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Ⅳ. 연구개발결과
제 1 절 항선충 미생물 특성연구 및 미생물제제 연구
1. 항선충 미생물 선행 연구 결과
가. 항선충 미생물 분리 및 특성 조사
전남 해안가 일대에서 게껍질이 풍부한 토양을 채취한 후 토양으로부터 키틴/젤라틴 분해 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물 중에 항선충 활성이 강한 미생물을 선발하여 동정한 결과 Lysobacter capsici로 동정되었고, YS1215로 명명하고 NCBI genebank에 등록하였다(등록번호는 HQ610445번). 이 미생물은 키틴분해효소 (chitinase) 및

Ⅳ. 연구개발결과
제 1 절 항선충 미생물 특성연구 및 미생물제제 연구
1. 항선충 미생물 선행 연구 결과
가. 항선충 미생물 분리 및 특성 조사
전남 해안가 일대에서 게껍질이 풍부한 토양을 채취한 후 토양으로부터 키틴/젤라틴 분해 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물 중에 항선충 활성이 강한 미생물을 선발하여 동정한 결과 Lysobacter capsici로 동정되었고, YS1215로 명명하고 NCBI genebank에 등록하였다(등록번호는 HQ610445번). 이 미생물은 키틴분해효소 (chitinase) 및 젤라틴분해효소 (gelatinase), 셀룰로오스분해효소 (cellulase), 옥신 및 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG)를 생산함을 확인하였다
나. 미생물 처리에 따른 항선충 활성 조사
Lysobacter capsici YS1215를 5일 동안 30℃에서 배양한 후 원심분리하여 상등액을 취하여 항선충 활성을 조사한결과 50% 배양액 처리구에서 90%의 유충치사율을 보였고 알부화율은 조사 5일째 10%로 확인되었다.
2. 뿌리혹선충 분리 및 선발 미생물 항선충 활성 연구
가. 미생물의 선충알 기질사용에 따른 키틴분해효소 조사
선충알을 모은 후 멸균하고 L. capsici YS1215를 접종하여 날짜별로 키틴분해효소 활성(chitinase activity)을 조사한 결과 키틴분말(crab shell powder) 기질과 선충알(nematode egg) 기질 사용 모두 1 일부터 3일째 까지 증가하다, 3일째 가장 높은 활성을 보였고, 그 후에는 5일째 까지 점차 감소하였다.
나. 미생물의 선충알 기질사용에 따른 분해산물 조사
L. capsici YS1215의 선충 알 분해 산물인 키토 올리고당 (N-acetyl-D-glucosamine)을 HPLC를 이용하여 조사하였다. 조사 결과 표준물질과 시료물질의 머무름 시간(retension time) 이 4.99로 같게 조사되었다. 이는 미생물이 tjs충 알을 분해하여 배양액에 키토 올리고 1당 표준물질인 N-acetyl-D-glucosamine이 존재 하는 것을 사료된다. 대조구로 사용된 미생물을 접종하지 않은 처리구에서는 N-acetyl-D-glucosarnine이 검출되지 않았다.
다. 미생물의 선충유충 기질사용에 따른 젤라틴분해효소 조사
선충 유충을 모은 후 멸균하고 L. capsici YS1215를 접종하여 날짜별로 젤라틴분해효소 활성(gelatinase activity)을 조사한 결과 젤라틴분말 (gelatin) 기질을 사용한 것은 젤라틴분해효소 활성이 1일부터 4일째까지 증가하고 4일째 최고의 활성을 보였다. 또한 선충유충 (nematode juvenile) 기질 사용 젤라틴분해효소 활성은 3일째 까지 증가하다, 그 후에는 5일째 까지 점차 감소하였다.
라. 미생물의 선충유충 기질사용에 따른 분해산물 조사
뿌리혹선충 유충을 모은 후 멸균하고 L. capsici YS1215를 접종, 배양하고 3일째 배양액을 원심분리한 후 상등액을 회수 하여 분해산물인 아미노산을 조사한 결과 유충 분해 산물에서 proline 이 348.905 pg/μl 이 검출 되었다. 또한 valine 및 isoleucine 등이 검출 됐다
3. 선발된 미생물의 알 파괴효소 및 선충 표피 파괴효소 특성 연구
가. 알파괴 효소
(1) chitinase 활성 측정
Chitinase활성을 조사한 결과 배양 3일째 최고 활성을 나타내었으며, 3일 이후에는 점차 감소하는 경향을 보였다.
(2) chitinase 정제 및 알 파괴 조사
Chitinase 정제를 통하여 43.6 kDa 분자량을 가진 chitinase를 정제하였고, 정제된 chitinase를 이용하여 알 파괴 조사 결과 정제된 chitinase가 뿌리혹선충의 알을 파괴하는 것으로 조사되었다.
나. 선충 표피 파괴 효소
(1) gelatinase 활성 측정
Gelaitinase활성을 조사한 결과 1일째부터 점차 증가하여 배양 6일째 최고 활성을 나타내었고, 6일 이후에는 감소하는 정향을 보였다.
(2) gelatinase 정제 및 유충 파괴 조사
Gelatinase 정제를 통하여 255.7, 232.1 및 146.4 kDa 분자량을 가진 gelatinase를 정제하였고, 정제된 gelatinase를 이용하여 유충치사를 조사 결과 정제된 gelatinase가 뿌리혹선충의 유충의 치사에 영향을 주는 것으로 조사되었다.
4. 항선충 미생물이 생산하는 살선충 활성물질의 분리 및 활성 연구
가. 살선충 활성물질의 추출 및 정제
배양 여액을 에틸아세테이트 (etylacetate)로 추출하여 HPLC, GC-MS, LC-MS 및 NMR 등을 통하여 항선충활성을 지닌 2-hydroxypropanoic acid롤 분리 동정 하였다.
나. 분리한 살선충 활성물질의 선충 억제 활성 조사
(1) 알 부화 억제율 측정
2-hydroxypropanoic acid의 뿌리혹선충 알부화율에 관하여 조사한 결과 조사 5일째 250 mM에서 36.4%의 알 부화율로, 물 처리구 44.5% 보다 8.1%의 알 부화율이 낮게 조사되었다.
(2) 유충 치사율 측정
2-hydroxypropanoic acid의 유충 치사율에서는 조사 3일째 물 처리구 6.5% 보다 250 mM에서 10.1%로 3.5% 높게 조사되었다.
