초록 ▼

Ⅴ. 연구개발결과
1) 항비만기능성 Screening 결과
① 3T3L-1 in vitro 시험
○ 추출물
● 흑삼 1-9포 열수추출물: 농도의존적으로 세포생존율 증가. 지질축적도 영향이 없음.
● 흑삼 1-9포 에탄올추출물: 5포와 9포 중 5포의 결과가 진피추출물와 함께 3T3L-1 세포생존율 및 지질 축적 모두 농도 의존적으로 유의적으로 감소.
● 녹두껍질 및 검정콩껍질 에타놀추출물: 300ug/ml까지 증가하여도 세포의 생존율에는 변화가 없으며 고농도 처치시 세포내의 지질축적은 50%까지 감소

Ⅴ. 연구개발결과
1) 항비만기능성 Screening 결과
① 3T3L-1 in vitro 시험
○ 추출물
● 흑삼 1-9포 열수추출물: 농도의존적으로 세포생존율 증가. 지질축적도 영향이 없음.
● 흑삼 1-9포 에탄올추출물: 5포와 9포 중 5포의 결과가 진피추출물와 함께 3T3L-1 세포생존율 및 지질 축적 모두 농도 의존적으로 유의적으로 감소.
● 녹두껍질 및 검정콩껍질 에타놀추출물: 300ug/ml까지 증가하여도 세포의 생존율에는 변화가 없으며 고농도 처치시 세포내의 지질축적은 50%까지 감소하는 경향. 검정콩 추출물(100-1000 ug/ml)은 농도의존적으로 PPAR-r, C/EBP-a와 지방구내 지질합성 key-Enz인 ACC발현을 억제함.
● 톳, 미더덕, 다시마 & 감태 에타놀추출물: 톳은 세포생존율과 지질축적형상에 영향이 없으며 미더덕은 대조군보다 지방세포 분화 및 증식효과가 200%이상임. 감태의 경우 세포생존율 변화없이 300ug/ml에서 지질축적이 현저히 저하하여 가장효과적임. 다시마로부터 추출된 3종류의 표지물질 (glutamate 7%, GABA 5%, Glutamate:GABA= 5:5)추출물중에서 glutamate7%가 PPARr, HSL 단백질 발현에 효과적.
○ 표지물질
● 녹두와 검정콩의 표지물질인 vitexin과 C3G/D3G 처치: vitexin 50-200uM, C3G/D3G 100-200uM농도에서 지질 축적이 50-60%로 감소하여 추출물과 표지물질의 경향이 일치함. C3G 200uM 투여 시 proinflammation marker인 TNF-a 를 감소, 항염증인자인 IL-10을 증가시킴. D3G는 100uM까지 IL-10을 증가시키다가 200 uM에서 감소.
● 감태추출물의 Dieckol: 25, 50, 100 μg/ml 의 농도로 처리하였을 때, 대조군에 비하여 농도의존적으로 oil red 염색부위가 감소하는 것을 확인함.
● 감태추출물의 유효 물질인 eckol, phloroglucinol, dieckol: phloroglucinol은 IC₅₀: >5 mM, eckol은 IC₅₀: 1.3 mM, dieckol은 IC₅₀: 315 μM을 나타내어, dieckol이 ACE 저해활성에 있어 다른 유효 물질보다 우수함
② ATMΦs & Co-culture model 시험
○ ATMΦs model
● 수산물: 감태추출물 100-300ug/ml은 대조군에 비하여 M1인자인 TNF-a, MCP-1을 200%이상 억제하였고 미더덕 추출물 75-300ug/ml은 TNF-a을 200%이상 억제함.
● 농산물: M2를 증가시키거나 유사한 효과를 가지는 소재로 흑삼 5포, 진피가 적은용량 75ug/ml에서 대조군보다 증가하였음. M1과 M2의 효과를 동시에 보이는 물질은 감태가 유일하였음.
○ Co-culture model
● 3T3L-1에 insulin 처치 2일후 RAW264와 HepG2 cell을 injection하여 배양 9일 째 Contact co-culture system: 녹두 추출물은 marcrophage에 의하여 TNF-a, Il-6 모두 증가하였고 HepG2에 의하여 TNF-a, Il-10은 큰 변화가 없고 IL-6는 크게 증가함. 다른 추출물은 조건확인이 어려움.
● 3T3L-1에 insulin 처치 2일후 RAW264 injection에 의한 contact Co-Culture후 9일 째 염증인자 M1형 (MCP-1)과 M2형 (Il-10) 분비능 결과: 흑삼 5포와 진피추출물을 처치 시 농도가 증가할수록 M1도 약간 증가하였으나 M2가 M1보다 더 많이 증가함. 검정콩의 경우, 주정추출물보다 표지물질인 D3G 100uM의 항염증 효과가 매우 큼. 반면, 감태는 고농도에서 M1과 M2가 감소하나 M1이 더 증가함. 미더덕은 M2가 증가하다가 고농도에서 감소하였으나 M2가 M1보다 더 증가함.
③ H & E staining 과 mast cell IHC screening법
● 대조군에 비하여 HF군의 세포크기가 증가하였고 orlistat는 감소함. 추출물 중에는 흑삼 5포와 9포를 제외하고 대체적으로 HF보다 크기가 감소함.
● 대조군에 비하여 mast cell이 증가한 군은 HF, 흑삼 5포, 미더덕, 진피 등 이었고 대조군에 감소한 군은 orlistate임. 녹두, 검정콩, 톳 추출물은 대조군과 유사한 경향을 보임.
● 검정콩추출물의 C3G & D3G는 염증성-대식세포가 지방구를 감싼 crown-like structure (ATMΦs model M1)을 확인하고 자 Epididymal fat에서 Galectin-3 (Mac-2)항체를 이용하여 IHC시행한 결과 검정콩 투여로 M1형성이 억제 되었으며 이는 orlistst의 억제효과와 매우 유사함
④ 지방유래 줄기세포모델을 이용한 항염증성 비만 screening
● In vivo 상태에서 피하지방줄기세포와 복부지방줄기세포의 증식 속도를 비만 생쥐의 것에 비하여 감소시키는 표적물질은 흑삼 9포 , 미더덕, 톳이며 이외의 표적물질은 in vivo에서 피하지방줄기세포와 복부지방줄기세포의 증식속도 억제 효능이 없음으로 분석됨.
● 농산물: 흑삼 5포 에타놀추출물이 비만 형성에 미치는 영향: in vivo에서 피하지방줄기세포와 복부지방줄기세포의 증식을 억제하는 효과가 없으나, in vitro에서 피하지방줄기세포의 증식 속도가 감소하는 특징이 있음. 흑삼 9포는 in vivo에서 피하지방과 복부지방 줄기세포의 증식을 억제함.
● 수산물: 미더덕은 in vivo와 in vitro의 모든 상황에서 피하지방줄기세포와 복부지방줄기세포의 증식을 억제함. 톳은 in vivo상태에서는 내장지방 줄기세포의 증식에 필요한 시간이 정상대조군과 유사하게 유지되어 비만 유도과정에서 톳을 처리하지 않은 것에 비하여 증식 속도가 감소하였음. 내장지방줄기세포의 특성이 정상대조군에 비하여 달라지지 않았음.
● 생쥐지방줄기세포이용: 검정콩 및 녹두 추출물은 200μg/ml 농도에서는 유효물질이 생쥐의 지방줄기 세포가 지방세포 로 분화하는 것을 억제. 따라서 생쥐의 줄기세포를 이용한 screening system은 천연물 추출물이 지방줄기세포가 지방세포로 분화하는데 미치는 영향을 분석하는데 사용될 수 있음.
● 사람지방줄기세포이용: 검정콩 추출물은 50μg/ml 농도 이상에서 녹두 추출 물은 200μg/ml 농도에서 유효물질이 사람의 지방줄기세포가 지방세포로 분화하는 것을 억제.
⑤ Yeast based Genomics Biosystem을 이용한 잠재적 항비만 소재 screening
● 뽕잎 (Mulberry Leaf extracts), 오디 (Mulberry Fruit extracts) 및 검은콩 (Black bean testa extracts) 추출물을 각각 yeast cell 내 지방 축적을 억제 시킬 수 있는 가능성이 있음.
● 감태, 미더덕, 녹두 추출물, 톳 추출물, 흑삼 5포 추출물, 흑삼 9포 추출물, 진피의 추출물은 yeast cell 내 지방 축적 억제효과에 유의한 차이를 나타내지 않음.
