형질전환 인삼에서 CYP716A52v2의 기능.
CYP716A52v2 유전자의 역할을 분석하기 위해서 CYP716A52v2가 과발현 되거나 억제 (RNAi)된 형질전환 인삼을 Agrobacterium tumefaciens을 이용하여 만들었다. 현질전환 라인의 유도와 증식은 Han et al. (2006)의 프로토콜에 따라 하였다. 7개의 형질전환 라인(over expression 과 RNAi 각각)은 선발 마커 유전자의 도입 전사 분석을 위해 RT-PCR분석과 qRT-PCR을 통하여 확인하였다.
HPLC 분석 결과, 6개의 과발현 line에서의 ginsenoside Ro 함량은 형질전환되지 않은 lines 과 비교하였을 때 분명하게 증가되었다. 대조적으로, 형질전환 line 1에서는 CYP716A52v2 의 전사량이 증가하지 않았다. 형질전환 되지 않은 라인과 비교하였을 때 모든 RNAi lines에서는 ginsenoside Ro의 함량이 분명히 감소되었다. Fig. 4C-D의 크로마토그램 개요를 보면 오직 Ro만이 모든 형질전환 line에서 변화하였다. 하지만 다른 dammarene-타입ginsenosides (Rg1, Re, Rf, Rc, Rd, Rb1, and Rb2)의 발현 수준은 형질전환되지 않은 뿌리의 것과 비슷하였다. 이 결과는 CYP716A52v2 유전자가 인삼에서 ginsenoside Ro 생합성에 핵심적인 역할을 한다는 증거이다. 인삼에서 CYP716A52v2 과발현 line은 약리적으로 중요한 인삼의 ginsenoside Ro생산을 향상시키는데 유용할 것이다
나. 담배 배양세포에서 인삼 DD의 생산
○ 형질전환 담배의 생산
PgDDS (AB122080) 과발현 형질전환 담배 식물체를 개발하였다. RT-PCR을 통해 각기 다른 식물체로부터 얻은 27개의 형질전환 라인 중 PgDDS의 발현량이 높은 3개의 라인을 선발하였다. 담배 게놈에 들어간 HPT와 PgDDS 유전자는 genomic DNA를 PCR하여 확인하였다. 모든 3개의 형질전환 라인에는 HPT과 PgDDS 유전자 PCR product가 존재했다. 그러나 비형질전환 담배에서는 이러한 PCR 반응이 나타나지 않았다.
형질전환체와 비형질전환체의 잎을 가지고 RT-PCR 분석으로 PgDDS 전사를 확인하였다. 3개의 형질전환 라인은 분명한 PgDDS mRNA 축적을 나타냈다. 특히 T14 라인은 T7, T9 라인에 비해 PgDDS의 전사가 강하게 일어났다. 비형질전환 담배 잎에서는 PgDDS mRNA의 PCR 반응이 없었다. 형질전환식물의 부위(꽃봉오리, 잎, 잎자루 ,뿌리)별 PgDDS mRNA 축적을 RT-PCR을 통해 확인하였다. PgDDS mRNA는 담배의 모든 기관에 축적되었지만 PgDDS mRNA 축적량은 잎에서 가장 높았으며 잎>뿌리>줄기>꽃봉오리 순서로 축적량이 많았다.
○ 형질전환 담배의 GC/MS 분석
형질전환 담배에서 dammarenediol-II의 함량을 분석하기 위하여 뿌리 추출물을 GC/MS를 사용하여 분석하였다. 모든 형질전환 라인 (T7, T9, T14)는 보존시간 37.6분에서 새로운 물질(dammarenediol-II)을 나타냈다. MS spectra로 보았을 때 dammarenediol-II 생산물의 fraction pattern이 표준품 dammarenediol-II의 fraction 패턴과 동일하였다. 형질전환 담배에서 dammarenediol-II의 축적은 기관 특이적(뿌리>줄기>잎>꽃봉오리)으로 일어났다. 식물 뿌리에서 dammarenediol-II의 양은 다른 두 개 라인(T7, T9)에 비교하였을 때 적어도 3배(157.8 μg g^-1DW) 증가하였다. 형질전환 라인인 T7과 T9 식물체 뿌리의 dammarenediol-II 축적량은 각각 46.8과 32.0 μg g^-1DW 이었다. 비형질전환 식물에서 는 dammarenediol-II의 흔적이 감지되지 않았다.
○ 형질전환 라인을 세포현탁배양하여 dammarenediol-II 생산.
세포현탁배양으로 식물재료를 생산하는 것은 자연적인 한계(계절, 기후, 지질적 환경)에서 자유롭기 때문에 더 유리하다. 세포현탁배양을 하기위해 T14 라인의 뿌리 조각으로부터 캘러스를 유도하였고, 그 캘러스와 250 ml의 액체배지를 Erlenmyer 플라스크에서 배양하며 3주 간격으로 계대하였다. Floating cell suspension으로 When free floating cell suspension was established, five gram of packed cell volume was inoculated in 1000 ml flask containing 400 ml MS liquid medium. 세포 생장과 dammarenediol-II의 생산량은 21일 배양기간동안 3일 간격으로 측정되었다. 생중량은 배양기간 중 9 ~ 18일에서 활발하게 증가하였다. 3주 배양 후 dammarenediol-II의 생산량은 건중량 573 μg g^-1 에 달하였고 이것은 T14 라인 형질전환 식물체의 뿌리 추출물의 것보다 3.6배 높은 수치이다. Dammarenediol-II 의 총 생산량은 5.2 mgl-1에 달하였다. Dammarenediol-II의 생산량은 세포생장이 활발할 때 약간 낮은 수치를 나타냈다. T14 라인의 세포현탁배양 시phytosterol 함량(β-sitosterol, campesterol, and stigmasterol)은 비형질전환 컨트롤 세포에 비교하여 매우 감소하였다
2. 1협동과제 연구결과
가. 연구수행 내용
(1) 최종목표
○ 유용유전자의 최적화된 발현을 통한 고기능성 형질전환체 생산
(2) 세부목표
○ 유용유전자군 선발 및 발현시스템 확인
○ 이소프레노이드 생합성 관련 유용유전자 분자수준에서의 특성 규명
○ 생합성 유전자 프로모터 시퀀스 확보 및 분석
○ 생합성 유전자 발현을 통한 식물발달 및 이차대사산물 변화 추이검증
○ 병충해 관련 유전자의 기능분석을 통한 이차대사산물과의 연계성 획득
나. 연구수행 내용 및 방법
(1) 연구수행 내용
○ 인삼의 사포닌 생합성 단계에 관여하는 대표적 유전자로 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), squalene synthase (SQS),squalene epoxidase (SQE), beta-amyrin synthase (bAS), 그리고 dammarenediol I I synthase (DDS)등의 대표적인 생합성 유전자가 보고. 본 연구를 수행하는 동안 포괄적으로 위의 전체유전자의 염기서열을 확보하는 동시에 각 유전자 하나, 하나씩 그 기능을 유전, 세포생물, 생리,생화학적 수준에서 증밀 검증하여 인지도 높은 학술지에 발표. 이는 원초적 기능 탐색을 통한 원천 기술 습득을 통한 산업화의 토대가 될 수 있음.
