초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
○ 타락발효유의 제품화 기술개발
가. 유산균주의 선발 및 동정
▪ 생막걸리 내의 효모의 농도는 106-108 cfu/mL 수준이었음. 유산균이 분리된 생막걸리는 약 32종으로 수집된 막걸리의 36.8%였으며, 유산균이 있는 경우 농도는 104-106 cfu/mL수준이었음. 이것으로 보아 막걸리의 주요 발효 균주는 효모와 유산균임을 알 수 있었음. 대량 생산에 용이한 것은 유산균이므로 유산균주를 우선 검토하였음. 현재까지 분리된 균주는 효모가 약 130종, 유산균이 약 200종 정도 임.
▪ 분

Ⅳ. 연구개발결과
○ 타락발효유의 제품화 기술개발
가. 유산균주의 선발 및 동정
▪ 생막걸리 내의 효모의 농도는 106-108 cfu/mL 수준이었음. 유산균이 분리된 생막걸리는 약 32종으로 수집된 막걸리의 36.8%였으며, 유산균이 있는 경우 농도는 104-106 cfu/mL수준이었음. 이것으로 보아 막걸리의 주요 발효 균주는 효모와 유산균임을 알 수 있었음. 대량 생산에 용이한 것은 유산균이므로 유산균주를 우선 검토하였음. 현재까지 분리된 균주는 효모가 약 130종, 유산균이 약 200종 정도 임.
▪ 분리 균주 중 milk 배지에서 커드 형성 유산균을 동정한 결과, Lactobacillus plantarum 7종과 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 5 종이 각각 규명되었음.
▪ 몽골 유제품 균주 89종 중 10% skim milk에서 커드를 형성하는 균주는 8종이었으며 Enterococcus 균주가 7종, Lactobacillus 균주 1종이었음. 그 중 대량 생산에 적용하기 용이한 것은 Lactobacillus 속 유산간균으로 Lactobacillus helveticus를 배양 테스트에 이용하였음. 타락 균주 47종에서는 10% skim milk에서 커드를 형성하는 균주가 없었음.

나. 선발균주의 표준 배합비 선정
▪ 선별 10종 균주 중 파일럿 테스트 배양물의 curd 형성균은 총 5종으로 MKRL 5-8, M13-23-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-2이었으며, 이 중 총 유산균수가 가장 높은 균주는 MKRL 5-8이었음. 이 균주를 적용하여 배양액을 제조할 수 있도록 배양 조건을 설정하였음.
▪ 막걸리 유래 유산균의 성장이 유성분만으로는 안정적이지 않아 당류를 첨가하여 발효가 잘되도록 유도하였음. 또한 전통적인 타락과 동일하게 유성분에 막걸리를 넣은 효과를 내기 위해 쌀즙을 넣고 막걸리 유래 유산균으로 발효하였음.

다. 발효 공정 최적화
▪ 배합비와 같이 원료를 섞고 130~135℃로 2~3초간 가열(UHT, ultra-high temperature sterilization)하여 살균하였음. 살균 후 35~40℃로 냉각하여 막걸리 유래 유산균(MKRL 5-8, M13-23-3, M13-71-2, 모두 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)을 0.02% 농도로 접종하였음. 37℃ water bath에서 24시간 동안 배양하여 발효시키고 발효가 끝난 샘플은 50/150 bar로 균질하여 드링크 타입의 발효유로 제조하였음.