● 표지물질인 genistein 또한 yeast cell 내 지방축적억제효과에 유의한 차이를 나타내지 않음.
● 검정콩의 표지물질인 C3G & D3G: 효모세포내 total ROS(주로 H2O2)의 생성에 유의한 차이가 없음. C3G는 고농도(100 μM)를 처리했을 때 효모세포에서 mitochondrial superoxide의 발생을 감소시키는 효과를 보여주고 있음. (P value * < 0.05) D3G는 저농도에서 pro-oxidant 활성을 보이고 있으며, 고농도(100 μM)를 처리했을 때만 효모세포내 mitochondrial superoxide 양을 감소시키는 효과가 있으나 통계적 유의성이 약함.(P value * < 0.05) 따라서 결과를 종합해보면 C3G가 고농도에서 항산화 활성이 있음을 알 수 있고, 이 천연물에 대한 발현유전체 정보를 측정함.
⑥ Cox-2 inhibition rate(%)를 이용한 수산물의 항염증 screening (10mM indomethacin 대조)
● 10mM indomethacin의 항염증 활성 67.8%을 기준으로 감태(Ecklonia cava)가 72.8%로 가장 높음.
● 그 외 모자반 57.8%> 큰잎모자반 43.0%> 뼈지누아리 40.8%> 지충이 29.6%> 짝잎모자반 23.5%> 톳 20.1%> 우뭇가사리 13.0%> 진두발 15.0%> 패 3.5% >참까막살 2.4%> 파래 0% 등 순서로 나타남.
2) DIO mouse 모델을 이용한 항비만기전 규명
① 염증유도관련 항산화조절기전
● 고농도 감태추출물(HG)는 투여 6주차 이후 지속적으로 고지방 대조군(high fat diet; HF)과 유의적 차이를 나타났으나 흑삼 5포, 흑삼 9포, 톳은 차이가 없음.
● 부고환, 장간막, 후복막 및 서혜부 지방무게 합 (SUM-I): HF군에 대하여 감태에서 감소. 서혜부 지방(inguinal fat tissue)을 제외한 나머지 3 부위의 지방무게 합 (SUM-II; epididymal, mesenteric, and retroperitoneal fat tissue)은 흑삼과 감태에서 HF군에 비하여 감소.
● 혈중지질개선: 감태는 혈중 TG 및 TC수치 비록하여 동맥경화지수[(TC-HDLc)/HDLc]를 대조군 수준으로 낮춤으로서 지질개선에 효과를 나타냄. 흑삼은 5포보다 9포가 혈중 TG 저하효과를 보인 반면, HDLc는 9포가 더 증가함. TC 및 동맥경화지수는 CON 수준으로 낮춤.
● 지질과산화물 함량: 흑삼은 HF와 유의적인 차이가 없었으나 감태군 중 LG 군에서는 오히려 증가하는 경향을 나타났고 MG에서는 MDA를 낮추는 경향.
② 45% Fat-obese model (10주 DIO+12주 처치, high fat & Orlistat 대조)
● 체지방: 부고환 및 장간막 지방이 감소한 녹두, 진피, 미더덕, 톳 및 검정콩 등의 추출물은 근육량이 증가하여 총 체중의 변화는 없음. 녹두 및 진피추출물: 체중에 비하여 부고환지방(epididymal fat)이 가장 크게 감소한 orlistat와 유사함.흑삼 5 & 9포, 미더덕, 톳: high fat보다는 약간 감소하였으나 orlistat의 효과보다 적은 경향임. 검정콩추출물은 부고환지방 증가, 장간막(mesentric fat) 지방은 가장 크게 감소.
● 혈액수치: HF에 비하여 검정콩추출물만 FBS 및 TC 를 유의적으로 감소(Oristat 수준). 혈중 leptin은 부고환 지방 세포가 감소한 진피 추출물에서 HF에 비하여 유의적으로 감소하였고 흥미롭게도 orlistat는 지방흡수감소, 체지방 감소와 함께 leptin분비도 억제함으로써 향후 leptin resistance이 우려됨.
● 간의 지질함량: HF와 비교하여 간의 TG 함량은 미더덕> 녹두, 흑삼9포, 진피 및 검정콩 > 톳의 순으로 나타남. 간의 TC 함량은 녹두, 흑삼9포, 검정콩> 미더덕> 진피 순으로 미더덕과 톳이 간의 콜레스테롤함량을 저하시킴. 검정콩은 혈중 및 간의 TC를 모두 낮추는 효과를 보인 반면 녹두, 진피 및 톳은 혈중의 지질개선보다 간의 지질은 낮추는 효과를 보임. 따라서 간의 중성지방 합성 혹은 간의 지질 uptake가 감소한 것인지 향후 검증이 필요.
● 지질합성 및 분해(AMPK, ACC, PPARr, SREBP-1, FAS, LPL, HSL, CPT-1, UCP1) 단백질발현: ACC감소 효과는 흑삼 9포, 녹구, 검정콩, 미더덕에서, C/EBP와 PPARr 감소효과는 흑삼과 미더덕에서, AMPK 증가효과는 검정콩, 미더덕, 톳, 감태에서 각각 나타남. 검정콩, 톳 및 감태추출물의 AMPK 발현효과가 가장 크며 톳의 경우 PPARr 발현을 억제함으로써 지방분해효과가 가장 큼. 녹두와 흑삼 9포는 PPARr의 발현이 증가하여 지방세포 증식이 예상됨.
지방합성마커인 FAS와 지방 축적과 관련된 인자인 LPL는 감태군에서 비만대조군에 비하여 농도의존적(100mg/Kg-500mg/Kg)으로 감소함. 또한 지방산의 산화를 촉진하는 CPT1과 열발생 UCP1 단백질발현은 감태의 저농도 처치군에서도 증가하였음.
● 지질합성 및 분해(AMPK, ACC, CPT, SREBP-1, FAS, LPL, HSL) mRNA발현: ACC mRNA 발현 정도는 HF가 가장 크며 Orlistst과 미더덕이 대조군과 비슷한 수준이며 나머지는 지방산 합성인자인 ACC를 억제함. 반면 검정콩과 톳이 HSL mRNA발현을 증가시킴으로써 중성지방분해를 대조군의 200-400배 가량 증가시킴.
● 염증발현인자들 (iNOS2, COX-2, leptin, CRP, p-iKB-a, IKB-a, IL-6, IL-10, TNF-a, 등) 단백질발현: HF에 비하여 검정콩과 톳은 M1인자인 IL-6을 2-3배 가량 증가시키지만 2가지 추출물이 M2 인자인 IL-10을 동시에 발현시킴으로써 M2인자로써 Arg1의 추가분석을 고려중임. P-iKB-a/IKB-a 비율은 HF보다 모두 낮으며 흑삼 5 & 9포, 녹두, 진피 및 톳이 모두 염증발현을 억제하는 상위신호체계를 발현시킴. COX-2와 CRP의 수준은 비만시 증가하나 감태 고농도 투여에 의해 정상 수준으로 낮아짐.
③ 60% fat-DIO(10주+ 추출물처치)를 이용한 항비만 시험
○ 검정콩껍질 추출물의 농도의존시험(125mg/Kg, 250mg/Kg) 12주 처치
● 체지방(Micro-CT) 결과: 125mg/Kg(C3G+D3G=1.56mg/Kg), 250mg/Kg(C3G+D3G=3.23mg/Kg)처치군은 HF에 비하여 visceral fat이 각각 10, 20% 각각 감소. 내장지방의 total volume과 해부 후 mesenteric fat(g)결과와 일치함. 250mg/Kg 처치군은 visceral fat 및 leptin 분비도 감소됨.
● TNF-a는 세포실험 결과에서 200uM에서 감소하듯이 250mg/Kg에서 감소하여 추출물 농도에 매우 민감한 반응을 보임. 125 및 250mg/Kg 처치군은 HF에 비하여 adiponectin 분비를 증가시키며 오히려 CON 보다 증가함.
○ 한천포함 우뭇가사리 에타놀추출물 (300mg/Kg) 12주 처치
● 총체중 및 총지방량의 감소는 차이가 없었으나 피하지방의 감소가 현저하였는데 근육의 증가, 혈중 leptin 및 인슐린 감소와 관련이 있음. 또한 부고환 지방에서 MCP-1 & TNF-a항체를 이용하여 IHC를 시행한 결과. M1형성이 억제됨.
● 혈당억제: OGTT검사 시 120분 후 대조군 유사하게 혈당이 감소함 고지방식이와 유의적인 차이를 보임.
○ 한천 free-우뭇가사리 에타놀추출물 농도의존실험 (250, 300, 500, 1000mg/Kg) 8주 처치