5. 미생물제제 유통기한 실험
가. 첨가제 종류에 따른 유통기한 영향
L. capsici YS1215의 유통 기한 실험을 위해 보관 1개월 후에 1차 시료채취 하여 조사한 결과 표준 배지 조성의 미생물 개체 수가 가장 높았고, 2차 및 3차 조사결과 표준 1/2 조성이 가장 좋았다. 하지만 TSB 1/2 조성에는 3차부터 6차까지 조사 결과 미생물이 검출 되지 않았다. 또한 4차, 5차 및 6차 실험결과 표준 배지 조성에서 미생물 개체 수가 가장 많이 검출되었다. 표준 배지조성(게껍질 분말사용)이 TSB 조성보다 유통기한을 길게 하는데 좋은 배지 성분임을 알 수 있다.
나. 시간경과에 따른 유통기한 영향
유통기한 조사 결과 모든 처리의 미생물 처리는 시간이 지남에 따라 점차적으로 감소하는 추이를 나타냈다. 대부분 미생물체제의 유통기한이 6개월임을 감안하면 전량 키틴배지 및 키틴을 1/2, 1/5, 1/10수준으로 줄인 배지를 사용 하는 것이 제품의 품질 유지에 가장 적당한 것으로 사료 되며 생산원가를 등의 여러 가지 요소를 고려했을 시 키틴1/2배지를 사용하여 산업화생 산에 활용하는 것이 제일 적합하다고 판단되었다.
6. 항선충 미 생물의 작물 실험
가. 항선충 미생물의 작물생육 효과
L. capsici YS1215의 작물 생육 효과 실험결과 지상부 생체중 및 건물중에서 대조구가 가장 높았고, 지상부 길이에서는 반량구 처리구가 대조구보다 높았다
나. 항선충 미생물의 선충억제 효과
L. capsici YS1215의 선충 억제 효과 실험결과 뿌리혹 수 및 뿌리혹난낭 수에서 무처리가 가장 높았고 다음으로 대조구, 반량구, 추천구, 농약 순으로 나타났다. 또한 토양선충 수에서도 뿌리혹 수와 난낭 수 결과와 같이 나타났다.
다. 토양내 키틴 분해 미생물 밀도 조사
L. capsici YS1215의 선충 억제 효과 실험에서 토양내의 키틴분해 미생물 수는 9주차에 대조구가 가장 높았고, 추천구, 반량구, 무처리구, 농약 처리구 순서로 나타났다. 젤라틴분해 미생물 수는 9주차에 반량구가 가장 높게 나타났고, 추천구, 대조구, 농약구, 무처리구 순서로 나타났다.
제 2 절 항선충 미생물제제 대량배양배지 및 미생물보조영양원 연구
1. 항선충 미생물 배양 최적조건 확립 가. 키틴과 젤라틴 비율에 따른 활성 검증
(1) 미생물 개체 수 측정
젤라틴/키틴 분말 비율에 따른 L. capsid YS1215 특성을 조사한 결과 미생물 개체 수에서 는 젤라틴분말 1.0g과 키틴분말 2.0g에서 가장 높게 나타났다.
(2) 알 부화 억제율 측정
젤라틴/키틴분말 비율에 따른 선충 알 부화율은 젤라틴분말 2.0g과 키틴분말 1.0g 조합에 서 가장 낮게 나타났다.
(3) 유충 치사율 측정
유충 치사율은 조사 1일째 젤라틴분말 2.0g과 키틴분말 1.0g 조합에서 가장 낮게 나타났다.
나. 생장인자 첨가에 따른 활성 검증
(1) 미생물 개체 수 측정
젤라틴/키틴 최적 조합인 젤라틴 2.0g과 키틴 1.0g 조합배지에 생장인자인 yeast extract와 peptone을 각각 첨가한 푸 L. capsid YS1215 개체 수를 즉정 한 결과 peptone 첨가 처 리구 가 yeast extract 처 리구보다 높게 나타났다.
(2) 알 부화 억제율 측정
생장인자 첨가에 따른 선충 알 부화율은 yeast extract 배양액 50% 처리구에서 가장 낮게 나타났다.
(3) 유중 치사율 즉정 유중
치사율은 yeast extract 배양액 50% 처리구에서 가장 높게 나타났다.
다. 미량요소 첨가에 따른 활성 검증
(1) 미생물 개체 수 측정
젤라틴/키틴 최적 조합인 젤라틴 2.0g과 키틴 1.0g 조합배지에 생장인자 첨가 실험 후 yeast extract첨가 시 선충 알 부화율이 peptone 첨가 처 리구 보다 낮게 나타났고，유충 치 사율에서는 높게 나타났으므로，yeast extract 첨가 배지를 최적 배지로 선정한 후 다음 실 험을 진행하였다. yeast extract 첨가 최적배지에 미량요소(1L 기준 MgSO₄.7H₂O 0.03g, CUS0₄-5H₂O 0.02g, ZnS0₄-7H₂O 0.02g, FeCl3-6H2O 0.03g)를 첨가한 후 배지를 만들고 배양 한 후 쇼 capsid YS1215 개체 수를 측정한 결과 미량요소를 넣지 않은 배지보다 높게 나 타났다.
(2) 알 부화 억제율 측정
미량요소 첨가에 따른 선충 알 부화율은 yeast extract 배양액 50% 처리구에서 가장 낮게 나타났다.
(3) 유충 치사율 측정
유충 치사율은 yeast extract 배양액 50% 처리구에서 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는
앞선 생장인자 첨가 실험 결과에 비추에 볼 때 미량요소를 첨가한 배양액 처리구가 미량요 소를 첨가하지 않은 처리구보다 선충 알 부화율은 낮고, 유충 치사율은 더 높게 나타났음 을 의미한다.
라. 최적 배지 확립을 위한 추가 실험
(1) 미생물 개체 수 즉정
최적배지 확립에 따른 L. capsid YS1215 생균 수 조사 결과 Nutrient broth 1.0g, Yeast extract 1.0g, 키틴분말 0.8g, 젤라틴분말 0.2g 조합 에서 가장 생육이 좋았다. 이러한 결과 는 미생물이 생장하는데 보조영양원의 영향이 있는 것으로 사료된다.