○ 이 중 몇몇 유전자를 생명공학 기술을 활용해 인삼식물체에 RNAi (RNA interference)를 유기해서 대표적인 인삼 사포닌의 함량에 변화가 있음을 보여준다거나, 과발현체를 유기하고자하는데 많은 연구가 이루어져왔다. 하지만, 단순 생합성에 관여하는 유전자 조작만으로는 괄목할만한 성과를 보여주지 못했으며, 가장 큰 문제점은 안정된 형질전환체 선발에 어려움이 많아서 부정근 유기에 국한된 연구 결과들 임.
○ 이러한 문제점을 근본적으로 해결하고자, 본 연구에서는 각 인삼에서 밝혀진 생합성 관련유전자들의 세포소기관내의 발현위치를 파악하고, 각 유전자의 조절양상을 파악하고자 프로모터분석 및 인삼 이외의 모델작물의 대사경로를 분석 Dammarane 기를 만드는 결정적인 유전자조절을 통해서 대표적인 모델작물인 벼 및 가능한 콩과 작물이나 토마토 등 형질전환이 가능한 유용작물에서 사포닌 생산의 가능성을 타진하고자 함.
○ 프로모터 염기서열을 genomic DNA walking 및 서울대 인삼유전체 팀의 협력으로 확보해서 promoter::GUS 형질전환체를 아그로박테리아를 활용 모델식물인 애기장대 또는 인삼 부정근에 유기, 그 발현 양상을 파악하고자 한다. 대표적인 엘리시터인 MeJA를 비롯 (a)biotic stress [JA, ABA, Arachidonic acid (fungal elicitor), SA 등]에 대한 감응정도를 확인하고자 다양한 농도별 처리수행.
○ 대표적인 생합성 유전자의 (a)biotic stress에 대한 발현양상을 파악하고자, ABA 0.1 mM, H2O2 10 mM, JA 0.2 mM, SA 5 mM, 4C, NaCl 100 mM 처리한 인삼 유묘를 확보 각 유전자의 전사량을 RT-PCR 또는 qRT-PCR를 통해 확인한다.
○ 생합성 유전자의 식물 생장 및 발육에 미치는 영향을 조사하고 유전학적인 기능을 분석하고자 대표 모델식물인 애기장대에서 knock-out 돌연변이체를 분석하고, 이 돌연변이체를 background로 각 생합성 유전자가 다시 애기장대 유전자의 기능을 회복시키는지 조사-complementation test를 한다.
○ 인삼 사포닌 생합성 관련 유전자는 mRNA 수준뿐만이 아니고, 단백질 수준에서도 다양하게 조절 받을 수 있는 여러 연구사례를 토대로 각 대표 생합성 유전자의 단백질을 분리 또는 추출 정제하여 그 활성을 확인한다. 이를 통해 생화학적 조절기작 이해에 활용한다.
○ 생합성 유전자의 프로모터 조절기작 및 몇몇 생합성 관련 대표 유전자의 생리학적인 연구결과는 광(light)과 밀접하게 연관되어 조절되고 있음을 발견할 수 있다. 이에 본 연구에서는 다양한 광처리에 의한 생합성 관련 유전자의 knock-out 및 과발현체에서 분석 지표가 될 수있는 상배축 길이 및 자엽의 발달정도를 분석하고자 한다
○ 생합성 관련 유전자의 프로모터 분석을 통한 최소 염기서열을 확보 key 조절유전자를 스크리닝하기 위하여 yeast-one hybrid를 활용한다.
○ 진세노사이드의 기본 골격이 형성된 후 Glycosyltransfease에 의해 다양한 종류의 당이 비당체 진세노사이드에 결합하면서 다양한 종류의 사포닌이 형성이 된다. 또한 Cytochrome P450 유전자에 의해 PPD형의 진세노사이드가 PPT형의 진세노사이드로 변화될 수 있는 핵심 유전자라 할 수 있다. 본 연구는 이러한 사포닌 골격 다양화에 기여하는 유전자 군에 속한 유전자를 선발 식물 세포내의 세포생물학적, 분자생리학적, 유전학적 특성을 규명 식물시스템과 효모나 박테리아등을 활용 특정 사포닌의 다양화에 기여하는지 밝히고자 함.
(2) 연구수행 방법
사포닌 생합성 관련 유전자 클로닝 완성 및 생리, 유전, 분자생물학, 생화학적 인 방법을 통한 기능분석을 위해 터페노이트 생합성 관련유전자 (Prenyltransferase, HMGR, DDS, PNY, SS,SE, P 450, Glycosyltransferase)를 천풍 및 연풍 등의 인삼 품종을 이용 클로닝 한다. Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pMP90)를 활용 애기장대의 경우 floral dipping 법에 의한 형질전환체 개발 및 인삼에서 callus 유기를 통한 부정근 유기를 통한 세포소기관 위치 확인. 벼, 애기장대, 인삼에서의 기능분석 및 대사산물 변환을 확인. 각 유전자간 homologs 존재 가능성이 높기 때문에 최대 homolog를 확보하도록 PCR 및 genomic Sourhern, 인삼 유전체를 활용한다.
○ 형광단백질 (GFP, mRFP, YFP, CFP)이 tagging된 유전자 construct의 형질전환체로부터 subcellular localization을 공초점 현미경으로 확인하고, 그 정확한 위치 규명을 위해서 현재 보유되어있는 각 endosomal makers와 상호 교배를 통한 검증.