● Prevention study: 모든 처치 군에서는 체중, 식이섭취, 혈중지질(콜레스테롤, 중성지방, 혈당) 등 이 어떠한 경향도 나타나지 않아서 우뭇가사리의 항비만 prevention 효과는 없다고 판정함. 단 총지방량과 근육량의 비율차이를 살펴보면, 250mg/Kg 처치군에서 유의적으로 감소하였는데 이는 250mg/Kg 처치군에서 근육량(QD)이 가장 크게 증가한 것이 원인으로 나타남. Epididymal fat에서 anti-inflammation 인자인 IL-10을 분석한 결과 유의적으로 항염증 효과가 있는 것으로 나타남. (p < 0.05) 특히 GA-500 mg/kg의 농도까지는 농도 의존적으로 효과가 증가하였으나, 고농도(GA-1000 mg/kg)에서는 오히려 다시 감소하는 추세를 보임.
● Treatment Study: GA-300mg/Kg 에서만 체지방(mesentric fat)양이 감소하였고 기타 투여군에서는 체지방의 감소 효과가 없는 현상은 food intake가 증가하였기 때문으로 보임. 혈중지질은 모든 처치군에서 유의적인 차이가 없으며 300 mg/Kg 투여군에서만 대조군에 비하여 혈당감소를 보임. Epididymal fat에서 anti-inflammation 인자인 IL-10을 분석한 결과, 한천을 포함하지 않은 우뭇가사리의 에타놀 추출물의 항염증 효과가 모든 처치군에서 대조군에 비하여 유의적으로 증가함. (p< 0.05)
④ db/db mouse model의 Diechol rich 감태추출물의 항당뇨, 항비만, 항산화 효능평가
● 항당뇨: Dieckol 20mg/kg을 처리시 혈중 인슐린감소가 현저 dieckol 10, 20mg/kg의 처리시 p-AMPK와 p-AKT 단백질의 발현량 증가.
● 항산화: dieckol 10, 20 mg/kg 처리시 대조군에 비하여 SOD와 GR항산화효소발현증가하고 MDA 생성이 감소함.
⑤ SHR mice에서 미더덕의 항고혈압 효능
● 미더덕 가수분해물로부터 ACE 저해 및 혈관확장 효과를 가지는 펩타이드를 분리한 결과 Ala-His-Ile-Ile-Ile의 분자량 565.3 Da의 펩타이드임. 이를 SHR (선천성고혈압쥐) 동물모델에 경구투여 후 Tail-cuff method를 통하여 24시간혈압을 측정함. 대조군으로 사용되어진 Amlodipine(칼슘채널 차단제) 보다는 약하지만 시간이 경과 할수록 생리식염수 투여군 보다 혈압강하가 우수함. 또한 12시간째 amlodipine 투여군과 비슷한 혈압강하효과를 보임.
3) 인체-임상시험
① 로스팅 녹두 티백 차 섭취가 중년여성의 비만개선효과 (Acute 임상시험)
● 시료: 로스팅한 녹두(12g)를 70℃ 물 100 mL에 10분간 침출함. (관능검사 기반).
● 대상자: 서울시에 거주하며 질병치료 및 약물복용을 하지 않는 평균 연령 52.80± 5.73세, BMI>25 과체중 중년여성으로 대조군(10명: 동일량의 물섭취)과 실험군(10명: 로스팅 녹두 티백차 섭취)으로 무작위 배분함. 실험군은 1일 3회 녹두 티백차(약 12g)를 4주 동안 식사 후 음용하게 하였으며 별도로 식사제한은 하지 않았음.
● 체지방 및 신체지수: 실험 전/후 대조군과 실험군의 체성분의 변화는 없으나 녹두 티백차 4주 섭취 후 체지방량과 WHR이 감소 경향(유의성 없음). 실험기간의 연장으로 녹두종피에 함유된 생리활성물질인 vitexin과 isovitexin의 비만 개선 효과가 있을 것으로 기대.
● 혈중지질개선: 대조군과 비교하여 녹두 티백차 2주, 4주 섭취후 혈중 TC가 유의적으로 감소함. 혈중 TG는 녹두 티백차 4주섭취 후 유의적인 감소를 보임. 즉, 녹두종피에는 vitexin과 isovitexin 뿐만 아니라, 지방산과 복합다당류의 복합체가 존재하므로 혈중 TC 감소효과가 나타난 것으로 보임.
② 검정콩껍질 추출물임상시험 (8weeks, double-blinded, test-placebo;CRO 기관연계)
● 대상자: 만 19세 이상, 65세 이하인 성인 남녀중 검사당시 BMI>25kg/㎡ 이상 또는 허리둘레가 남성>90cm, 여성> 85cm 이상인 비만
● 실험군과 위약군: 검정콩껍질 추출물군(TEST:40명)은 1일 3회, 1회 2캡슐(검정콩껍질추출물로써 2.5g/일)을 아침, 점심, 저녁 식전 경구섭취하고 위약군(PLACEBO:40명)은 1일 3회, 1회 2캡슐(전분 2.5g/일)을 아침, 점심, 저녁 식전 경구섭취를 각각 8주간 시행.
● 체지방 및 복부지방 변화: 계획서 순응 피험자군 (Per Protocol Set) 63명을 대상으로 1차 유효성 평가 항목인 체지방량은 유의한 차이가 없음. 복부지방을 표현하는 허리둘레는 test군에서 유의적으로 감소하였으나(p<0.0001) 대조군은 번화가 없음.
● 지질개선: 2차 유효성 평가항목인 TG, LDLc, Non-HDLc(TC-HDLc), LDLc/HDLc, (TC-HDLc)/ HDLc 분석 결과, 섭취 전과 섭취 8주 후 LDLc, non-HDLc 및 /LDL/HDL은 검정콩껍질추출물군과 위약군 두섭취군 간의 차이를 보이며 혈중 TC, LDLc, HDLc, Non-HDLc, VLDLc 지표는 검정콩껍질추출물군과 위약군 모두 통계적으로 유의하게 감소하였으나 두 섭취군 간의 차이는 없음.
● 식이섭취조사 및 신체활동조사(MET-minutes/week): ‘배정된 대로 분석(Intention–to-treat; ITT)’ 원칙에 따라 등록피험자 총 80명 분석 시, test와 위약군간의 식이섭취량 및 신체활동량의 차이가 없음.
● 안전성 평가: 최소 1회 이상 연구용제품을 섭취한 피험자 80명(Safety군)을 대상으로 이상반응, 임상병리 검사(혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 뇨검사), 활력징후 등의 측정 결과를 분석한 결과, 총 80명의 피험자 중 17명의 피험자에서 총 19건의 경도 또는 중등도 이상반응이 발생하였으나 두 섭취군 간이상반응 발생에 차이가 없었으며, 연구용제품 섭취와 인과관계가 없다고 판단함.
4) 제조공정의 최적화
① 흑삼제조공정에서 막걸리를 활용한 효능 최적화
● 유효성분 추출법: 70% 에탄올 추출법이 진세노사이드 추출수율을 증가함. 흑삼 5포의 추출수율이 높으므로 흑삼제조 시 5포까지 제조하고 70% 에탄올을 사용하여 추출하는 것이 유용성분 용출에 효과적.
● 총 페놀 함량 : 증포 과정이 진행될수록 증가하는데 이는 갈변이 진행됨에 따라 생성되는 melanoidine 분자가 비교적 안정한 유리기를 가지고 있는 것으로 유추. 막걸리로 증자할 때 더욱 높음. 또한 미숙성군에 비해서 숙성군이 총 페놀함량이 증가. 숙성과정 중 melanoidine 분자가 안정화에 기여함.
● DPPH법에 의한 항산화 활성: 총 페놀함량의 경우 숙성과정을 거치면서 증가하는 경향을 보였으나 일반군의 경우 DPPH법에 의한 항산화 효과는 오히려 감소함 막걸리 증자 숙성군이 가장 우수함.
● ABTS법에 의한 항산화 활성 : 증포가 진행됨에 따라 증가하고 숙성함에 따라 감소된 경향이 막걸리 증자로 인하여 증가함. 결론적으로 막걸리를 사용하여 증자시킨 후 숙성을 하는 경우 가장 우수한 형태의 흑삼을 제조 가능한 것으로 보임. 반면 증포가 진행됨에 따라 활성이 증가하지만 4-5포에서도 일반 군 9포와 활성이 유사하므로 막걸리를 사용하여 4-5포까지 증자시키는 것이 제품의 활성면, 시간과 금전적인 면에서 가장 효과적인 제조방법임.
② 녹두의 로스팅공법에 의한 효능최적화