(2) 알 부화 억제율 측정
배지조성에 따른 선충 알 부화율은 실험 3일째 배지조성 3번에서 가장 낮게 나왔고，배지 조성 1번이 가장 높게 나타났다. 7일째는 배지조성 6번이 가장 낮게 나타났으며, 배지조성 1번에서 7일째 가장 높게 나타났다.
(3) 유중 치사율 즉정
배지조성에 따른 유충 치사율은 실험 1일째 배지조성 1번에서 가장 낮게 나타났고, 배지조 성 9번에서 가장 높게 나타났다.
2. 항선충 미생물 대량배양복합체 시제품 제작 가. 젤라틴/키틴배양체，미생물 보조영양원 및 미생물 적정 비율 조합 조사 1차년도에 결정된 기본 배지에 젤라틴/키틴배양체，미생물 보조영양원 및 미생물 접종양을 조절하여 최적의 대량배양복합체를 만들기 위하여 미생물 보조영양원(액비)를 추가하여 새로 운 조합을 작성 실험하였다.
나. 온도와 기타 환경에 따른 영향 조사
온도와 기타 환경에 따른 영향 조사 결과 뿌리혹선충 유충 치사율에서는 조사 3일째 30°C 9 번 조합 (30_9)에서 72.0%로 가장 높게 나타났고，40°C 5번 조합(40_5)에서 38.4%의 치사율 로 가장 낮게 조사되었다. 40°C에서의 유충 치사율은 20°C 및 30°C에 비해 상대적으로 낮게 나타났다. 알 부화율에서는 조사 5일째 30°C 9번 조합 (30_9)에서 11.7%로 가장 낮게 나타났 고，40°C 5번 조합(40_5)에서 24.5%의 부화율로 가장 높게 조사되었다. 40°C에서의 알 부화 율은 유충 치사율과 유사하게 20°C 및 30°C에 비해 상대적으로 높게 나타났다.
다. 미량요소 또는 첨가물질에 대한 효과 및 영향 조사
조사결과 H3B〇3 처리구에서 80.9%의 가장 높은 유충치사율을 보였고, MnS〇₄ 처리구에서 64.8%로 가장 낮은 치사율을 보였다. Organic sulfur 처리구는 66.6%, N_a2HPO₄ 처리구는 79.2%, N_a2M_oO₄ 처리구는 78.7%의 치사율을 보였다. 알 부화율 조사결과 H₃B0₃ 처리구에서 11.0%의 가장 낮은 알 부화율을 보였고, 유황 처리구에서 19.0%로 가장 높은 부화율을 보였다.
라. 미량요소 및 물질 조합에 따른 영향 조사
N_a2HPO₄ + N_a2M_oO₄ + H3BO3 처리구에서 81.9%의 가장 높은 유충치사율을 보였고， N_a2M_oO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 749%로 가장 낮은 치사율을 보였다. N_a2HPO₄ + N_a2M_oO₄ 처리구는 76.4%, N_a2HPO₄ + H₃BO₃ 처리구는 75.6%의 치사율을 보였다. 알 부화율에 관하 여 조사한결과 조사 5일째 N_a2HPO₄ + N_a2M_oO₄ + H₃BO₃ 처리구에서 18.4%의 가장 낮은 알 부화율을 보였고, N_a2HPO₄ + N_a2M_oO₄ 처리구에서 22.3%로 가장 높은 알 부화율을 보였다.
3. 미생물 보조영양원 (액비) 확립실험 가. 비료 등록을 위한 작물 생육 실험 및 성분 조사
(1) 상추 작물
상추를 이용한 액비 확립 실험결과 조사 12주차 생체중 및 건물중에서 액비 1000배 희석 처리구가 가장 높았다.
(2) 고추 작물
고추를 이용한 액비 확립 실험결과 조사 10주차 지상부생체중 및 건물중에서 액비 1000배 희석 처리구가 가장 높았다. 또한 지상부 길이에서도 l(X)〇배 처리구가 가장 좋았다.
제 3 절 포트에서 항선충 미생물 대량배양복합체 시용에 따른 효능 연구
1. 토마토 작물
1-1. 토마토 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (1 차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
토양내 유충 2차 조사에서 토양비멸균+비료(NSF) 처리구에서 가장 피해가 심한 것으로 조 사 되었고, 토양비멸균+농약+미생물(NSMP) 처리가 가장 피해가 적은것으로 조사되었다. 가장 낮은 토양내 유충 수는 토양비멸균+농약+비료 (NSMF) 처리구로 나타났다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
미생물 배양액 처리구인 토양멸균+미생물+게껍질 (SMC), 토양비멸균+미생물+게껍질 (NSMC) 처리구가 비료 처리구인 토양비멸균+비료(NSF) 처리구 보다 난낭의 수가 상당 히 낮게 조사된 것으로 보아 미생물 배양액이 선충의 피해를 줄인것으로 보여진다. 하지만 뿌리혹 수 결과와 마찬가지로 약재(선충탄)와 미생물 혼합 처리구에 비해서는 다소 약한 것으로 조사되었다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
토마토 생초장에서 1차 조사에서 토양비멸균+미생물+게껍질(NSMC) 처리구가 가장 높게
나타났고, 토양멸균+미생물+게껍질(SMC) 처리구가 가장 낮게 나타났다. 2차 조사에서는 SMC 처리구가 가장 높게 나타났다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
토마토 생체중에서 1차 조사에서 토양비멸균+미생물+게껍질(NSMC) 처구가 가장 높게 나 타났고, 그 다음으로 토양멸균+미생물+게껍질(SMC) 처리구, 토양비멸균+비료(NSF) 처리 구, 토양비멸균+농약+미생물(NSMP) 처리구 및 토양비멸균+농약+비료(NSMF) 처리구 순 으로 나타났다. 2차 결과 SMC 처리구, NSMC 및 NSMP 처리구가, NSF 처리구와 NSMF 처리구 보다 생육정도가 좋았다. 토마토 건체중 조사 결과 1차 조사와 2차 조사에서 토마 토 생체중의 결과와 유사한 경향을 보였다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
Chitinase 활성 1차 조사에서 토양멸균+미생물+게껍질(SMC) 처리구가 가장 높게 나타났다. 2 차 조사에서 SMC 처리구가 가장 높게 나타났고，토양비멸균+농약+비료(NSMF) 처리구에 서 가장 낮게 나타났다. 젤라틴분해효소(gelatinase) 활성을 조사한 결과 1차 및 2차 조사에서 SMC 처리구가 가장 높게 나타났다.