○ 현재 세포내 organelle 마커로 Golgi (ST-GFP, GONST1-YFP), ER (BiP-GFP), PVC (YFP-BP-80, VSR-HA), vacuole (AALP-GFP), F-actin (talin-GFP), PM (ATPase-GFP, AHA-GFP) 등의 plasmid나 형질전환체가 보유된 상태임 . Endosome 마커로는 SNX1-GFP, RabF1-GFP (ARA6-GFP), GFP-RabF2b (ARA7-GFP), ADL1a-GDP (dynamin)등의 라인이 확보된 상태. Molecular probe로는 ER-tracker, 나 Golgi-tracker는 상업적으로 시판중이라 구매해 사용.
○ 대사산물 변화에 따른 식물체의 생장 및 발달 양상 파악
유용유전자의 기능을 분석하기 위한 방법으론 pCAMBIA 벡터와 같은 바이너리 벡터를 활용
과발현체 및 pART27 벡터를 활용 RNAi를 유기해 유전자의 기능을 활성화시키거나 기능을 없애거나 줄여서 그 기능을 파악.
인삼에서 발견한 생합성 관련 유용유전자의 기능이 대표적인 모델 식물인 애기장대에서의 상동성을 보이는 유전자의 기능과 유사한지 파악하고자, 대표적으로 쉽게 접목할 수 있는 애기장대내의 SALK T-DNA insertion 돌연변이체를 분양받아서 그 기능이 서로 functional homolog 지 분석-이는 모델식물과 다년생 식물간의 특성을 파악하는 부분에도 도움이 되리라 사료됨.
각 유용한 이소프레노이드 및 트리터펜 생합성 에 관련된 유전자의 프로모터 염기서열을 Genomic DNA walking 방법을 통해 확보 promoter::GUS fusion construct를 구축 인삼 및 모델식물에서 발현 그 발현 도메인을 분석. 확보된 각 유전자의 프로모터 염기서열을 이용 프로모터에 바인딩 할 가능성이 있는 유전자를 Yeast One-Hybrid 및 Chromatin immunoprecipitation 법을 활용 screening. 이는 각 생합성 유전자의 upstream 유전자 확보를 통한 조절 기작 이해해 활용.
Yeast Two-Hybrid 법을 이용 각 생합성 유전자의 topology를 분석 한 후 protein-protein 물리적 결합하는 유전자의 screening. 이와 관련된 연구는 거의 전무, 전반적인 생합성 유전자의 조절 기작 이해해 지대한 도움을 미칠 것으로 판단.
식물에서의 이소프레노이드는 MEP 및 MVA 생합성 과정을 거쳐 형성이 되는데, 각 생합성 경로가 어떻게 진세노사이드 함량과 연관성을 보이는 지에 대한 cross-talk 기작 규명을 위해 MEP 생합성 단계에 관여하는 유전자 또한 분석에 들어가되 일차년도엔 두 생합성 경로를 보다 쉽게 이해할 수 있는 inhibitor (Mevinolin, Fosmidomycin)등을 직접 인삼의 부정근 및 유기된 다양한 형질전환체의 분석에 활용 전반적인 생합성 경로 이해를 구축.
인삼의 사포닌 생합성 생성은 방어기작의 하나로, 사포닌 생합성관련 유전자 분석에 있어, 여러 가지 스트레스나 방어기작에 관련된 시스템 확인.
○ 대표적인 비생물(염, 광, ABA, SA 등) 및 생물 (곰팡이, 세균)등에 의한 저항성을 대조구와 비교 여러 기준이 되는 reference 유전자와의 발현 양상을 qRT-PCR이나, 단백질 수준에서 검증.
대사산물 및 인삼 사포닌 확인은 LC/MS 및 HPLC 활용하여 검증함.
다. 연구결과
(1) 사포닌 생합성 핵심유전자의 기능분석
인삼 사포닌의 생합성은 크게 MVA (세포질내) 및 MEP (엽록소내) 생합성과정을 따른다고 볼 수 있는데, MVA 생합성과정에 대한 연구가 미비하게나마 보고가 되어왔다. 하지만, 스테롤 및 트리터펜의 작용을 동시 조절할 수 있을 것으로 사료되는 첫 rate-limiting 단계에 있는 효소인 HMG Co-A 에 대한 연구는 전무하다. 이에 본 연구팀은 다른 연구결과에 비해 가장 심혈을 기울여 HMG Co-A에 대해 유전학적, 생화학적, 분자생물학적 다양한 방법의 연구에 의해 이 유전자가 광과 밀접한 관련성을 가지면서 결과적으로 사포닌의 생산량도 조절한다는 여러 증거를 확보, 국제학회에 구두로 발표 하였으며, 최종적으로 식물학 저명 학술지인 Plant Physiology에 2014년 발표하였음.
인삼 HMGR1 (PgHMGR1)은 애기장대의 AtHMGR1의 기능을 보완하는 functional homolog 로 애기장대와 유사하게 세포내에서 ER에 위치하는 것을 밝혔으며, 부가적으로 동물시스템에서와 유사하게 peroxisome 마커와도 같이 merge되는 현상을 분석하였음
DNA walking에 의해 PgHMGR1 유전자의 프로모터를 확보하여, ProHMGR1::GUS 형질전환체를 유기 후 그 발현양상을 파악한 결과 Dark에 의해 etiolated 된 경우 hypocotyl에 특이적인 발현을 보임을 확인하였음. 이는 PgHMGRox (과다발현체)의 경우 hypocotyl gravitropism의 기능이 야생형에 비해 다소 상실된 표현형을 잘 설명해준다.
DNA walking 및 서울대 인삼유전체 팀의 도움으로 그 밖의 인산 생합성 관련 핵심 유전자의 프로모터 염기서열을 확보하여, 분석한 결과 대부분 광에의해 조절되고 있음을 확인. 또한 프로모터 분석을 통해 각 대표 유전자의 프로모터에 G-box motif가 있음을 확인.
PgHMGR1 및 PgDDS 유전자 우선으로 프로모터 deletion assay를 한 후 최소 발현을 보이는 부분을 확보하였음.