● 20kg 녹두를 20L 에탄올로 추출하여 1.33L까지 농축한 후 HPLC를 이용하여서 농축액의 vitexin과 isovitexin을 분리함. 각각의 함량은 vitexin이 18.05%, isovitexin이 20.87%임
● 로스팅 온도가 높아질수록 항산화능이 증가하지만 110℃ 처리군이 DPPH radical 소거활성 (10.8%), ABTS radical 소거활성 (34.8%), Xanthine oxidase 저해활성 (48.6%)로 기장 좋으며 그 이상 온도에서는 역효과. 아질산염 소거활성은 로스팅 온도가 높아질수록 증가하고 pH가 높아질수록 활성이 감소되는 경향. 총 플라보노이드 함량: 30분 로스팅한 군에서 383 mg/g으로 가장 높으며 생 녹두에서 275 mg/g으로 가장 낮음.
③ 폴리페놀(45%)/ Diechol rich-감태추출물 공정과정 확립
● 폴리페놀(45%)/ Diechol (순도97%) rich-감태추출물(AG-Dieckol)의 효과적인 대량추출을 위해 1차적으로 당분해효소를 투입 후 24시간동안 추출하여 다당류를 추출/확보함. 확보된 1차 공정 후 남은 감태의 10배량의 주정을 가하여 상온에서 24시간 추출하고, 추출 후 데칸터 및 필터 프레스로 여과함. 여과된 제주산 감태 유래의 AG-Dieckol을 농축 후 동결건조 및 포장단위에 따라 포장하여 사용.
● 기능성 소재의 표준화는 고시 제2011-34호에 따라 기능/지표성분의 분석을 진행함. 특이성(Specificity) 평가 직선성(Linearuty)의 평가, 검증 중 범위(Range)정확성(Accuracy) 평가, 안전성(Stability)의 평가 시행.
● AG-Dieckol의 안전성 평가: Sprague-Dawley(SD) 계통 암컷 랫드를 이용하여 시험물질을 단회 경구투여 급성독성 및 LD50 평가함.
④ 안토시아닌이 풍부한 검정콩 껍질의 제형성 및 시제품 생산
● 검정콩 껍질첨가량이 0, 20, 40, 60, 80%으로 증가할수록 경도(hardness),탄력성(springiness), 검성(gumminess), 씹힘성(chewiness) 등이 증가하다가 60%, 80%에서 감소하므로 40% 첨가시의 물성이 가장 좋음.
● 당도의 경우 콩껍질 추출물 첨가량이 증가할수록 높아짐. 양갱 제조시 콩껍질이 함유한 당 성분만큼 설탕사용량을 주리면 단당류 섭취감소 효과.
● 관능평가 결과 콩껍질 추출물 40% 첨가 양갱이 색, 맛, 향, 전체적인 기호도면에서 가정 좋지만 앙금 245g, 물 195g, 콩껍질 추출물 10g, 설탕 45g, 한천 5g으로 제조한 콩껍질 첨가 양갱이 우수한 모델임.
⑤ 검정콩껍질분리후 부산물 이용제품의 효능검증 (식빵과 쿠키)
● 검정콩부산물 9% 첨가 식빵: 씹힘성(chewiness), 검성(gumminess), 탄력성(Springiness)등 물성평가, 색(color), 향(flavor), 질감(texture), 촉촉함(moistness), 부드러움(softness), 맛(taste), 전체적인 기호도(overall quality) 등 관능평가, DHPH, ABTS 라디컬 소거능, 총 페놀량, 총 플라보노이드 등 항산화능이 가장 우수함.
● 검정콩부산물 6% 첨가 쿠키: 향(flavor), 질감(texture), 촉촉함(moistness), 맛(taste), 전체적인 기호도(overall quality)면에서 가장 우수함.
● 검정콩부산물 9% 첨가 식빵 및 6% 첨가 쿠키 모두 항균활성이 있음.
5) 농수산물 소재분류 및 DB 구축
○ 2012년 5월29일-2012년 6월 7일까지 Pub MED와 Web of Science검색포털을 이용하여 국제 SCI에 게재된 논문을 중심으로 항비만 keyword(obesity, appetite, 3T3-L1, lipid, fat, adipocyte, weight, diet, AMPK)를 사용하여 검색함.
① 농수사물 소재: 녹차 789건, 해조류 94건, 마늘 72건, 인삼 60건, 포도 48건, 버섯 45건, 양배추 43건, 생강 24건, 고추 22건, 메밀 14건, 치커리 9건 등이며 총 1,214건이 DB화됨.
② 수산물소재: 미세조류 110건, 해조류 65건, 미역 61건, 다시마 31건, 모자반 30건, 조개류 28건, 감태 7건, 패 6건, 톳 5건, 우뭇가사리 3건 등 총 346건 DB화
6) 시제품 및 산업화 기반구축 마케팅전략
(1) 시제품제조
① 5포 흑삼을 활용한 시제품의 제작 3건 : 경기대학교 & (주) 동진제약
② 로스팅 녹두 티백차 제조 : 경기대학교& (주) 서진바이오텍
:녹두의 비릿한 맛 감소 및 녹두의 찬 성질을 보완하고자 현미와 계피를 혼합한 침출차 형태의 제품으로, 간이 임상시험에서도 혈중지질 수준을 저감하는데 효과적이었음.
③ 로스팅녹두 과립차 제조 2건
: 로스팅 녹두 추출물과 무수결정 포도당을 혼합하여 과립차 제조(A) 후 맛의 개선을 위해 비타민 C와 구연산을 첨가한 형태의 제품(B) 으로 관능평가가 우수하지는 않았음.
④ AG-Dieckol 첨가 다양한 제형의 시제품 생산: (주)아쿠아그린텍
제주산 감태 유래 항비만 소재인 AG-Dieckol을 다양한 제형을 연구/개발하여 3가지의 시제품을 개발하였음. 아래 3가지 외 다른 제형 제품의 가능성에 대해서 현재 진행중에 있음.
⑤ 검정콩껍질을 이용한 양갱제조 : 경기대학교 & (주)고을
:검정콩 껍질 추출물의 높은 항산화활성, 혈중 지질개선 및 체중 저감화 효과를 활용하고자 제조한 형태의 시제품으로 임상시험이 종료되어 개별인정을 신청할 예정이므로 기술이전에 따른 사업화가 가능함.
⑥ 검정콩껍질 분리후 부산물 이용 시제품개발 [식빵 및 쿠키 제조] : (주)고을
: 검정콩 껍질 제거 후 남은 부산물인 콩알맹이를 첨가하여 식빵 형태로 제조한 제품으로 (주)고을에서 시제품으로 판매를 시도하여 1500만원 정도의 매출이 있었고, 현재 지속적으로 제조 하여 판매하고 있음
(2) 산업화 기반구축 [BBT-CD3G 신제품 마케팅 전략]
○ 항비만 기능식품 시장 현황
● 웰빙 열풍, 고령화, 소득 증대 등으로 건강기능식품에 대한 국내 및 세계 시장이 지속적으로 증가하고 있으며, 특히 다이어트에 대한 관심 증대로 항비만 관련 시장이 확대되고 있음
● 현재 국내에 시판중인 항비만 기능식품은 700종 이상이며,
● 대부분 20-40대 여성을 대상으로 하며, 다이어트, 피부미용, 배변활동 촉진 등의 다양한 기능을 제공. 화장품 회사들이 항비만 기능식품 시장에 본격적으로 진출하고 있음
● 항비만 기능식품에 대한 소비자의 관심은 높으나, 섭취 후 만족도가 낮은 편이며 제품 및 원료물질의 안정성을 구매 시 가장 중시하는 요인임
○ BBT-CD3G 신제품 마케팅 전략
● 표적시장 선정: 30-50 대 남성이 비만율이 가장 높으나 항비만 활동이 비교적 적고 또 남성용 제품이 거의 없기 때문에 이 집단을 표적 시장으로 선정
● 포지셔닝 전략: 남성전용의 고가 항비만 기능식품으로 포지셔닝하며, 소비자에게 고가를 납득시킬 수 있는 제품 설계가 필요함
● 제품전략: 원료물질을 다량 포함시켜 신속한 효과를 얻게하며, 액상(젤) 형태로 낱개 포장
● 가격전략: 1개월 기준 7만~8만원대로 기존 남성용 제품에 비해 고가전략 채택
● 유통전략: 기존 유통망(약국, 건강기능식품 전문점 등)을 포함하여 고가의 이미지에 맞는 선별적 유통망 채택. 골프장과 고급 헬스클럽 등의 스포츠 시설 활용, 남성용품 제조사와 제휴한 마케팅 등이 가능함
● 마케팅 커뮤니케이션 전략: 다이어트 이후의 바람직한 모습을 강조한 긍정적 메시지를 활용.
본 신제품에 효과적인 미디어는 맞춤형 다이어트 상담이 가능한 블로그를 통한 사이버 입소문, 체험을 통한 입소문, 이벤트, 남성용 잡지, 교통방송 등임.