(2) 작물체 peroxidase 및 polyphenol oxidase
Peroxidase (POD)활성을 조사한 결과 1차 조사에서 토양비멸균+비료(NSF) 처리구에서 가장 높 게 나타났다. 2차 조사 결과는 1차 조사의 효소 활성 결과 값보다 낮게 조사되었다. Polyphenol oxidase (PPO) 활성을 조사한 결과 1차 조사 결과와 2차 조사 결과가 상반되고, 일관 성이 보이지 않았다.
(3) 작물체 P-l,3-glucanase 및 chi仕nase
키틴틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서 토양비멸균+미생물+게껍질(NSMC) 처리구가 가장 높게 나타났다. 2차 조사 결과 NSMC 처리구가 가장 높게 나타났다. 글루칸 효소(glucanase) 활성을 조사한 결과 2차 조사에서 NSMC 처리구가 252.54 Unit/g FW로 가장 높게 나타났다.
(4) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 수
2차 조사 결과 토양내 키틴분해 미생물 수는 토양멸균+미생물+게껍질(SMC) 처리구에서 140 (xlO5 CFU/g soil) 개체수로 가장 높게 나타났다. 가장 낮은 키틴분해 미생물 수로는 토양비멸균+농약+미생물(NSMP) 처리구로 나타났다. 2차 조사 젤라틴분해 미생물 개체수 는 키틴분해 미생물 개체수와 유사한 경향을 보였다.
1-2. 토마토 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (2차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
L. capsid YS1215 배양액 처리가 토양 내 선충 유충에 미치는 영향을 조사한 결과 5주째
비료(F) 처리구와 물(W) 처리구에서 681.3 개，621.3 개로 각각 조사되었다. YS1215 배양 액을 포함하는 미생물+유기충제500(M+500)，M+1,000, M 처리구에서 410.7 개, 483.6 개， 494.7 개를 각각 나타냈다. 8주째에도 비슷한 결과를 보였으며 F 처리구에서는 525.3 개로 가장 높게 조사되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
난낭수를 측정한 결과 5주째 1차 조사에서 M+500 처리구에서 가장 낮은 난낭수를 나타내 었고 M+1,000, M, F 처리구의 순으로 측정되었다. 8주째에는 M+500 처리구가 가장 낮았 고 F 처리구가 가장 많은 난낭수를 보였다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
5주째 토마토 지상부 길이는 M 처리구가 가장 높았다. 8주째 2차 측정에는 역시 M 처리 구가 52.5 cm로 가장 높았으며 W 처리구가 초장이 가장 낮았다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
토마토 작물의 생체중을 측정한 결과 5주째에는 M 처리구가 가장 높았고，그 다음으로 F 처리구，M+500 처리구 순으로 나타났다. W 처리구는 가장 낮은 것으로 조사되었다. 8주째 에는 M 처리구가 가장 높았고，W 처리구가 가장 낮은 것으로 조사되었다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
Chitinase activity 결과는 M 처리구에서 가장 높은 수치를 보였고 F, W 처리구가 낮은 수 치를 나타냈다. Gelatinas activity 결과도 8주째에 1.28 Unit/g soil로 M 처리구에서 가장 높은 수치를 보였고 F, W 처리구가 낮은 수치를 나타냈다.
(2) 작물체 peroxidase 및 polyphenol oxidase
POD 활성은 5주차 및 8주차에 F 처리구가 가장 높았으며，M 처리구가 가장 낮은 수치를 보였다. PPO 활성은 5주차에 M 처리구가 가장 낮았으며 W 처리구가 가장 높은 수치를 나타냈고 F 처리구가 두 번째로 높았으며，8주차에는 M+500 처리구가 가장 낮았고 W와 F 처리구가 가장 높았다.
(3) 작물체 P_l，3-glucanase 및 chitinase
Chitinase 활성은 5주차에 M+500 처리구가 가장 높았으며，그 다음은 M 처리구 였으며， M+1,000 처리구가 가장 낮은 수치를 보였다. 8주차에는 5주차에서 가장 높았던 M+500 처 리구가 가장 낮은 수치를 보였다. P-l，3-glucanase 활성은 5주，8주 모두 W 처리구가 가 장 높은 수치를 나타냈고 5주차에 비해 8주차때 수치가 증가하였다. 그리고 가장 낮은 수 치는 5주, 8주차 모두 M 처리구로 나타났다.
(4) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 수
Chitinolytic bacteria의 경우 5주차에 M 처리구에서 6.0 x 102 * 4 CFU/g soil로 다른 처리구 에 비해 높은 수치를 보였고 W 처리구는 M 처리구에 비해 낮은 것으로 조사되었다. 8주 차에도 M 처리구가 가장 높게 조사되었다. Gelatinoly仕c bacteria의 경우 8주차에 M 처리 구가 가장 많았고, F 와 W 처리구가 가장 낮았다.
2. 멜론 작물
2-1. 멜론 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (1 차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
토양내 유충 2차 조사에서 토양비멸균+비료(NSF) 처리구가 토양멸균+미생물+게껍질(SMC) 처리 구 및 토양비멸균+미생물+게껍질(NSMC) 처리구 보다 낮게 조사되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
2차 조사 NSMC 처리구의 난낭수가 같은 미생물 배양액 처리구인 SMC 처리구 보다 상당 히 낮은 것으로 조사되었다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
조사 결과 멜론 생초장에서 1차 조사에서 NSMC 처구가 가장 높게 나타났고, 토양비멸균+ 농약+비료(NSMF) 처리구가 가장 낮게 나타났다. 2차 조사에서는 SMC 처리구가 86.9 cm 로 NSMC 처리구가 86.8cm，토양비멸균+농약+미생물(NSMP) 처리구가 86.8cm로 같거나 차이가 나지 않았다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
조사 결과 멜론 1차 조사에서 생체중은 SMC 처리구가 가장 좋았다. 하지만 농약 처리구 인 NSMP 및 NSMF 처리구는 생체중이 매우 낮았다. 2차 조사 에서는 NSMC 처리구가 가장 높았고，1차 조사시 생육 상태가 매우 불량하였던 NSMP 처리구가 생체중에서 많은 증가를 보였다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gela吐nase 활성 측정
키틴틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서 NSMC 처리구가 0.18 Unit/g soil로 가장 높게 나타났다. 2차 조사 결과 NSMC 처리구가 1차 조사와 다르게 키틴분해효소활성 이 가장 낮게 나타났다. 젤라틴분해효소(gelatinase) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서 SMC，처 리구가 1.32 Unit/g soil로 가장 높게 나타났고，2차 조사 결과는 1차 결과와 유사한 경향을 보였다.