HMGR1의 기능을 inhibitor처리에 의해 억제시켰을 때 전체 진세노사이드의 함량이 줄어들었으며, Dark 처리 시 에도 전반적인 인삼에서 진세노사이드의 함량이 증가함을 관찰하였음 . 이는 HMGR의 기능에 의해 인삼 사포닌의 생합성에도 영향을 미침을 반증하는 사례라 할 수 있다
인삼유래 두 HMGR 유전자는 대부분의 모든 기관에서 발현을 보이는 것으로 파악이 되며, 인삼유묘 및 3,6년근을 비교했을 때 주로 뿌리에서 발현이 많이 되는 양상을 분석할수 있었다. 인삼 유묘기 때 특이적으로 줄기 대신 잎자루 (petiole)이 형성이 되는데, 이 시기엔 뿌리에서의 발현양상은 두 HMGR isoform 간 차이가 없으나, HMGR1의 경우 잎자루에서 확연히 많은 양의 전사가 이루어짐을 확인할 수 있었다. 그 후 년 수가 증가함에 따라 HMGR1의 경우는 뿌리에서 더 이상의 발현양상에 차이가 없었으나, HMGR2의 경우 3년에서 6년근으로 갈수록 그 발현이 높아짐을 보였다. 이는 두 유전자간 상보적인 기능도 가지고 있으며, 각 부위별 특이적인 기능을 함께 가질 수 있음을 시사한다. HMGR2 유전자의 경우는 추후 인삼 근령 확인에도 응용 될 수 있음을 보인다.
GUS발현 양상을 보면 두 유전자가 애기장대에서 전반적으로 모든 기관에서 ubiquitous한 발현을 보임을 보여주며 특히 뿌리의 통도조직에서 발현이 높음을 보여준다. 이는 인삼 부정근에 형질전환 했을 때와 유사한 결과로 이 유전자의 발현 부위와 인삼 사포닌 생합성 부위가 상충될 수 있음을 보여준다.
Mevinolin은 HMG Co-A의 binding site에 competitively 억제하는 inhibitor로 HMGR 활성에 따른 최종 대사산물의 변이량 추이 검정에 있어서 유용하게 활용될 수가 있다. 일정 기간 동안 배양된 인삼 부정근에 mevinolin (Mev)을 하루 처리했을 때 대조구에 비해 34% 감소시키는 것을 확인하였으며, 이는 처리 시간이 증가될수록 다시 평형을 유지하는 성향을 관찰하였다. HMGR 유전자 발현량도 처음엔 스트레스효과 일수도 있겠지만, 감소하였다가 다시 회복되는 것을 관찰하였다. HMGR2 유전자의 경우 HMGR1과는 다른 발현 패턴을 보였는데, 이는 두 유전자간 서로 다른 post-transcriptional 수준에서 조절을 받고 있음을 보여준다. 주목할 점은 진세노사이드의 함량은 유전자 발현수준보다는 HMGR 단백질 활성과 밀접한 관련이 있음을 볼 수 있었음.
대표적인 엘리시터로 알려져 있는 MeJA의 경우 원래 부정근의 함량보다 인삼 사포닌 함량을 1.75배 증가시켰으며 이는 유전자의 전사량 중 HMGR1이 중요한 역할을 함을 보여준다.
PromoterPgHMGR1::GUS 라인에서 HMGR1이 광/암 의존적인 발현양상을 보임을 확인하였다. 이는 진세노사이드의 함량이 암 처리에 영향을 받을 수도 있겠다는 가능성을 제시한다. 수경재배로 자란 인삼에 2-3일 암 처리 했을 때, 전체 주요 진세노사이드의 함량이 증가함을 확인할 수 있었으며, 이는 HMGR의 활성이 증가와 상호관련이 있음을 볼 수 있었다. 반면 HMGR 유전자의 발현은 줄어드는 것과도 연관이 있음을 확인 할 수 있었다. HMGR이 post-transcriptional/translationally 조절된다는 그동안의 사례를 들어 다소 복잡한 조절기작을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다.
HMGR 유전자의 식물체내 과발현 시켰을 때 결과적으로 대사산물이 증가하는지 확인하기 위해 같은 브랜치(branch)에 존재하는 sterol 과 triterpene함량을 조사하였다. 대표적인 sterol 및 triterpene인 α-/β-amyrin 함량은 애기장대에서 과발현체를 대상으로 분석하였을 때, rosette leaf 및 inflorescence에서 모두 증가함을 볼 수 있었음
인삼 사포닌중 대표 진세노사이드 함량증가는 인삼 부정근 형질전환체를 대상으로 분석하였으며, 분석한 4 라인 모두에서 전반적으로 상승함을 볼 수 있었다
PgHMGR1ox의 또 다른 표현형은 잎의 색깔이 연해지거나 거의 없는 albino를 보인다는 점인데, 이는 세포내의 squalene양이 많아 져서 나타나는 발육상의 억제현상으로 보인다.
대표적인 엘리시터인 MeJA를 비롯(a)biotic stress [JA, ABA, Arachidonic acid (fungal elicitor), SA 등]에 대한 감응정도를 확인하고자 다양한 농도별 처리 수행하여 각유전자의 전사량 변이를 검증하였음 (옆). 이결과는 각 생합성 유전자가 어느 호르몬pathway와 좀더 밀접관 연관성이 있는지를 알 수 있으며, AA처리의 경우 곰팡이 엘리시터로 곰팡이 저항성 관련 연구를 시도할수 있는 토대를 제시.
전체 인삼 유전체를 분석 후 GT 와 Cyp P450 와 상동성을 보이는 EST를 확보 후 각 2 가지 유전자의 full-lenght 시퀀스를 확보 애기장대 형질전환체를 완성 분석중이며, 인삼에서도 형질전환체를 유기 및 증식 중.
PgGT 유전자의 경우 여러 비생물 스트레스인 MJ, SA, ABA, JA에의해 유전자 발현이 증가하였으며, PgGT2는 ER에 위치함을 확인하였음. 여러 PgGTox 라인이 야생형에 비해 내염성과 내서성에 대한 저항성을 확인중이며, 인삼에서 유기한 부정근 형질전환체는 전체 진세노사이드의 함량을 측정할 예정임.
PgCYP76C 유전자의 경우 과발현체가 Pseudomonas syringe에 저항성이 높음을 확인하였으며, MJ에 반응하고 이소프레노이드 생합성 산물인 Squalene에 의해 전사체가 증가함을 확인. 식물의 생장에도 영향이 있어 전체 발육이 저하됨을 확인하였음.
PgCYP76C유전자를 애기장대에 과발현시켰을 경우 전체적인 식물의 생장에도 영향을 미침을 발견 대사산물의 영향에 의해서인지 혹은 발육에 직접적 관련이 있는지에 대해서 검증 중. PgCYP71D184 과발현체의 경우는 염에 대한 저항성이 높았음. 차 후 native protein을 분리 인삼 사포닌을 기질로 사용 다양한 진세노사이드의 변화에 관여하는지 검증할 예정임.