Abstract ▼

Ⅴ. R&D Achievements
1. Results of antiobesity functionality screening
1.1 3T3L-1 in vitro Test
Extracts
● 1-9 teabags of black ginseng hot water extracts showed concentration-dependent increase of cell viability, but no effect on fat accumulation.
● 1-9 teabags of black ginseng ethano

Ⅴ. R&D Achievements
1. Results of antiobesity functionality screening
1.1 3T3L-1 in vitro Test
Extracts
● 1-9 teabags of black ginseng hot water extracts showed concentration-dependent increase of cell viability, but no effect on fat accumulation.
● 1-9 teabags of black ginseng ethanol extracts: From the extracts from 5 and 9 black ginseng teabags, 5 teabag extracts showed significant concentration-dependent decrease in both 3T3L-1 cell viability and fat accumulation; dried orange peel extract showed similar effects as well.
● Mung bean testa and black bean testa ethanol extracts: When concentrations were increased up to 300ug/ml, no changes in the cell viability were observed. At high concentrations fat accumulation displayed a downward tendency till it reached 50%. The black bean extract (100-1000 ug/ml) inhibited the expressions of PPAR-r, C/EBP-a and ACC synthase, a key enzyme for fatty acid biosynthesis in fat globules, in a concentration-dependent manner.
● Ethanol extracts of Sargassum fusiforme, sea squirt, sea tangle, and Ecklonia cava: Sargassum fusiforme had no effects on cell viability and fat accumulation; sea squirt was 200% more effective on the differentiation and proliferation of adipocytes compared to the control group;
Ecklonia cava triggered a dramatic decrease in fat accumulation at the 300ug/ml level without any change in cell viability, thus proving most effective. Out of the three markers extracted from sea tangle (glutamate 7%, GABA 5%, and Glutamate:GABA= 5:5), glutamate7% was effective in the expressions of PPARr and HSL proteins.
Markers
● Administration of vitexin and C3G/D3G, markers for mung bean and black bean: fat accumulation was reduced to 50-60% at the concentration levels of vitexin 50-200uM and C3G/D3G 100-200uM, where extracts and markers’ tendencies were aligned with each other. When C3G 200uM was administered, TNF-a, pro- inflammation marker, was reduced and IL-10, anti-inflammatory factor, was increased. D3G increased IL-10 up to 100uM and decreased it at 200 uM
● Dieckol of Ecklonia cava extract: When it was administered at the concentration levels of 25, 50, and 100 μg/mls, the oil-red stained region was reduced in a concentration-dependent manner compared to that of the control group.
● Eckol, phloroglucinol, and dieckol, effective materials from the Ecklonia extract: IC50: >5 mM for phloroglucinol; IC50: 1.3 mM for eckol; IC50: 315 μM for dieckol, which shows that dieckol is more effective than other effective materials in terms of ACE inhibitory activity.
1.2 ATMΦs & Co-culture model tests
ATMΦs model
● Fishery products: Ecklonia cava extract, 100-300ug/ml, inhibited TNF-a and MCP-1, M1 factor, over 200% more compared to the control group; sea squirt extract, 75-300ug/ml inhibited TNF-a over 200% more.
● Agricultural products: 5 teabag black ginseng tea increased M2 or yielded a similar effect; dried orange peel increased it more than the control group at the concentration level of 75ug/ml. The only material having simultaneous effects on both M1 and M2 was Ecklonia cava. Co-culture model
● RAW264 and HepG2 cells were injected two days after administering insulin to 3T3L-1, and cultured for 9 days in a contact co-culture system: macrophage increased both TNF-a and Il-6 in the mung bean extract; HepG2 did not make any changes on TNF-a and Il-10 but increased IL-6 considerably. It is difficult to verify the conditions of the other extracts.
● RAW264 was injected two days after administering insulin to 3T3L-1 and cultured for 9 days in a contact co-culture. The results of secretion capacity of M1 type (MCP-1) and M2 type (Il-10), inflammatory factors, on the thday of contact co-culture: when the 5 te abag black ginseng tea and the dried orange peel extracts were administered, M1 slightly increased when the concentration in creased. However, M2 increased more than M1. When the black bean was administered, the marker D3G 100uM had greater anti-inflammatory effects than the alcohol extracts.Incontrast, when Ecklonia cava was administered, M1 and M2 decreased in high concentrations but M1 increased even more. When Seasquirt was administered, M2 increased and it decrease in high concentration. However, M2 increased more than M1.
1.3. H & E staining and mast cell IHC screening methods
● Compared to the control group, the cell sizes in the high-fat (HF) group increased whilst those in the orlistat group decreased. The sizes of the cells in most extracts except the 5 teabag and
9 teabag black ginseng were reduced more than those of the HF group.
● Compared to the control group, the groups where mast cells increased were the HF group, 5 teabag black ginseng, sea squirt and dried orange peel, etc. and the group where mast cells decreased was orlistat. Mung bean, black bean, and Sargassum fusiforme extracts showed a similar tendency as the control group.
● It was confirmed that C3G & D3G of the black bean extract had a crown-like structure (ATMΦs model M1) in which inflammatory macrophages surround fat globules. IHC was conducted on epididymal fat using Galectin-3 (Mac-2) antibodies. The results showed that formation of M1 was inhibited when black beans were administered, which was very similar to the inhibitive effect of orlistat.
1.4. Anti-inflammatory obesity screening with adipose-derived stem cell model
● Markers that reduce the proliferation speed of subcutaneous and visceral adipose stem cells more than that of the obese rat in vivo were 9 teabag black ginseng, sea squirt, and Sargassum fusiforme. Analysis showed that other markers excluding these markers had no effects on inhibiting proliferation of the stem cells for subcutaneous fat and abdominal fat in vivo.
● Agricultural products: The effects of 5 teabag black ginseng, and the ethanol extracts on obesity development: having no effects on inhibiting the proliferation of the stem cells for subcutaneous fat and abdominal fat in vivo, but the proliferation speed of the stem cells for subcutaneous fat was reduced in vivo. 9-teabag black ginseng inhibited proliferation of the stem cells for subcutaneous fat and abdominal fat in vivo.
● Fishery products: Sea squirt inhibited proliferation of subcutaneous and visceral adipose stem cells in vivo and in vitro. However, in vivo, the time required for the proliferation of the stem cells for visceral adipose stem cells in Sargassum fusiforme remained similar to that of the normal control group, which showed a decrease in the proliferation speed compared to the untreated Sargassum fusiforme during induction of obesity. Characteristics of the visceral adipose stem cells were not changed from that of the normal control group.
● Using the adipose stem cells of rats: In black bean and mung bean extracts, effective materials inhibited the differentiation of adipose stem cells into adipocytes at the 200μg/ml concentration, which indicated that the screening system with rats’ stem cells can be used in the analysis of the natural product extracts’ effects on the adipose stem cells’ differentiation into adipocytes.
● Using human adipose stem cells: Effective materials inhibited the adipose stem cells’ differentiation into adipocytes at over 50μg/ml concentration in the black bean extract, and at the 200μg/ml concentration in mung bean extract.
1.5. Potential antiobesity material screening using yeast based Genomics Biosystem
● The mulberry leaf extract, mulberry fruit extract and extract have the potential to inhibit fat accumulation in yeast cells.
● The Ecklonia cava, sea squirt, mung bean, Sargassum fusiforme, 5-teabag black ginseng, 9-teabag black ginseng, dried orange peel extract did not yield significant effects on fat accumulation inhibition in yeast cells.
● The marker genistein did not show a significant effect on fat accumulation inhibition in yeast cells.
● Black bean markers C3G & D3G did not interfere with the formation of total ROS (mainly, H₂O₂) in yeast cells.
● C3G showed the effects in inhibiting the mitochondrial superoxide production in yeast cells when administered in high concentration (100 μM), (P value * < 0.05). D3G induced pro-oxidant conditions when administered in low concentration, and showed the effects of inhibiting mitochondrial superoxide production in yeast cells only when administered in high concentration (100 μM), but without reaching a statistical significance (P value * < 0.05). To summarize the results, C3G displays significant antioxidant activity in high concentrations, and the expressed sequence tags of this natural product could be measured.
1.6. Anti-inflammatory screening of fishery products using Cox-2 inhibition rate (%)
● Ecklonia cava showed the highest anti-inflammatory activity (72.7%), outperforming the reference drug indomethacin (10 mM; 67.8%)
● Anti-inflammatory activities of other materials (in decreasing order): Sargassum fulvellum 57.8%, Sargassum coreanum 43.0%, Grateloupia divaricata 40.8%, 29.6%, 23.5%,Sargassumfusiforme20.1%,Chondrusocellatus15.0%,13.0%,Ishigeokamurai3.5%,Polyopesaffinis 2.4%,andEnteromorphaprolifera 0%.