(2) 작물체 peroxidase 및 polyphenol oxidase
Peroxidase(POD) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서 NSMC 처리구에서 0.82 Unit/g 표류로 가장
높게 나타났다. 2차 조사 결과 1차조사 결과 보다 낮은 효소 활성을 보였다. 병방제 효소인
polyphenol oxidase(PPO) 활성을 조사한 결과 2차 조사 결과 NSF 처 리구에서 가장 높게 나타 났다.
⑶ 작물체 P-l,3-glucanase 및 chitinase
키틴틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 NSMF 처리구가 가장 높게 나타났고，NSMC 처 리구가 가장 낮게 나타났다. 글루칸분해효소(glucanase) 활성을 2차 조사 결과 NSF 처리구에 서 79.08 Unit/g FW로 가장 높게 나타났다.
(4) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 수
토양내 키틴분해 미생물 수는 SMC 처리구에서 가장 높게 나타났고, 젤라틴분해 미생물 수 또한 가장 높게 나타났다.
2-2. 멜론 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (2차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
1차 조사와 2차 조사의 뿌리혹 수 결과 및 난낭 수의 결과와 유사한 경향을 보였다. 하지만 뿌리혹 수 및 난낭 수가 미생물+농약(M+P) 및 농약(P) 처리구에서 검출이 되지 않았지만，토양내 유충은 1 차 및 2차 조사 모두에서 검출이 되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
뿌리혹 수 1차 조사 결과 물(W) 처리구에서 가장 높은 혹 개수를 보였고 M+P 및 P 처리 구에서는 뿌리혹 수가 조사되지 않았다. 2차 조사결과는 1차 조사 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한 뿌리혹 수 결과와 난낭 수의 결과는 유사한 경향을 보였다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
조사 결과 멜론 생초장에서 1차 조사에서 M+P 처리구에서 가장 높은 생초장을 보였고 W 처리구가 가장 낮게 조사되었다. 2차 조사에서는 미생물(M) 처리구 71.0 cm, 미생물+게껍 질(M+C) 처리구 63.7 cm, M+P 처리구 88.3 cm, 근 처리 82.9 cm 및 W 처리구 58.0 cm로 조사되었으며, M+P 처리구에서 가장 높은 생초장을 보였고 W 처리구가 가장 낮게 조사되 었다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
생체중 및 건조중에서 1차 및 2차 조사에서 M 처리구에서 가장 높은 생체중을 보였고 P 처리구가 가장 낮게 조사되었다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정 (1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
키틴틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서 M+C 처리구가 가장 높게 나타났다. 2차 조사 결과 M 처리구 1.42, M+C 처리구 1.42, M+P 처리구 1.42, 모 처리 1.17 및 W 처
리구 1.14 Unit/g soil로 W 처리구가 가장 낮게 조사 되었다. 젤라틴분해효소 (gelatinase) 활 성을 조사한 결과 1차 조사에서 에서 M+C 처리구가 가장 높게 나타났다. 2차 조사 결과 M 처리구 1.18, M+C 처리구 1.26, M+P 처리구 1.25, 모 처리 1.24 및 W 처리구 1.18 Unit/g soil로 W 처리구가 가장 낮게 조사 되었다.
(2) 작물체 peroxidase 및 polyphenol oxidase
Peroxidase(POD) 활성을 조사한 결과 2차 조사 결과 M 처리구 0.31，M+C 처리구 0.23, M+P 처리구 0.24, 모 처리 0.21 및 W 처리구 0.21 Unit/g FW로 W 처리구가 가장 낮게 조사 되 었다. Polyphenol oxidase(PPO) 활성을 2차 조사 결과 M 처 리구 2651.1，M+C 처 리구 3312.0, M+P 처리구 3137.8, P 처리 2874.3 및 W 처리구 3211.1 Unit/g FW로 M 처리구가 가장 낮게 조사 되었다.
(3) 작물체 P-l,3-glucanase 및 chi仕nase
키틴틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 1차 조사에서는 처리구간 활성 차이가 거의 나타나지 않았다. 하지만 2차 조사 결과 M 처 리구 3.26, M+C 처 리구 3.15, M+P 처 리구 4.46, 모 처리 4.56 및 W 처리구 2.84 Unit/g 표류로 W 처리구가 가장 낮게 조사 되었다. 글루칸분해효소 (glucanase) 활성을 2차 조사 결과 는 W 처리구에서 가장 높게 나타났고，그 다음으로 M+P, M, P, M+C 순으로 조사되었다.
(4) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 수
1차 조사 결과 항선충 미생물 배양액을 주기적으로 관주한 M처리구는 키틴분해미생물의 개체수가 M 처리구 5x10⁶ CFU/g soil, M+C 처리구 5x10⁶ CFU/g soil, M+P 처리구 3x10⁶ CFU/g soil, P 처리구 2x10⁶ CFU/g soil 및 W 처리구 OxlO6 CFU/g soil로 조사되었고，2 차 조사는 M 처리구 11.7x10⁶ CFU/g soil, M+C 처리구 7.7x10⁶ CFU/g soil, M+P 처리구 10.3x10⁶ CFU/g soil, P 처리구 2.3x10⁶ CFU/g soil 및 W 처리구 3.3x10⁶ CFU/g soil로 M 처리구에서 가장 높게 나타났다. 젤라틴분해미생물 개체수는 1차 및 2차 조사 모두 M 처 리구가 가장 높게 나타났으며，물 처리구가 가장 낮게 조사되었다.