라. 타락발효유 시제품 개발 및 관련 품질확보
▪ 선발균주 중 L. paracasei M13-23-3이 24시간 배양 후, 산도가 가장 낮았음. L. paracasei M13-23-3이 신맛이 가장 적었으며, 당도와 균수는 선발균주 3종의 유의적 차이가 없었으며, 농후발효유 법적 기준에 적합하였음.
▪ L. paracasei M13-23-3으로 발효시킨 타락발효유의 100 g 당 영양성분은 일반적인 드링크 발효유에 비해 지방함량은 낮고 당함량은 높은 편임.
▪ L. paracasei M13-23-3으로 발효시킨 타락발효유로 관능검사 수행 결과 전체적인 맛 점수는 4.0점/7점 척도로 중간 수준이었음(Fig. 8). 원인으로는 향에 대한 기호도가 낮고 신맛이 강하기 때문이라고 판단이 됨.
▪ MKRL5-8의 배양액 및 균체는 여드름 원인균인 P. acnes ATCC11828 과 P. acnes ATCC6919 의 생장을 저해하는 효능이 있음을 확인하였음.

○ 전통발효유 타락의 제조 표준화 및 영양적 우수성 규명
가. 막걸리를 발효원으로 한 타락의 발효산물 및 영양성분 분석
▪ 막걸리에서 추출한 5종의 L. paracasei를 이용해 24시간 37℃에서 타락을 발효하며, 타락의 pH, 산도, 점도, 유기산, 유리당 함량, 지방산, 무기질 함량 및 미세구조를 측정하였음.
▪ 발효시간이 길어짐에 따라 타락의 pH는 감소하였으며, 특히 발효 12시간에는 pH가 급감, 우유의 등전점인 pH 4.6 부근으로 감소, 발효 12시간부터 커드를 형성하였음을 알 수 있었음.
▪ pH, 산도와 점도는 발효시간에 따라서 현저하게 달라지나, 균종 간의 차이는 크지 않았음
▪ 생균수 역시 발효 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보이나, 24시간 후에는 균종 간의 차이가 없었음.
▪ 유기산 중 젖산 (lactic acid) 함량은 발효 12시간에 급증한 후 발효 시간에 따라 증가하는 경향을 보였음. 균종 간에는 균 5번 샘플이 다른 균종에 비해 높은 수치의 lactic acid를 형성하였음을 알 수 있었음. M13-71-2로 발효한 샘플이 가장 낮은 유당 함량을 보였음.
▪ 발효 24시간 샘플들을 동결 건조하여 균종간의 무기질과 지방산을 비교한 결과, 무기질은 샘플들 간에 큰 차이가 없었지만, M13-71-2로 발효한 샘플이 다른 샘플들에 비해 높은 미네랄 함량을 보였음. 지방산 결과에서는 약 30%의 불포화지방산을 함유하는 것으로 나타났음.
▪ 대조군 샘플과 발효 타락샘플의 미세구조를 전자현미경으로 관찰한 결과 발효 타락 샘플에서는 균의 몸체와 함께 EPS(exo-polysaccharides, 균이 생성하는 다당체)로 추정되는 점질물이 함께 발견되었음.
▪ L. paracasei 가 발효가 진행되는 동안 생체 기능성 물질로 알려진 다당체의 형성 가능성을 보여, 발효유 타락이 항암, 항궤양, 면역 증강 작용 등 인체 내에 bioactive agent 로서의 충분한 역할을 할 수 있을 것이라 예상 됨. 특히 M13-71-2는 다른 균종들에 비해 다당류를 더 많이 생성시킴을 알 수 있었음.

○ 타락의 기능성 분석방법 확립 및 in vitro 기능성 규명
가. 타락의 추출물 제조법 확립과 분획
▪ 제1세부 제조 타락 동결건조 시료제공(MKRL-5-8, M13-23-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-2)
▪ 타락 동결건조 시료를 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, phosphate buffer로 분획하여 고형분 회수

나. 면역 증진 기능성 분석 및 기능성 강화 조건 탐색
▪ 세포 증식도 측정을 위한 MC116 cell, Jurkat cell의 배양 조건 확립
▪ M13-65-3 시료는 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL 농도에서 jurkat cell의 세포 증식도를 유의하게 증가시킴 (p<0.05).