2. Antiobesity mechanism using DIO mouse model
2.1. Inflammation-induction and antioxidative control mechanism
• After 6 weeks of administration, the high-concentration Ecklonia cava extract (HG) showed significant difference from the HF group. Black ginseng 5, black ginseng 9, and Sargassum fusiforme did no show any difference.
• Decrease in fat tissues: Ecklonia cava showed decrease in the sum of epididymal, mesenteric, retroperitoneal, and inguinal fat tissues (SUM-I) compared to the HF group. Black ginseng and ecklonia cava showed decrease in the sum of epididymal, mesenteric, and retroperitoneal fat tissues (SUM-II) compared to the HF group.
• Improvement in blood fat: Ecklonia cave decreased the blood TG and TC as well as atherogenic index (AI) [(TC-HDLc)/HDLc] to the level of the HF group. Black ginseng 9 showed a higher reduction in TB than Black ginseng 5, but showed a higher increase in HDLc. In both concentration, TC and AI were reduced to the level of the the HF group.
• Lipid peroxide concentration: while black ginseng did not show significant difference compared to the HF group, from the Ecklonia cava group showed an increasing tendency, and MG group tended to lower MDA.

2.2. 45% Fat-obese model (10-week DIO 12-weak treatment, HF vs. Orlistat)
• Total body fat: Extracts of mung bean, dried orange peel, sea squirt, Sargassum fusiforme, and black bean, which decreased epididymal and mesenteric fat, did not cause any changes in the total body weight due to the increase in muscle mass. Mung bean and dried orange peel extracts showed levels of decrease similar to that shown by orlistat, which proved to be most effective in reducing epididymal fat with respect to body weight. Although 5- and 9-teabag black ginseng, sea squirt, and Sargassum fusiforme extracts showed a slightly higher decrease than the HF group, less efficient than orlistat. Black bean extract was most effective in reducing mesenteric fact, but tended to increase epididymal fat.
• Physiological parameters of blood: Only black bean extract showed a significant decrease in FBS and TC compared to the HF group (level of decrease comparable to that of orlistat). Serum leptin was significantly decreased by the dried orange peel extract, whose effect in decreasing epididymal adipocytes was proven previously, compared to the HF group. Interestingly, orlistat inhibited leptin secretion along while decreasing fat uptake and body fat.
• Hepatic fat content: Compared to the HF group, the hepatic TG content was shown to be high in the order of sea squirt> mung, 9-teabag black ginseng, dried orange peel, and black bean > Sargassum fusiforme. That of TC was shown to be mung, 9-teabag black ginseng, black bean> sea squirt> dried orange peel, thus demonstrating that sea squirt and Sargassum fusiforme were effective in decreasing TG and TC, respectively. While black bean was shown to be effective in decreasing both blood and liver TC, mung bean, dried orange peel, and Sargassum fusiforme showed higher effect in decreasing hepatic fat content than improving blood lipid levels. In this connection, it will have to be validated in future research whether the decrease relates to reduced hepatic TG synthesis or reduced lipid uptake.
• Protein expression of fat synthesizing and degrading enzymes enzymes (AMPK, ACC, PPARr, SREBP-1, FAS, LPL, HSL, CPT-1, UCP1): ACC-decreasing effect was exhibited by 9-teabag black ginseng, mung bean, black bean, sea squirt, and C/EBP and PPARr were decreased by black ginseng and sea squirt. Black bean, sea squirt, seaweed fusiforme, and Ecklonia cava increased AMPK. Black bean, Sargassum fusiforme, and Ecklonia cava exhibited the highest AMPKexpressing effects. Sargassum fusiforme inhibited the expression of PPARr, thus demonstrating the highest lipid decomposition performance. ACC-decreasing mung bean and 9-teabag black ginseng triggered the increase in PPARr expression and is hence expected to increase adipocytes.
When compare with the obesity control group, Ecklonia cava group yielded a concentration-dependent decrease (100mg/Kg–500mg/Kg) in the marker (fatty acid synthase) FAS and LPL related to fat accumulation. The expression of CPT 1 that accelerates the oxidation of fatty acids and the thermogenic protein UCO 1 also increased in the low-concentration Ecklonia cava group.
• mRNA expression of fat synthesizing and degrading enzymes (AMPK, ACC, PPARr, SREBP-1, FAS, LPL, HSL): The highest degree of ACC mRNA expression was exhibited by the HF group, with orlistat and sea squirt showing levels similar to that of the control group. All remaining groups inhibited ACC associated with fatty acid synthesis. On the other hand, black bean and Sargassum fusiforme increased the expression of HSL mRNA, thereby promoting the TG decomposition 200–400-fold compared to the control group.
• Protein expression of inflammatory mediators (iNOS2, COX-2, leptin, CRP, p-iKB-a, IKB-a, IL-6, IL-10, TNF-a): When compared with the HF, black bean and Sargassum fusiforme doubled or tripled the M1 factor IL-6 but concomitantly expressed M2 factor IL-10; thus, an additional analysis of Arg1 as M2 factor is being considered. P-iKB-a/IKB-a ratio was lower than HF in all cases, and 5- and 9-teabag black ginseng, mung bean, dried orange peel, and Sargassum fusiforme expressed upstream signal transduction pathway suppressing inflammatory mediators. Obesity is associated with the increase in COX-2 and CRP levels, and the high-concentration Ecklonia cava administration decreased them to the normal levels.