(2) 인삼 사포닌 대사와 밀접한 연관이 있는 병충해 저항성 유용유전자의 기능분석
가. 연구의 개요 및 필요성
인삼의 사포닌 (진세노사이드)은 여러 생물⦁비생물 스트레스로부터 식물체를 보호하기위해 생산되는 이차대사산물로, 인체에는 다양한 의학적 효능을 보이고 있는 유용한 물질이다. 따라서 진세노사이드의 함량 조절 기작을 이해하기 위해선 생물⦁비생물 스트레스 저항성 유전자에 대한 기능분석이 전체적인 특정 대사산물의 양을 조절하고, 저항성을 키워 식물 전체의 mass 함량을 증가시키는 목적을 달성하기 위해 필요한 사항이다.
식물은 끊임없는 생물학적, 화학적 환경 스트레스와 같은 위험에 노출되어 살아야 하지만, 동물세포에서 보유하고 있는 adaptive immune system를 가지고 있지 않다. 따라서 식물은 다양한 환경 스트레스로부터 자신을 보호하기 위해 외부 신호를 인지한 후에 자가 시스템을 발동시켜 적절한 생리적인 변화를 일으켜서 적응해 간다.
분자 수준에서 외부 자극을 인지하면 다양한 방어기작이 복잡한 신호전달체계를 통하여 활성화된다. 이 중 가장 주목할 만한 식물 방어기작의 하나가 pathogenesis-related proteins (PRs)의 발현이라고 할 수 있다. PR 단백질은 현재까지 17 families로 구별되는데, 이는 단백질의 구조적, 기능적 차이에 근간을 둔다. PR1에서 PR4, PR9, 그리고 PR11를 포함하는 여섯 개의 RP단백질군은 β-1,3-glucanases, chitinases, 그리고 peroxidase등의 단백질을 포함한다. 다른 PR단백질인 PR6, PR12, PR13, PR14, 그리고 PR15은 proteinase inhibitors, defensins, thionins,lipid-transfer 단백질 그리고 oxalate oxidase로 대변된다.
본 연구 수행을 위해서 대표적으로 인삼에서 PR10 유전자와 γ-thionin이란 유전자의 기능을 밝히고자 미생물 발현에 앞서 식물시스템을 이용하였다
나. 연구결과
인삼내의 총 3개의 PR10 유전자에 대한 동정과 PgPR10-1 과 PgPR10-2 유전자의 각 인삼기관별 특이적인 발현 양상을 조사하였으며, 각 상동유전자간 특정 생물⦁비생물 스트레스에 대하 감응정도를 qRT-PCR로 확인하였으며, PgPR10-2 유전자를 애기장대에 과다발현 시킨형질전환체를 유기 하였을 시, 대조구보다 전반적인 생육이 왕성한 형태를 보였으며 NaCl에 대해서도 저항성이 강한 양상을 관찰하였음 (Lee et al, 2012 Mol Biol Rep).
PgPR10 유전자는 총 3개의 homolog가 있음을 확인하였으며 각 PgPR10-1, PgPR10-2에 대한 기능분석 후 논문 게제 완료 (Lee et al., MBR 2012, Lee et al., 2012 Gene). Lee et al.,2012 Gene 논문에선 각 상동유전자간 물리적인 결합을 하고 있음을 밝히고자 Yeast-2-hybrid 방법을 통해 분석함.
alpha/beta-thionins과 함께 gamma-thionin은 식물의 방어기작에 관련된 Defensin 유전자로 분류가 된다. 본 연구는 인삼에서 처음으로 γ-thionin을 분리하여 각종 생물⦁비생물 스트레스에 저항성을 보이는 특성을 검증하였으며 , 애기장대에 형광단백질을 tagging하여 발현시켜봤을 때, 세포 밖으로 secretion이 되는 양상을 발견하였다. 이는 직적접인 외부스트레스로부터 식물을 보호하는데, 관여돼 있을 가능성을 높인다 (Lee et al., 2011 PMPP).
공초점현미경을 통해 PR10은 cytosol (Lee et al., 2012 Gene)에 γ-thionin은 extracellular space에 위치하고 있는 것으로 분석 (Lee et al., 2011 PMPP).
Calmodulin 유전자에 의한 항산화관련 방어기작에 관련된 유전자들의 상호관련성에 관해 Mol. Biol. Rep. (SCI)에 발표 (Parvin et al., 2012 Russian Journal of Plant Physiology). Potassium Nitrate처리가 여러 생합성관련 유전자 및 항산화관련 유전자의 발현량 증/감 등에 어떤 연관성이 있는지에 대한 내용으로 Russian Journal of Plant Physiology에 발표하였음(Devi et al., 2012 Russian Journal of Plant Physiology).
3. 2 협동과제 연구 결과
가. Probiotic으로부터 GT유전자 선발 및 클로닝
(1) CGTase에 의한 사포닌 생합성
CGTase는 크게 세가지 전달효소 역할을 하고 있는데 먼저 스타치를 가수분해하여 덱스트린을 생성하며 가수분해와 동시에 환상화 반응이 일어나 싸이클로덱스트린을 생성하기도 한다. CGTase에 의해 생성된 싸이클로 덱스트린은 내측은 소수성, 외측은 친수성으로 휘발성 물질의 안정화, 산화 방지 등 다양한 목적에 이용되며 이와 같은 포접 기능으로 쓴맛을 잡아주는 역할을 하여 홍삼음료의 첨가물로도 이용되고 있다. 싸이클로덱스트린과 덱스트린에 축합반응을 일으켜 새로운 공유결합을 생성하는 커플링 반응을 하기도 한다. 두개의 크기가 다른 올리고당의 불균화 반응에 의해 당이 옮겨지기도 한다.
본 실험결과 CGTase는 중성 pH에서 활성이 가장 높았으며, 60도에서 활성이 높았으며 고온(80도)이상의 고온에서도 그 활성이 나타나는 특성을 나타내었다.
최종적으로 ginsenoside Rh1, Ck, PPT, PPD, Rh2을 이용하여 CGTase에 의해 반응했을 때 다양한 형태의ginsenoside가 형성됨을 알수 있었다.
(2) α-glucosidase을 이용한 신규사포닌 합성
LC/MS를 통해 생성된 생성물의 존재와 반응생성물의 profile를 확인하였다.