다. 타락의 멜라닌 생성 억제 기능 분석
▪ MKRL-5-8, M13-23-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-2 타락 시료는 100 μg/mL농도에서 tyrosinase 역가의 약 20%를 저해함.
▪ MKRL-5-8 시료, M13-67-1 시료는 100 μg/mL 농도에서 α-MSH에 의하여 촉진된 B16 F10 cell의 멜라닌 생성을 유의적으로 억제함. (p<0.05)

라. 타락의 항비만 기능성 규명
▪ 지방전구세포 (3T3-L1) 배양 조건, 지방세포 분화 조건, 지방 생성 유도 조건 수립
▪ 타락 추출물 (5-8, 71-2)은 지방세포의 지방 생성도를 유의하게 억제함.
▪ 타락 추출물 (5-8, 71-2)은 지방세포의 PPARγ, C/EBPα 발현량 감소 기능이 없음.
▪ 타락 추출물 (5-8, 71-2)은 쥐를 이용한 동물실험에서 체중감소와 혈중지질 개선 효능이있음.

마. 타락의 암세포 생장 억제 기능성 규명
▪ 타락 추출물 (5-8, 23-3, 71-2)에서는 A549 세포 (폐암세포), HepG2 세포 (간암세포)의 생장 억제 기능이 발견되지 않았음.

○ 타락의 응용제품 개발
가. 타락 응용 젤리류 개발(젤리, 푸딩)
▪ 본 실험에 사용된 타락은 수운잡방(Sueunjabbang Research Institute 2011)과 Lim 등 (2013)의 타락 제조법을 참고한 자연발효 타락을 이용하였음.
▪ 타락을 이용한 젤리류인 과편, 양갱, 젤리, 푸딩의 실험조리 결과, 타락의 사용량이 비교적 많고, 관능 상 특성이 우수하다고 생각되는 젤리와 푸딩에 대한 제조조건을 확립하였음.
▪ 타락을 이용한 젤리와 푸딩의 일반성분 분석 결과, 젤리와 푸딩 모두 타락의 첨가량이 많아질수록 수분의 함량은 감소하였고, 조단백질, 조회분, 조지방의 함량은 유의적으로 증가하였음.
▪ 젤리와 푸딩 모두 타락의 첨가량이 많아질수록 pH는 유의적으로 감소하고 산도는 유의적으로 증가하였으며, 당도는 증가하였음.
▪ 타락 75%의 타락젤리의 관능품질이 가장 우수한 것으로 판단됨.
▪ 푸딩 제조 시 타락 특유의 신맛과 향이 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단되며, 이상의 결과 타락 75%와 100%의 첨가가 바람직한 것으로 생각됨.

나. 타락 응용 프로즌요구르트 개발(아이스크림)
▪ 본 연구에서는 1세부 과제(한국 야쿠르트)를 통해 제조된 상업용 타락을 이용하여 디저트식품으로 선호도가 높은 아이스크림 제품류 중 유지방분 6 % 이상, 유고형분 16 % 이상에 해당하는 아이스크림 규격에 맞춰 타락 응용 프로즌 요구르트(아이스크림)의 제조조건을 확립하고자 하였음.
▪ 타락첨가 아이스크림의 젖산균수는 7.01-8.17(log CFU/g)의 수준으로 나타났으며, 타락의 첨가에 따라 유의적으로 증가하였음.
▪ 전반적인 기호도에서 타락을 가장 많이 첨가한 TI-48(타락 48%)이 가장 높게 평가되었음.
▪ 본 연구 결과를 토대로 향후 연구에서는 타락을 각 50% 첨가하여 아이스크림류의 식품공전 상의 기준 규격에 맞춰 샤베트, 저지방 아이스크림, 아이스크림 등 제품군별 제조를 통해 타락을 이용한 아이스크림의 최적 제품을 제안하고자 함.