2.3. Antiobesity test using 60% fat-DIO (10 weeks extract treatment)
12-week concentration-dependence test (125mg/Kg, 250mg/Kg) of Black bean testa extract
• Result of total body fat (Micro-CT): The treatment groups [125mg/Kg (C3G D3G=1.56mg/Kg) and 250mg/Kg (C3G D3G=3.23mg/Kg)] showed decrease in visceral fat by 10 and 20%, respectively. The total volume of visceral fat matched the post-mortem measure of mesenteric fat (g). In the 250-g group, both visceral fat and leptin secretion were reduced.
• TNF-a decreased in the 250-mg group as did in the 200 uM cell test, showing a highly sensitive reaction to the extract concentration. Both 125- and 250-mg groups showed increase in adiponectin compared to HF, even to a greater extent than the control group. 12-week treatment of ethanol extracts of red algae containing agar
• Although no difference in decrease was observed in the total body weight and fat mass, subcutaneous fat was considerably increased, which is associated with increase in muscle mass and decrease in serum leptin and insulin. Additionally, the results of IHC that was performed using MCP-1 and TNF-a antibodies in epididymal fat revealed that the M1 formation was suppressed.
• Blood glucose suppression: OGTT test revealed that after 120 minutes, the blood glucose in the control group was reduced at a similar level to the control group, showing a significant difference from the HF group. 8-week treatment of ethanol extracts of agar-free red algae agar for concentration-dependence test (250, 300, 500, and 1000mg/Kg)
• Prevention study: In all treatment groups, no clear tendencies were observed in terms of total body weight, dietary intake, blood lipids (cholesterol, triglycerides, and glucose), which led us to determine that red algae did not have any antiobesity effect. Looking at the percentage difference in total body fat and muscle mass ratio, however, 250-mg group showed a significant decrease, presumably due to the fact that 250-mg group showed the largest increase in muscle mass (QD). The result of analyzing the anti-inflammation factor IL-10 revealed that it has a significant anti-inflammatory effect in epididymal fat (p <0.05). Interestingly, the increase was linearly concentration-dependent up to GA-500 mg/kg, but at high-concentration (GA-1000mg/kg), the effect tended to decrease.
• Treatment study: GA-300 mg/Kg was the only concentration at which body fat (mesenteric fat) was reduced. Other concentration groups did not show and significant body fat, presumably due to the increase in food intake. As for blood lipids, no significant differences were observed in all treatment groups, with the 300-mg group showing glucose reduction compared to the control group. The result of analyzing the anti-inflammation factor IL-10 Epididymal fat revealed that the anti-inflammatory effect of the ethanol extracts of agar-free red algae was significantly higher in all treatment groups compared to the control group (p <0.05).

2.4. Antidiabetic, antiobesity, and antioxidant efficacy of the Diechol-rich Ecklonia cava extract in the db/db mouse model
• Antidiabetic effect: When dieckol 20mg/kg was administered, insulin was considerably decreased, and the expression levels of p-AMPK and p-AKT protein increased protein at the dieckol concentration levels of 10 and 20 mg/kg.
• Antioxidant effect: The treatment with dieckol 10 and 20 mg/kg increased the expression of antioxidant enzymes SOD and GR compared to the control group, and MDA synthesis was reduced.

2.5. Antihypertensive effect of sea squirt in SHR mice
• The result of isolating the peptide that functions as ACE inhibitor and vasodilator from the sea squirt hydrolyzate revealed it to be an Ala-His-Ile-Ile-Ile peptide with molecular weight of 565.3 Da. This was orally administered to the SHR (spontaneously hypertensive rat) animal model, and blood pressure was measured at 24 h via tail-cuff method. Although weaker than amlodipine (calcium channel blocker) that was used as a control, its blood pressure lowering effect was superior to that of the saline treatment group over time. At 12 h, it showed a blood pressure lowering effect similar to that of the amlodipine treatment group.

3. Human-subject clinical trials
3.1. Antiobesity effect of roasted mung bean tea on middle-aged women (acute clinical trial)
• Test specimen: roasted mung bean (12 g) brewed in 100 mL water at 70°C for 10 min (base on sensory evaluation)
• Subjects: 20 obese middle-age women (BMI > 25; average age: 52.80± 5.73) living in Seoul currently under no medication or disease treatment were randomly assigned to the control group (n = 10; same-amount water intake) and experimental group (n = 10; roasted mung bean tea intake). The experimental group was instructed to drink a bag of roasted mung bean tea (~12 g) after each meal (3 times/d) for 4 weeks without imposing any dietary constraints.
• Total body fat and BMI: No pre-post changes in body composition were observed both in the experimental and control groups. The total body fat and waist-hip ratio (WHR) were decreased after 4 weeks of mung bean bagged tea intake, but without reaching a statistical significance. A prolonged trial period is expected to yield the level of antiobesity effect comparable to vitexin and isovitexi that are physiologically active substances contained in the mung testa.
• Improvement of blood lipids: Compared with the control group, blood TC significantly decreased after the tea intake of 2 and 4 weeks. Blood TG showed a significant decrease after 4 weeks’ of mung bean teabag tea drinking. This effect of blood TC reduction is considered to be attributable to the composites of fatty acids and complex polysaccharides contained in mung bean testa in addition to vitexin and isovitexin.

3.2 Antiobesity effect of Black bean testa extract on obese subjects(8weeks, double-blinded, testplacebo;CRO collaboration)
• Subjects inclusion: 19-65 years old obese people(BMI>25kg/㎡ or waist circumferences(WC)>90cm for men amd >85cm for women)
• Test & Placebo: Randomly assigned test group (n=40) took the extracts form black bean testa 3 times s day(two capsules pet one times; 2.5g/day) and the placebo group(n=40) took same amount of starch instead of test materials for 8 weeks.
• Body fat composition: To the final subjects allowed protocol (Per Protocol Set; n=63), the body fat composition was not different between two groups. However, WC that representative for abdominal fat was significantly decreased in the test group compared to the placebo.(p<0.0001) • Lipid profiles: TG, LDLc, Non-HDLc(TC-HDLc), LDLc/HDLc and (TC-HDLc)/HDLc were differe netween two groups before and after experiments. LDLc, non-HDLc and /LDL/HDL were also different between two groups. Since TC, LDLc, HDLc, Non-HDLc and VLDLc were decreased in both two groups, the significant difference between two groups were not found.
• Diet and Physical activity(MET-minutes/week): By the analysis of Intention–to-treat(ITT), we could not find the differences of diet and physical activity between test and placebo.
• Safety assessment: For all 80 subjects who took at least once the study material (safety group), the measurement results concerning adverse events, clinicopathological examination (hematological tests, biochemical tests, urinalysis), and vital signs were analyzed. As a result, 19 cases of mild or moderate/severe adverse reactions in 17 subjects out of 80 occurred, but there was no intergroup difference in the occurrence of adverse reactions such that no cause-effect relationship regarding the study product can be drawn from this.

4. Optimization of production process
4.1. Efficacy maximization using makgeolli in the black ginseng production process
• Active ingredient extraction: 70% ethanol extraction of ginsenoside increases the extraction yield. Because the 5-teabag extraction yield is high, for the elution of active ingredients, it is efficacious to produce up to amount of 5 teabags and then extract using 70% ethanol.
• Total phenolic content: Phenolic content increased in proportion to the number of teabags, which led us to believe that melanoidine molecules that are generated as browning progresses have a relatively stable free radicals. This effect increased when steamed with makgeolli. The total phenolic content increased in aging group than in immature group. Melanoidine molecules contribute to the stabilization of the aging process.
• DPPH-mediated antioxidant activity: While the total phenolic content tended to increase while undergoing the process of aging, DPPH-mediated antioxidant activity decreased in regular groups. In this regard, the makgeolli steaming group showed outperformed all other groups.
• ABTS-mediated antioxidant activity: Antioxidant activity increased in proportion to the number of teabags and decreased with the aging, which was compensated for and increased again with the steaming with makgeolli. It may be concluded that aging under makgeolli steaming yields the black ginseng of optimal quality. On the other hand, although antioxidant activity increases as the number of teabags increases, given that 4-5 teabags show similar level of activity to the 9-teabag group, use of 4-5 teabags under makgeolli steaming can be considered the optimal production process in terms of activity level of the product and time and financial budgets.