Rg1으로부터 생성된 위 분리된 물질의 Mass값을 통해 glucose가 몇 개 결합되어 있는지 확일 할 수 있었다.
F1으로부터 생성된 위 분리된 물질의 Mass값을 통해 glucose가 몇 개 결합되어 있는지 확일할 수 있었다.
LC/MS를 통해 생성된 생성물의 존재와 반응생성물의 profile를 확인하였다
Rh1으로부터 생성된 위 분리된 물질의 Mass값을 통해 glucose가 몇 개 결합되어 있는지 확일 할 수 있었다.
나. bgp1domain별 사포닌 전환 양상 조사
강한 beta glucosidase 활성을 나타내는 Microbacterium esteraromaticum선발5종의 서로 다른 bgp유전자를 클로닝하였으며 각각 사포닌 전한 양식이 다르며 같은 기질로 반응해도 효소에 반응 산물이 달라 목적에 따라 원하는 단백질을 이용할 수 있다.
bgp1의 domain별 유전자를 클로닝한 후 삽입된 유전자를 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
다. 케톤화를 통한 새로운 신규 사포닌을 생산
본 유산균을 분리 동정한 결과 lactobacillus brevis 로 동정되었고 이 조효소를 이용하여 ginsenoside CK, F1에 적용한 결과 새로이 keton화된 ginsenoside를 분리 정제할 수 있었다. minor ginsenoside 중 keton화가 형성되는 것은 주로 CK와 F1이 반응하였다. 이들 신규 사포닌은 세포독성이 현저히 낮았고 미백활성이 있는 것으로 나타났다.
본 실험결과 Lactobacillus brevis로부터 hydroxysteroid dehydrogenase gene (3β-HSD1, 3β-HSD2) 클로닝하였고 정제된 효소에 의해 사포닌의 3번 위치에 keton화가되어 새로운 신규사포닌을 생합성할 수 있었고 본 사포닌은 미백활성과 주름 개선 활성이 전환되기 전 물질보다 훨씬 향상됨을 알 수 있었다
라. PEG, chitosan-ginsenoside 합성 항암 활성 검증
pH에따라 PEG+Ck가 해리되는 정도를 산성조건에서 CK가 증가되는 정도를 HPLC롤 통해 분석하였다.
○ DHA-PPT합성
NMR를 통해 합성된 반응 생성물의 구조를 조사하였다.
본 실험을 위한 기초 연구로서 인삼 사포닌 DB를 구축하였다 현재 in house library형식으로 공개되지 않았지만 좀 더 기초자료를 보강하여 인삼 사포닌 DB을 구축할 것이다. 본 DB를 통해 각각의 사포닌의 2차 구조와 ADMET를 통한 pharmacokinetic activity를 포함한 그 기능과 관련된 문헌 검색이 완료될 전망이다
가장 간단한 활성 실험 중 tyrosinase inhibition assay를 통해 항산화활성을 조사한 결과 기존에 알려진 Adenosine과 대등한 활성을 보이는 것으로 나타났다. 본 실험결과 백삼에서 분리된 Re, Rg1등으로부터 F1을 미생물효소로 전환하고 이를 다시 keton화 반응을 통해 세포독성이 저하된 신규 사포닌 대량 생산이 가능할 것이다.
4. 3협동 과제 연구 결과
가. Ginsenoside 생산을 위한 S. cereivisiae engineering
(1) competition pathway regulation
S. cerevisiae 내에서 중간 대사물질인 2,3-Oxidosqualene의 경우 S. cerevisiae cell내에서 Ergosterol을 합성하는데 있어서도 필요한 중간물질이다. 평소의 S. cerevisiae의 경우 만들어진 2,3-oxidosqualene이 전부 Ergosterol 합성되는데 이용되기 때문에 Ginsensoide를 이용하는데 필요한 물질이 남지 않는 문제점이 있어, 2,3-Oxidosqualene 다음 물질인 Lanosterol을 만드는 유전자인 Lanosterol synthase (ERG7) 유전자의 down regulation이 필요하다.
ERG7 유전자의 down regulation을 위하여 Methionine에 의해서 suppression 되는 MET3 promoter를 이용하여 cassette을 만들었고, 이를 wild type ERG7 유전자 자리에 integration하여 MET3 promoter에 의해서 regulation되도록 engineering 하였다. 그뒤, HPLC를 이용하여 wild type S. cerevisiae와 engineered S. cerevsiaie의 2,3-Oxidosqualene의 축적을 비교하였을시, wild type의 경우 축적된 물질이 없는데 반해, engineered strain의 경우 2,3-Oxidosqualene이 축정되어 있는 것을 확인하였다. 이 스트레인 이름을 S.cerevisiae MET3p-ERG7으로 명명하고, 이 스트레인에 ginsenoside 합성 경로를 구축하였다.
나. 중간물질 대량생산을 위한 tHMG1 도입
S. cerevisiae의 HMG-CoA reductase (HMG1)은 HMG1에 의해서 만들어지는 Mevalonate에 의해서 feed-back regulation을 받는 것으로 알려져 있다. Wild type HMG1에는 Mevalonate에 의해서 regulation받는 regulation domain과, HMG-CoA를 Mevalonate로 전환시키는 catalytic domain 두 domain으로 이루어져 있는데, regulation domain을 제거한 truncated HMG1 (tHMG1)을 만들어 engineered S. cerevisiae에 발현을 시켰다. 그 결과, tHMG1을 발현시키지 않은 Methionine을 첨가한 engineered strain에 비해 tHMG1을 추가 발현시킨 Strain에서 더많은 중간물질이 만들어 진 것을 확인 할 수 있다.
다. Dammarenenediol-II synthase 도입 및 Dammarenediol-II 생산 확인
tHMG1이 들어간 strain에 Dammarenediol-II synthase를 도입하였다. E. coli에서는 soluble하게 발현이 되지 않았으나, Yeast인 S. cerevisiae에서는 발현이 되어 function을 보이는 것을 metabolite 분석을 통하여 확인하였다. Fig. 4.의 HPLC chromatograph을 보면, Dammarenediol-II synthase가 도입된 strain에서만 Dammarenediol-II standard와 동일한 peak 이 보이는 것을 알 수 있다.