Abstract ▼

IV. Results of research and development
○ Development of commercialization technologies for Tarak fermented milk
1. Selection and identification of lactic acid bacteria
▪ The concentration of yeast was 106-108 cfu/ml in raw rice wine. The lactic acid bacteria were isolated from 32 kinds of

IV. Results of research and development
○ Development of commercialization technologies for Tarak fermented milk
1. Selection and identification of lactic acid bacteria
▪ The concentration of yeast was 106-108 cfu/ml in raw rice wine. The lactic acid bacteria were isolated from 32 kinds of raw rice wine products. The concentration of lactic acid bacteria was 104-106 cfu/ml. Yeast and lactic acid bacteria are the major strains for fermentation of rice wine. Lactic acid bacteria are suitable for production in large scale. The isolated strains from rice wine products were about 130 strains of yeast and about 200 strains of lactic acid bacteria with curd formation.
▪ Results of identification of lactic acid bacteria were 7 strains of Lactobacillus plantarum and 5 strains of Lactobacillus paracasei ssp. paracasei.
▪ Five kinds of enterococcus and one kind of lactobacillus strains from 89 Mongolia dairy products showed curd formation in 10% skim milk. From isolated strains, Lactobacillus helveticus was used for fermentation test. Tarak strains (n=47) did not show curd formation in 10% skim milk.

2. Standard recipe formulation with selected strains
▪ MKRL 5-8, M13-2-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-25 showed curd formation in pilot tests. From tested strains, MKRL 5-8 obtained the highest viable count results. The fermentation condition was optimized for the strain.
▪ Lactic acid bacteria derived from rice wine were not suitable for growing with milk ingredient only. Addition of sugar induced better fermentation. Also, rice soup was used for fermentation.

3. Fermentation Process Optimization
▪ Ingredients were mixed and sterilized for 2-3 seconds at 103-135 degree (UHT, Ultra High Temperature sterilization). After that, it was cooled to 35-40 degree and inoculated in the concentration of 0.02% with Lactobacillus paracasei subsp. paracasei strains (MKRL 5-8, M13-23-3, M13-71-2) from Korean rice wine. It was fermented for 24 hours in 37 degree using a water bath and homogenized at 50/150 bar for the production of drink type yogurt.

4. Development of Tarak fermented milk test products and establishment of quality control
▪ The acidity of L. paracasei M13-23-3 after 24 hours of incubation showed the lowest results in comparison to other strains. L. paracasei M13-23-3 was the lowest in the level of sour taste. Sugar contents and the viable counts of bacteria showed no significant difference between three selected strains.
▪ Nutrients per 100 g of Tarak fermented milk with L. paracasei M13-23-3 were lower in fat contents and higher in sugar contents compared to the typical fermented milk products.
▪ The sensory evaluation of Tarak using L. paracasei M13-23-3 was around the normal level with 4.0 in 7.0 point scale(Fig. 8). It was attributed to the low preference for flavor and the strong acidity.
▪ Incubated MKRL 5-8 and its fermentation products were effective to inhibit the growth of P. acnes ATCC11828 and P. acnes ATCC6919．

○ Establishment of manufacturing standards and elucidation of nutritional excellence of traditional fermented milk Tarak
1. Nutritional analysis of the Tarak and fermentation products
▪ Five L. paracasei strains were used for fermentation for 24 hour at 37 degree. Acidity, pH, viscosity, organic acid concentration, free sugar content, fatty acid, minerals were assayed and microstructure of Tarak was also observed.
▪ The pH of Tarak was decreased according to the incubation period and was dramatically decreased at 12hr to pH 4.6 (isoelectric point of milk). Curd was produced in the 12 hours of fermentation.
▪ Acidity, pH, and viscosity can vary significantly depending on the fermentation time. However, it was not great differences between the species.
▪ The number of live cells also show a tendency to increase according to the length of fermentation time. But it did not show significant differences between the species after 24 hours of incubation.
▪ Lactic acid contents was sharply increased in 12 hours, after that, slowly increased according to the fermentation time. M13-71-2 showed the highest level of lactic acid.
▪ Tarak incubated for 24 hours was freeze-dried. Minerals and fatty acids in the samples were analyzed. There was no difference between mineral contents of samples. The sample fermented with M13-71-2 showed a slightly higher mineral content than the other samples. And the samples contained an unsaturated fatty acid of about 30%.
▪ Microstructure of control and Tarak were observed by electron microscopy and EPS (exo-polysaccharide) was investigated.
▪ L. paracasei produced polysaccharide recognized as biological functional materials in the culture. So, Tarak might be used as a bioactive agent for anti-cancer, anti-inflammation, and immune stimulation. In particular, M13-71-2 produced more polysaccharide than other strains.