제 4 절 포장에서 항선충 미생물 대량배양복합체 시용에 따른 효능 연구
1. 토마토 작물
1-1. 토마토 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (1 차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
조사 결과 초기 선충의 피해 정도를 알 수 있는 1차조사 결과에서는, 배지를 처리한 대조 구(C)의 유충밀도가 가장높았고，정식 후 2개월이 경과한 2차조사 결과에서는 합성농약을 처 리한 P(농약) 처 리구에서 유충밀도가 가장높았다. 그리고 토마토 수확기인 정시 후 3차 조사에서는 주기적으로 물을 처리한 NT(물) 처리구의 토양내 선충 유충밀도가 가장 높은 것으로 조사되었다. 더불어, 3차조사 결과 가장 낮은 선충 유충의 밀도를 보인 처리구로는
MP(항선충미생물 대량배양복합체 배양액+농약) 처리구였다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
뿌리혹 수는 3차조사에서 MP 처리구가 가장 낮았다. 난낭 수에서는 M(항선충미생물 대량 배양복합체 배양액)，MP 및 P 처리구에서 각각 1.7개，1.3개, 1.7개로 조사된 반면에 C 처 리구 및 NT 처리구에서의 난낭 수는 4.7개 및 3.8개를 나타냈다. 뿌리혹선충 알 수에 있어 서도 뿌리혹수 및 난낭 수의 조사 결과에 같은 경향을 보였다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
정식 후 8주차 2차조사에서 M처리구의 초장이 가장 높은 초장을 보이며 생육이 양호하였 다. 그러나 포장 실증시험의 특성 상 편차범위가 넓어 처리구간의 통계적 유의성은 없었다. 하지만, 항선충 미생물의 주기적 살포로 인한 작물체 생육은 양호한 것으로 판단된다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
정식 후 8주차 생체중을 조사한 결과에서는 배지처리구인 대조구 및 미생물을 주기적으로 관주처 리한 M처리구의 생체중이 가장 높았다.
(3) 수확량 및 품질조사
실험구 별 주당 평균수량을 조사한 결과 화학약제 방제 후 항선충미생물 대량배양복합 체 현장배양액을 주기적으로 처리한 MP에서 주당 수량이 가장 높았고，C 처리구 및 화 학약제 방제후 물을 주기적으로 처리한 P 처리구에서 상대적으로 낮았다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
조사 결과 M 처리구가 chitinase 및 gelatinase 활성 이 가장 높게 나타났다.
(2) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 개체수 변화
M 처리구에서 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 개체 수가 가장 높게 나타났다.
라. 토양의 이화학적 특성 변화
(1) 토양산도 및 전기전도도 변화
실험 전 토양에 비해 토마토 정식 후 토양 pH는 전체적으로 감소하는 경향을 보였다. 반면에, 토마토 생육과정별 토양의 전기 전도도(E.C) 변화는 M 처리구 및 C 처리구의 전기전도도 값이 NT 처리구에 비해 높았으나 그 값은 실험 전 토양에 비해 낮은 수 치였다.
(2) 토양유기물 및 유효인산 함량의 변화
M 처리구에서 토양 유기물 함량은 실험전 정식 60일까지 낮아지 다가 정 식 90부터 상승
하는 경 향을 보였다. 토양 유효인산 함량은 P 처리구와 NT 처리구를 제외하고，수확 후 유효인산 함량이 실험 전 유효인산 함량보다 높게 나타났다.
마. 농가 현장 배양액내 미생물 개체수 조사
항선충 미생물 대량배양복합체 배양액 내의 키틴분해미생물(chitinolytic bacteria) 밀도변화를 조사한 결과 1.0에서 1.8 x 10⁶ CFU/ml의 개체수를 보였다.
1-2. 토마토 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (2차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
토양내 유충밀도는 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액(M) 처리구가 관행 처리구인 대 조구(C)에 비해 낮게 조사되었다. 또한 수확 후에도 대조구에 비해 낮은 밀도의 유충 수를 유지하는 것으로 조사되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
항선충 미생물 대량배양복합체 처리에 따른 토마토 뿌리에 생성된 뿌리혹 수，난낭 수 및 알 수를 검정한 결과，항선충미생물 대량배양복합체 처리로 인한 뿌리혹선충의 피해 예방 은 효과적인 것으로 사료된다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
토마토의 초장이 M 처리구에서 67.6 cm, 145.2 cm로 조사 되었으며，C 처리구에서 62.2 cm, 135.9 cm로 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 주기적으로 처리한 실험구의 생 육이 다소 우세하였다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
생체중을 조사한 결과에서 M 처리구가 110.4 g, 507.3 g으로 C 처리구에 102.9 g, 502.2 g 에 비해 높게 나타났다. 정식후 8주차 건체중 조사에서는 M 처리구의 건조중이 77.6 g으 로 대조구(C)의 76.6 g에 비해 높았다.
(3) 수확량 및 품질조사
항선충 미생물을 농가현장에서 대량배양 후 배양미생물을 주기적으로 관주처리 한 후 처리 구 별 주당 수량을 비교한 결과, M 처리구의 수량이 농가관행 대비 89.2%로 다소 낮았다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gela仕nase 활성 측정
M 처리구에서 chitinase 및 gelatinase 활성 이 다른 처리구에 비해 높게 나타났다.
(2) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 개체수 변화
M 처리구가 대조구인 C 처리구 보다 토양내 키틴분해 미생물 및 젤라틴분해 미생물 개체
수가 높은 것으로 나타났다.
라. 토양의 이화학적 특성 변화
(1) 토양산도 및 전기전도도 변화
토양 pH는 M 처리구 및 C 처리구에서 각각 정식 45일까지 증가하다가 감소하였고，전기 전도도(EC)는 정식 15일까지 증가하다 감소하였다. 하지만 C 처리구에서 수확후 전기전도 도는 약간 증가 되었다.
(2) 토양유기물 및 유효인산 함량의 변화
유효인산은 정식전 토양에 비해 증가의 경향을 보였고, 유기물 함량도 시험 전 토양에 비 해 증가하였으나，토양의 염류축적은 없었다.
마. 농가 현장 배양액내 미생물 개체수 조사
항선충 미생물 대량배양복합체 배양액(M) 내의 키틴분해미생물(chi仕nolytic bacteria) 밀도변 화를 조사한 결과 1.5에서 2.3 x 10⁶ CFU/ml의 개체수를 보였다.
2. 멜론 작물
2-1. 멜론 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (1 차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
토양내 유충밀도에서 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액(M) 처리구가 관행 처리구인 대조구(C)에 비해 낮게 조사되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
토양내 유충밀도에서 M 처리구가 관행 처리구인 C에 비해 낮게 조사되었다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
생체중을 조사한 결과 항선충 미생물 대량배양복합체 처리구가 관행 처리에 비해 상당히 높게 나타났다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
정식후 8주차 건체중 조사에서는 M 처리구의 건조중이 687g으로 대조구의 66.6g에 비해 높았다.