라. Ginsenoside Rg3 생산을 위한 합성경로 구축 및 Rg3 생산F확인
본 연구진이 찾은 PPD로부터부터 Rh2, Rg3를 만들 수 있는 두 개의 UDP-glycosyltransferase와 PPDS를 이용하여 engineered strain에 Ginsenoside Rg3 합성경로를 구축하였고, Fed-batch fermentation을 통하여 Ginsenoside Rg3를 생산하였고, HPLC, LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 1.3mg/L의 Rg3가 생산되었고, Standard아 동일한 물질임도 확인하였다 (Fig. 6).

Abstract ▼

Panax species are the most popular medicinal herbs. The root of these plants contains pharmacologically active triterpene saponins, also known as ginsenosides, compounds that are divided into dammarane- and oleanane-type triterpenes. Two CYP716A subfamily genes (CYP716A47 and CYP716A53v2) were recen

Panax species are the most popular medicinal herbs. The root of these plants contains pharmacologically active triterpene saponins, also known as ginsenosides, compounds that are divided into dammarane- and oleanane-type triterpenes. Two CYP716A subfamily genes (CYP716A47 and CYP716A53v2) were recently characterized, encoding an enzyme catalyzing the hydroxylation of dammarane-type triterpenes in P. ginseng. Herein, we report that one CYP716A subfamily gene (CYP716A52v2) isolated from P. ginseng encodes a β-amyrin 28-oxidase, which is suggested to modify β-amyrin into oleanolic acid, a precursor of an oleanane-type saponin (mainly ginsenoside Ro) in Panax ginseng. The ectopic expression of both PNY1 and CYP716A52v2 in recombinant yeast resulted in erythrodiol and oleanolic acid production, respectively. In vitro enzymatic activity assays biochemically confirmed that CYP716A52v2 catalyzed the oxidation of β-amyrin to produce oleanolic acid, and the chemical structure of the oleanolic acid product was confirmed using gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). TransgenicP. ginseng plants were generated via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation: the overexpression of CYP716A52v2 highly increased the content of oleanane-type ginsenoside (ginsenoside Ro), whereas RNA interference against CYP716A52v2 markedly reduced it. Furthermore, the levels of other dammarene-type ginsenosides were not affected in these transgenic lines. These results indicate that CYP716A52v2 is a β-amyrin 28-oxidase that plays a key role in the formation of oleanane-type triterpene biosynthesis in P. ginseng.
Dammarenediol-II synthase catalyzes the cyclization of 2,3-oxidosqualene to dammarenediol-II, which is the basic triterpene skeleton in dammarene-type saponin (ginsenosides) in Panax ginseng. Dammarenediol-II is a useful candidate both for pharmacologically active triterpenes and as a defense compound in plants. Dammarenediol-II is present in the roots of P. ginseng in trace amounts because it is an intermediate roduct in triterpene biosynthesis. In this work, we established the production of dammarenediol-II via cell suspension culture of transgenic tobacco. The dammarenediol-II synthase gene (PgDDS) isolated from P. ginseng was introduced into the Nicotiana tobacum genome under the control of 35S promoter by Agrobacterium-mediated transformation. Accumulation of dammarenediol-II in transgenic tobacco plants occurred in an organ-specific manner (roots>stems>leaves>flower buds), and transgenic line 14 (T14) exhibited a high amount (157.8 μg g-1DW) of dammarenediol-II in the roots. Dammarenediol-II production transgenic tobacco plants resulted in reduced phytosterol (β -sitosterol, campesterol, and stigmasterol) contents. A cell suspension culture was established as a shake flask culture of a callus derived from root segments of transgenic (T14) plants. The amount of dammarenediol-II production in the cell suspension reached 573 μg g-1 dry weight after 3 weeks of culture, which is equivalent to a culture volume of 5.2 mg dammarenediol-II per liter. Conclusively, the production of dammarenediol-II in a cell suspension culture of transgenic tobacco can be applied to the large-scale production of this compound and utilized as a source of pharmacologically active medicinal materials.
Ginsenosides are glycosylated triterpenes, considered to be important pharmaceutically active components of the ginseng plant (Panax ginseng Meyer), which is known as an adaptogenic herb. The backbone of ginsenosides is synthesized via the isoprenoid pathway by cyclization of 2,3-oxidosqualene mediated with dammarenediol synthase (DDS) or β -amyrin synthase (β-AS). Although functional characterization of several oxidosqualene cyclases such as DDS and β-AS, and squalene epoxidase (SE) are demonstrated in literature, the possible roles of the rate-limiting 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) which catalyzes the first committed step of the mevalonate pathway for the isoprenoid biosynthesis in ginseng plant was remained uncovered. Through analysis of full-length cDNAs, two forms of HMGR were identified as showing high sequence identity. The steady-state mRNA expression patterns of PgHMGR1 and PgHMGR2 are relatively low in seed, leaf, stem, and flower but are stronger in the petiole of seedling and root. The transcripts of PgHMGR1 was relatively constant in 3 and 6-year-old ginseng roots. However, PgHMGR2 were increased 5 times in the 6-year-old ginseng roots compared to those of the 3-year-old. This inditates that HMGRs have constant and specific roles in the accumulation of ginsenosides in roots. Competitive inhibition of HMGR by mevinolin caused a significant reduction of total ginsenoside in ginseng adventitous roots. Moreover, continuous dark exposure for 2-3 days increased the total ginsenosides content in 3-year-old ginseng, following the dark-induced activity of PgHMGR1. These results suggest that PgHMGR1 is associated with the dark-dependent promotion of ginsnosides biosynthesis. We also observed that the PgHMGR1 can complement Arabidopsis hmgr1-1, and that the overexpression of PgHMGR1 enhanced the production of sterols and triterpenes in Arabidopsis thaliana and ginseng. Overall, this suggests that ginseng HMGRs play a regulatory role in triterpene ginsenoside biosynthesis.. UGT or Cytochrome P450 gene families are supposed to be involved in diversification of ginsenoside. Two of genes from each family are first characterized in our study to be involved in biotic and abiotic stresses. It explains that the secondary metabolic product, ginsenoside is also playing important roles in plant defense. To elucidate the possible interatcion of secondary metabolite and defense mechanism, several defense-related genes such as PR-10 and gamma-thionin was characterized in ginseng for the first time and shown to be involved in resistant for various environmental stresses.
In this study we tried to make new and more applicable ginsenoside by using hydrolytic enzyme, glycosyltransferase, complex with PEG and ginsenoside CK,, or ketonization of ginsenoside.