○ Establishment of functional analysis methods in the Tarak and elucidation of in vitro functionality
1. Development of manufacturing method for Tarak extracts and fractions
▪ Freeze-dried samples manufactured in R&D center of Korea Yakult Co., Ltd. (MKRL-5-8, M13-23-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-2) were used.
▪ Freeze-dried samples were fractionated using n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, and phosphate buffer.

2. Analysis of immune stimulation and investigation for the condition of functionality improvement
▪ The establishment of culture conditions of MC116 cell, Jurkat cell for measurement of the degree of cell proliferation.
▪ Tarak sample(M13-65-3) significantly increased the cell proliferation of Jurkat cells in 10, 50, 100, and 200 μm/ml concentration (p<0.05).

3. Analysis for inhibition of melanin production by Tarak
▪ Tarak samples (MKRL-5-8, M13-23-3, M13-65-3, M13-67-1, M13-71-2) reduced tyrosinase activity in 20% at 100 μg/mL concentration.
▪ Tarak samples(MKRL-5-8, M13-67-1) significantly inhibited the generation of melanin by B16F10 cell accelerated by α-MSH in 100 μg/mL concentration (p<0.05).

4. Analysis of Tarak for antiobesity function
▪ Establishment of Preadipocytes(3T3-L1) culture conditions, adipocyte differentiation conditions, and lipogenesis induced conditions
▪ Tarak extract(5-8, 71-2) significantly inhibited the degree of adipocyte lipogenesis
▪ Tarak extract(5-8, 71-2) did not reduce the expression level of PPARγ, C/EBPα in the adipocytes.
▪ Tarak extract(5-8, 71-2) reduced body weight and improved the blood lipids profile in vivo test.

5. Cancer cell growth inhibition analysis of Tarak
▪ Tarak extract(5-8, 23-3, 71-2) showed no growth inhibitory function for A549 cell (Lung cancer cells), and HepG2 cell (Hepatoma cells).

○ Development of commercial products using Tarak
1. Applications of Tarak for jelly type product(jelly, pudding)
▪ Tarak, which were traditionally produced according to Suunjapbang (Suunjapbang Research Institute,2011) and Lim (2013), were used for this research.
▪ We tested the possible application of Tarak for Gwapyeon, sweet jelly of beans, jelly, and pudding. As a result, manufacturing procedures with excellent sensory properties were established.
▪ We analyzed the general composition of the pudding and jelly with Tarak. As more Tarak was used, the less moisture contents were found. However, crude protein, ash, and crude fat were significantly increased.
▪ As the Tarak quantity increases, the pH is decreased significantly, Conversely acidity and sugar contents were significantly increased.
▪ The combination of 75% Tarak and jelly resulted in the best acceptance.
▪ A sour taste and flavor of Tarak goes well with pudding of Tarak applications. The 100% and 75% of Tarak in pudding were suitable.

2. Application of Tarak for frozen yogurt development (ice cream)
▪ The legal standard for ice cream defines the contents of milk fat as more than 6% and milk solids as 16% or more. Frozen yogurt manufacturing procedures had been established according to the above specification.
▪ The number of lactic acid bacteria in Tarak ice cream was 7.01-8.17(logCFU/g) level. Bacterial counts were significantly increased according to the amount of Tarak.
▪ In the case that contents of Tarak was 48%, the taste of Tarak application showed the highest acceptance.
▪ Based on the present findings, we propose to include 50% of Tarak to manufacture ice cream products.