4.2. Achievement of optimal effectiveness with mung bean roasting method
• 20 kg mung bean is extracted with 20 L ethanol and concentrated to 1.33L. The extract is then separated into vitexin and isovitexin using HPLC, yielding the contents of 18.05% and 20.87%, respectively.
• The higher the roasting temperature rises, the higher the antioxidant activity becomes. However 110°C proved to be optimal for the treatment group in terms of DPPH radical scavenging activity (10.8%), ABTS radical scavenging activity (34.8%), xanthine oxidase inhibition activity (48.6%) more than the temperature counterproductive. Higher temperatures were counter-effective.
Nitrite scavenging activity tends to be increased with the increase in the roasting temperature and decreased with the increase in pH. The 30-min roasting group showed the highest total flavonoid content (383 mg/g) and unroasted group, the lowest (275 mg/g).

4.3. Establishment of extraction process of polyphenol (45%)/Dieckol-rich Ecklonia cava • To achieve an efficacious mass production of polyphenols (45%)/Dieckol (purity 97%) rich-Ecklonia cava extract (AG-Dieckol), glycolytic enzymes are first introduced and the polysaccharide extracted/secured for 24 h. After the completion of the first process step, the residual Ecklonia cava is added with 10-fold amount of ethanol and extracted for 24 h at room temperature, followed by filtering using a decanter and filter press. The AG-Dieckol derived from the filtered Jeju Ecklonia cava is then concentrated, freeze-dried, and packaged in accordance with the packing units.
• The standardization of functional materials includes the analysis of functional/marker components in compliance with the Official Notice No. 2011-34. Evaluations of specificity, linearity, range accuracy and stability are performed.
• The stability assessment of AG-Dieckol: Sprague-Dawley (SD) linage female rats are used for the assessment acute toxicity and oral LD50inasingleoraladministration.

4.4. Anthocyanin-rich black bean testa formulations and prototype production
• Black bean testa is added at the percentages of 0, 20, 40, 60, and 80%, and its brightness, color, physical properties (TPA test: hardness, springiness, gumminess, chewiness, cohesiveness), and sweetness are measured.
• The addition of black bean testa up to 80% increases the sugar content, but its physical properties of hardness, springiness, gumminess, and chewiness deteriorates, with cohesiveness unchanged.

4.5. Effectiveness evaluation of the by-products recycling products after separating testa from black bean (bread or cookie)
• Bread with 9% black bean by-products showed the most excellent qualities in physical properties such as chewiness, gumminess, springiness, cohesiveness; sensory evaluation such as color, flavor, texture, moistness, softness, taste, and overall quality; and antioxidant abilities such as DPPH, ABTS radical scavenging activities, total amount of phenol, total flavonoids, etc.
• Cookies with 6% black bean by-products showed the most excellent qualities in flavor, texture, moistness, taste, and overall quality.
• Both bread with 9% and cookies with 6% black bean by-products showed antimicrobial activities.

5. Agricultural material classification and DB generation
• From May 29, 2012 to June 07, 2012, international SCI-level papers published were screened on the Pub MED and Web of Science search portals with the antiobesity keywords (obesity, appetite, 3T3-L1, lipid, fat , adipocyte, weight, diet, AMPK).
5.1. Agricultural materials
A total of 1,214 DBs were generated including 789 DBs for green tea, 94 DBs for seaweed, 72 DBs for garlic, 60 DBs for ginseng, 48 DBs for grape, 45 DBs for mushroom, 43 DBs for cabbage, 24 DBs for ginger, 22 DBs for pepper, 14 DBs for buckwheat, and 9 DBs for chicory.

5.2. Fishery materials
A total of 346 DBs were generated including 110 DBs for microalgae, 65 DBs for seaweed, 61 DBs for sea mustard, 31 DBs for sea tangle, 30 DBs for gulfweed, 28 DBs for shell fish, 7 DBs for Ecklonia cava, 6 DBs for Ishige sincola, 5 DBs for Sargassum fusiforme, and 3 DBs for red algae.

6. Prototypes and marketing strategies for establishing the basis for industrialization
6.1. Prototypes
1) Three variations of test products using 5 teabag black ginseng
2) Roasted mung bean teabags
3) Two cases of roasted mung bean granule tea
a) 97.5 g mung bean extract is blended with 500 g anhydrous crystalline glucose (CJ) (extract/glucose = 19.5%). After being left to stand to be stabilized for 30 minutes, the mix is crushed into granules with a granule-making machine (5 HP) with the perforating mesh diameter of 1-mm. The granules are then hot-air dried at to 40Å and prepared in the form of granule tea.
b) To improve the taste of Type A, the mix of 97.5 g mung bean extract and 500 g anhydrous crystalline glucose (CJ) (extract/glucose = 19.5%) is added with 15 g vitamin c and 0.5 g citric acid. After being left to stand to be stabilized for 30 minutes, the mix is crushed into granules with a granule-making machine (5 HP) with the perforating mesh diameter of 1-mm. The granules are then hot-air dried at to 40Å and prepared in the form of granule tea.
4) Diverse types of trial products added with AG-dieckol
Three trial products have been developed after an extensive R&D of a variety of formulations for using AG-dieckol, an antiobesity agent derived from Jeju Ecklonia cava. In addition to these three prototypes, there is an ongoing R&D to develop additional products with different formulations.
5) Black bean testa jelly (varied according to the testa contents)
6) Trial products using the by-products after separating testa from black bean (bread or cookie) Additional stickers will be attached to the PB products of the company Haegaon (Ltd.) under current development. Also, there are ongoing negotiations with Olive Co-op and Green Village (Ltd.)

6.2. Creation of the basis for industrialization [BBT-CD3G New Product Marketing Strategy]
1) Industrial analysis of the antiobesity functional foods
• The demand for the health functional foods has increased in the domestic and international market due to wellbeing trend, aging society and increase in income. Customers' interest in the weight control rises, and the related market is expanding.
• In the domestic market there are more than 700 kinds of the antiobesity functional foods which target mostly women of age twenty to forty. The foods have diverse functions like weight control, skin care and vitalizing bowel movement. Cosmetic companies are entering the market briskly.
• Users' satisfaction level with the antiobesity functional foods is low compared with the high interest in the foods. The safety of the core materials is the critical factor in buying decision.

2) Marketing strategy of the new BBT-CD3C product
• Target market: The male of age 30-50 is the target segment since this group has the highest obesity rate, and is not active in the weight control. Also, there are few products which target obese men.
• Positioning strategy: Premium product with high quality and high price
• Product strategy: Product with rapid effect by containing large dose of the raw material. Liquefied(gel) form in an individual package for an easy use.
• Pricing strategy: Premium pricing with 70,000 - 80,000 won for one month
• Channel strategy: Selective marketing channels like sport facilities, pharmacies and speciality stores. Alliance with manufacturers of male products
• Marketing communication strategy: focus on the positive message by emphasizing the desirable body type. Active use of helath-realted blogs, words of mouth, participation in the promotional events, high-quality magazines for men, and the traffic broadcasting.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 19
• CONTENTS ... 36
• 목 차 ... 37
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 및 성과목표 ... 38
• 1. 연차별 연구개발의 목적, 필요성 및 범위 ... 38
• 2. 연차별 연구성과 목표 대비 실적 ... 46
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 49
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 55
• 1. 1차년 핵심별 연구결과 ... 55
• 2. 2차년 핵심별 연구결과 ... 82
• 3. 3차년 핵심별 연구결과 ... 136
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 192
• 1. 연도별 연구목표 및 평가착안점에 입각한 연구개발목표의 달성도 ... 192
• 2. 관련분야의 기술발전에의 기여도 ... 197
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 200
• 1. 연구개발성과 ... 200
• 2. 연구개발성과 활용계획 ... 211
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 214
• 제 7 장 연구시설·장비 현황 ... 216
• 제 8 장 참고문헌 ... 217
• <첨부> 특허, 논문 및 시장분석 보고서 ... 219
• 끝페이지 ... 249