(3) 수확량 및 품질조사
항선충미생물 대량배양복합체 배양액 처리구의 건조중이 4,210 g으로 대조구의 3。45 g에 비해 높았다.
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
토양 내 키틴분해효소(chitinase) 활성을 조사한 결과 M 처리구가 다른처리구에 비해 높게 났고，gelatinase 활성 또한 높게 나타났다.
(2) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 개체수 변화
항선충 미생물 배양액을 주기적으로 관주한 M처리구는 키틴분해미생물의 개체수가 1차: 16.3 (xlO6 CFU/g soil), 2차: 20 (xlO6 CFU/g soil)로 조사되었고，젤라틴분해 미생물 수는 1차: 32.4 (xlO6 CFU/g soil), 2차: 33.4 (xlO6 CFU/g soil)로 조사되 었다.
라. 토양의 이화학적 특성 변화
(1) 토양산도 및 전기전도도 변화
pH와 EC에서 거의 변화가 없었다. 하지만 평균적으로 M 처리구가 C 처리구보다 pH와 EC에서 높게 나타났다.
(2) 토양유기물 및 유효인산 함량의 변화
M 처리구에서 토양 유기물 함량과 유효인산 함량이 C 처리구 대비 다소 증가한 결과를 보였다.
마. 농가 현장 배양액내 미생물 개체수 조사
항선충 미생물 대량배양복합체 배양액 내의 키틴분해미생물(chitinolytic bacteria) 밀도변화를 조사한 결과 1.0에서 1.3 x 10⁶ CFU/ml의 개체수를 보였다.
2-2. 멜론 작물에서의 선충 억제 활성 및 작물 생장 효과 조사 (2차실험)
가. 작물체 선충 억제 활성
(1) 토양내 선충 밀도 억제 효과
토양내 유충밀도에서 10주차 조사 결과 항선충미생물 대량배양복합체 처리구(M) 25.7개, 미생물 대량배양복합체 배양액+농약 처리구(M+P) 27.7개，농약 처리어) 105.3개, 물 처리 (NT) 88.0개，로 M 처리구가 가장 낮게 조사되었으며，NT 처리구가 가장 높게 조사되었다.
(2) 작물체 선충감염 억제효과
조사 결과 M+P 처리구가 가장 낮게 조사되었으며，NT 처리구가 가장 높게 조사되었다. 난낭 수를 조사한 결과에서는 항선충 미생물 대량배양복합체 배양액을 주기적으로 처리구 가 가장 낮은 난낭 수를 보였다.
나. 작물체 생장 효과
(1) 지상부 생초장
M 처리구 165.0 cm, M+P 처리구 177.0 cm, P 처리구 147.0 cm, NT 처리구 140.0 cm로 M+P 처리구가 가장 높게 조사되었으며，NT 처리구가 가장 낮게 조사되었다.
(2) 지상부 생체중 및 건조중
생체중 및 건체중에서 M+P가 가장 높게 조사되었으며，NT 처리구가 가장 낮게 조사되었 다.
(3) 수확량 및 품질조사
다. 토양 내 및 작물체 효소 활성 및 토양 미생물 측정
(1) 토양내 chitinase 및 gelatinase 활성 측정
조사결과 chitinase 및 gelatinase 활성에서 미생물 처리구인 M과 M+P 처리구의 효소 활 성이 다른 처리구에 비해 높게 나타났다.
(2) 토양 키틴분해미생물 및 젤라틴분해미생물 개체수 변화
10주차 조사 결과 키틴분해미생물 수에서 M 처리구가 가장 높았고, 그 다음으로 M+P, NT 및 P 처리구 순으로 나타났다. 젤라틴분해미생물 수에서는 M 처리구가 가장 높았고， 그 다음으로 M+P로 나타났고，NT 및 P 처리구는 같게 조사되었다.
라. 토양의 이화학적 특성 변화
(1) 토양산도 및 전기전도도 변화
토양의 화학성 변화를 조사한 결과，시험 전 토양에 비해 PH는 감소한 반면, 전기전도 값은 증가하였다.
(2) 토양유기물 및 유효인산 함량의 변화
시험 전 토양에 비해 유기물이 증가하였고, 또한 유효인산, 치환성 양이온 값도 증가하였다.
마. 농가 현장 배양액내 미생물 개체수 조사
항선충 미생물 대량배양복합체 배양액 내의 키틴분해미생물(chitinolytic bacteria) 밀도변화를 조사한 결과 1.8에서 2.3 x 10⁶ CFU/ml의 개체수를 보였다.
제 5 절 항선충 미생물 대량배양복합체 제품화 및 판매
1. 개발된 미생물제제, 액비 및 배양체 등록시험 가. 미생물 보조영양원 (액비) 등록시험 (1) 비해시험 1건, 작물재배시험 1건，보증성분 및 유해성분 분석 시험
■ 재배시험 의뢰 : 재배시험 결과 ‘양호함’의 결과가 나왔다.
■ 분석 시 험 의 뢰 : 시험결과 수용성붕소는 0.07%, 수용성몰리브덴은 0.0014%로 기준치 보다 많은 양이 검출 되었다.
나. 토양미생물제제 등록시험
(1) 작물재배시험 1건, 약해시험 1건 (가) 유기농업자재 등록시험 ① 미생물 동정 및 균수 측정
동 정 결 과 : Lysobacter capsid 생균수 밀도 : 2.0 * 10⁸cfu/ml
② 병원성미생물 시험 : 병원성대장균을 포함한 5개의 병원성 미생물이 불검출 되었다.
③ 인축독성시험 : 급성경구, 급성경피 시험 결과 중독 증상 및 치사가 없었으며 안점막자극성, 피 부자극성 역시 자극지수가 0이 었다.
④ 환경독성시험 : 급성어류독성시험 결과 ‘시험 동물 치사 없음’의 결과가 나왔다.
⑤ 작물재배시험의뢰 : 작물재배 시험을 지역을 달리하여 2회 실시 하였고 ‘양호함’의 결과가 나왔 다.
⑥ 비 해시 험 : 비해시험 결과 ‘비해 없음’의 결과가 나왔다.
⑦ 약해시 험 : 약해시험 결과 ‘약해 없음’의 결과가 나왔다.