First, GT( Glucosyl transferase) and CGTase, Using the isolated over expressed GT the Rh1 and F1 can be synthesized to new ginsenosde and novel α-glycosylated derivatives of ginsenoside F1 were synthesized from dextrin and ginsenosides F1 by the successive actions of Toruzyme 3.0L, a cyclodextrin glucanotransferase. One of them was isolated and identified as 3â, 6á, 12â-trihydroxy- dammar-20(S)-O-â-D-glucopyranosyl-(1→2)-á-D-glucopyranoside by spectroscopy (FAB-MS, IR, ¹H-NMR and ¹³C-NMR). This α -glucosyl ginsenoside F1 has better solubility than ginsenoside F1.
Second, we have clone the beta glucosidase (bgp1), showing specific cleaves the glucoside linkage at 3’ position and also make the bioconversion with red ginseng extract or leaf crude saponins by fermentation. Red ginseng extract (RGE) was converted into high-content minor ginsenosides by fermenting with Bgp1 enzymes at 37°C for 5 days. Compared to the RGE, the minor ginsenoside contents were increased in fermented red ginseng extract (FRGE). Moreover, the amount of minor ginsenosides such as Rh1 (11%)and Rg2 (16%) was slightly augmented, while the level of Rg3 (33%) was significantly increased after bioconversion. Furthermore, we also examined and compared the effect of RGE and FRGE on the differentiation and mineralization of preosteoblastic MC3T3-E1 cells. Similarly, the level of mRNA expression of intracellular alkaline phosphatase (ALP) activities, type-1 collagen (Coll-1) was also increased. Based on the comparison, it is clear that the FRGE has improved effects on bone formation and differentiation of preosteoblastic MC3T3-E1 cells.
Major ginseng leaf saponins were converted into more pharmacologically active minor ginsenosides by fermentation process using recombinant β-glucosidase enzyme (bgp1). Within three hours of incubation, all dominant major ginsenosides found in ginseng leaf had decomposed and been converted into the more active minor ginsenosides (i.e., 100% of Rg1, Re and Rd were decomposed and converted into Rh1, Rg2 and Rg3, respectively). The fermented product contains pharmacologically active minor ginsenosides Rh1, Rg2, Rg3, F1, and PPT. Furthermore, we examined and compared the effect of leaf saponins (LS) and fermented leaf saponins (FLS), on the differentiation and mineralization of pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells. Treatment with FLS significantly increased cell viability in a dose-dependent manner. FLS was capable to stimulate ALP activity, Coll-I synthesis, and mineralization in the MC3T3-E1 cells. BMP-2 and Runx2 expression were also increased by FLS concentration dependently. Based on the comparison between LS and FLS, it is clear that FLS has good effect on differentiation and bone formation of osteoblastic MC3T3-E1 cells.
Third, deglycosylation and ketonization of ginsenoside by cloning of 3β-hydroxysteroid dehydrogenases The recombinant hydroxysteroid dehydrogenases (HSDLb1) is a ginsenoside-transforming from Lactobacillus brevis DCY65-1. The gene, termed HSDLb1, belonging to 3β-hydroxysteroid dehydrogenases was cloned. HSDLb1 consists of 774 bp (258 amino acids residues) with a predicted molecular mass of 28.64 KDa. This enzyme was overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3) using a pMAL-c5X vector system. HSDLb1 can effectively transform the ginsenoside CK to 3-oxo-CK. These results suggest that recombinant HSDLb1 is capable of potent ketonic decarboxylation, via ketonizing the hydroxyl group at C-3. Especially, recombinant HSDLb1 was utilized for the production of pharmacologically active minor ginsenosides as well as CK, PPD, 3-oxo-CK and 3-oxo-PPD. The amount of CK, PPD and 3-oxo-PPD increase inhibitory activity in A549 lung cancer cells in does dependantly. We reported the cloning and characterization of a gene encodin g ginsenoside-transforming hydroxysteroid dehydrogenases (HSDLb1) that we isolated from Lactobacillus brevis DCY65-1. The recombinant HSDLb1 provides effective ketonized ginsenoside transformation with high productivity and low cost. Therefore, recombinant enzymes can be used for other industrial purpose as well as production of ketonized ginsenoside.
Fourth, synthesis of polyethylene glycol ginsenoside CK conjugates. Ginsenosides in Panax ginseng, have vast structural-pharmacological efficacies. Polyethylene glycol was covalently conjugated on the surface of CK (PEG-CK) through an acid-labile ester-linkage which showed increased of CK. HPLC analysis showed that, release of CK was enhanced under acidic pH 5, whereas it was dramatically decreased under physiological pH 7.4, which may enhance efficacy of CK. These result can be appled to make novel ginsenosides with more pharmaceutical effect and also need more further study for mass production.
The productivity of minor ginsenosides using conventional methods has been low due to complexity involved with the system. In order to overcome this problem, novel method has to be developed for mass production of minor ginsenosides. Replacing the conventional methods, DNA scaffold system has been newly developed for efficient and high production of minor ginsenosides.
DNA scaffold system can greatly increase the rate of sequential metabolic reaction by utilizing Zinc Finger Proteins. Enzymes related to minor ginsenosides biosynthesis will be fused with Zinc Finger Proteins that have specific DNA binding domains. Such system will maximize the enzymatic reaction by efficiently allowing enzymes to bind DNA. Moreover, utilizing only Zinc Finger Proteins can greatly limit the specificity as number of enzymes in metabolic reaction increases. Therefore, we will construct a DNA binding domain library which do not requires Zinc Finger Proteins in binding genomic DNA. Furthermore, we will construct optimized pathway for minor ginsenoside synthesis using DNA scaffold. The optimized pathway will be utilized to produce minor ginsenoside in E. coli. Above all, in order to utilize DNA scaffold system to increase the rate of enzymatic reaction, necessary information in regards to ginsenoside biosynthesis is needed. However, genes related to ginsenoside biosynthesis are not fully screened and studied. We will screen genes that are related to minor ginsenosides biosynthesis from RNA of ginseng flower buds, leaves and roots using Next Generation Sequencing (NGS). NGS can provide sequences of contigs that can be analyzed to search for full sequences of genes involved in minor ginsenoside biosynthesis.
We expect DNA scaffold system will allow the mass production of minor ginsenosides and other useful plant-derived materials. These compounds will be fully studied to develop new markets in therapeutics and cosmetics. Furthermore, we will develop a functional plant that contains artificial minor ginsenosides synthesis pathway. The functional plant will improve immunity of domestic animals and advance livestock industry.