다. 젤라틴/키틴 배양체 등록시험 (1) 작물재배시험 1건，보증성분 및 유해성분 분석 시험
■ 재배시험 의뢰 : 재배시험 결과 ‘양호함’의 결과가 나왔다.
■ 분석시험 의뢰 : 시험결과 수용성붕소는 0.10%，수용성몰리브덴은 0.00082%로 기준치 보다 많 은 양이 검출 되었다.
2. 대량배양복합체 개발 관련기술의 특허, 시제품 및 마케팅 전략 수립 가. 작물별 희석배율 및 사용 매뉴얼 작성
나. 항선충 미생물 대량배양복합체 상표 및 특허 출원
(1) 특허출원 - 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS 1 2 1 5를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제와 그 제조방법
(2) 특허출원 - 항선충 미생물 대량배양 복합체
(3) 특허출원 - 리소박터 캡시시 배양 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 선충 방제용 조성물
다. 시장 분석을 통한 마케팅 전략 수립 및 수행
마케팅 전략을 수행하기 위해 먼저 광주 인근 농협들의 주요 재배 작물을 파악하고，대상의 환경 에 맞는 홍보 및 교육 프로그램을 제작하여 마케팅을 실행 하였다.
라. 시제품을 통한 실제 시범포 운영, 검증
전남 나주시, 담양군 등등의 농가 현장에서 시제품을 사용하여 작물을 재배하고 효능을 검증하였다.
3. 항선충 미생물 대량배양복합체의 제조공정 설계 및 품질관리 계획 설정 제품의 제조 공정 및 품질 관리 계획서를 작성하여 공장에 비치하고 공정따라 생산하고 제품의 품 질을 관리 한다.

Abstract ▼

For fulfillment of this project, anti-nematode microorganism was isolated from soil and identified as Lysobacter capsici YS1215 (NCBI accession number: HQ610445) based on the 16S rRNA sequence analysis. L. capsici YS1215 produced chitinase, gelatinase, cellulase, indol-acetic acid (IAA) and 2,4-diac

For fulfillment of this project, anti-nematode microorganism was isolated from soil and identified as Lysobacter capsici YS1215 (NCBI accession number: HQ610445) based on the 16S rRNA sequence analysis. L. capsici YS1215 produced chitinase, gelatinase, cellulase, indol-acetic acid (IAA) and 2,4-diacetylpbloroglucinol (DAPG). Egg hatch inhibition and juvenile mortality of root-knot nematode occurred with 50% culture filtrate of L. capsici YS1215 after 5 days incubation. The chitinase and gelatinase activities were induced by each supplement of root-knot nematode eggs or juveniles into growth media. These results were confirmed by analysis of N-acetyl-D-glucosamine and amino acid contents in culture broth by HPLC or amino acid analyzer. Chitinase, purified with column chromatography, having 43.6 kDa of molecular mass was found to inhibit egg hatch of root-knot nematode. Juvenile mortality of root-knot nematode occurred with Gelatinase having 255.7, 232.1 and 14604 purified with column chromatography. Purified, and identified 2-hydroxypropanoic acid (lactic acid) using HPLC, GC-MS, LC-MS and NMR was extracted with etylacetate from culture broth of L. capsici YS1215 was found to cause egg hatch inhibition and juvenile mortality of root-knot nematode. Optimum shelf life for L. capsici YS1215 was obtained with the use of crab shell powder instead of TSB media. The basic medium composition for making a prototype consists of L-monosodiumglutamate(MSG) l.Og/L, Yeast extract 1.0g/L, Sucrose 30.g/L, KH2P04 1.4g, (NH4)2SO4 1.0g, CaCO3 1.0g, MgSO4 0.3g, CuSO4 O.02g, ZnS04 O.02g, FeCl3 O.03g, crab shell powder O.8g, gelatin O.2g, microbial secondary nutrients (liquid fertilizer) 4ml, and 1ml stock solution of L. capsici YS1215 with growth temperature of 30℃.
In pot experiment of second year, height and fresh weight of tomato plant was highest in treatment of anti-nematode-mass culture complex+ crab shell powder (SMC) while nematicide treatment was lowest to damage root-knot nematode infection as compare to SMC and fertilizer treatment. Highest number of chitin and gelatin decomposing microorganisms was found in SMC treatment. In addition, results of plant growth and damage of root-knot nematode infection were found similar in both melon pot experiment and tomato pot experiment. In pot experiment of third year, height and fresh weight of tomato plant was the highest in treatment of anti-nematode-mass culture complex (M), while as to damage of root-knot nematode infection, M+organic pesticide 500 (M+P500) treatment was lower than other treatment. In pot experiment of third year, height of melon plant was highest in treatment of M+ pesticide (M+P), and fresh weight of melon plant was highest in M treatment, while as to damage of root-knot nematode infection, M + P treatment was the lowest.
In the field experiment of second year, height and fresh weight of tomato plant was highest in treatment of anti-nematode-mass culture complex (M), while as to damage root-knot nematode infection, M treatment was lower than fertilizer and water treatments, but higher than nematicide treatment. The result of productivity research showed that tomato yield in M+P treatment was the highest, while high quality of fruits was found in M treatment along with highest number of chitin and gelatin decomposing microganisms.
Soil physiochemical properties like pH and EC values in M treatment were lower than before each application, while organic matter and available phosphorus were lower than before treatment. In field experiment of third year, growth of tomato plant was higher in M treatment than fertilizer treatment, while as to reduce damage of root-knot nematode infection; M treatemnt was lower than ferfilizer treatment. In field experiment of second years, gowth of melon plant was higher in anti-nematode-mas culture complex (M) treatment than fertilizer treatment, while as to reduce root-knot nematode infection; M treatment was lower than fertilizer treatment. Results in field experiment of second year were similar to the field experiment of third year.
In pot experiments, as results of peroxidase and polyphenol oxidase activities, the relationship between their activities and nematode infection was not only difficult to find out, particularly, but also as antioxidant enzymes and disease resistance enzyme such as chitinase and β-1,3-glucanase, and in field experimants. In pot experiments, enzyme activities and nematode infection was found to relate with soil chitinase and gelatinase activities.
In conclusion, for management of root-knot nematode, anti-nematode-mass culture complex was appliied on the nematode site infection and damage could be resuced if it continues to use.