초록 ▼

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제주산 시트러스류 가공부산물(착즙박, 껍질)로부터 bioconversion을 이용한 기능성분의 추출, 분리, 정제 및 산업화 기술 구축
● 본 연구에서는 제주산 농산부산물 및 농산가공부산물 원료의 확보 및 경제성 분석, 다양한 추출법에 의한 최적 획득법 연구, bioconversion을 위한 상업적 효소와 식품 및 식품 미생물 탐색 및 선정연구, 실험실적 공정 최적화 연구, 개발 소재의 상품화 연구, 최적 생산을 위한 pilot plant 설계, 최적화 공정 확립 및 생산된 상품의 사업화에 관한 연

Ⅳ. 연구개발결과
1. 제주산 시트러스류 가공부산물(착즙박, 껍질)로부터 bioconversion을 이용한 기능성분의 추출, 분리, 정제 및 산업화 기술 구축
● 본 연구에서는 제주산 농산부산물 및 농산가공부산물 원료의 확보 및 경제성 분석, 다양한 추출법에 의한 최적 획득법 연구, bioconversion을 위한 상업적 효소와 식품 및 식품 미생물 탐색 및 선정연구, 실험실적 공정 최적화 연구, 개발 소재의 상품화 연구, 최적 생산을 위한 pilot plant 설계, 최적화 공정 확립 및 생산된 상품의 사업화에 관한 연구개발을 수행하였다.
● 원료수급 방안과 관련하여 롯데칠성, 제주지방개발공사 및 일해 등 주요 감귤류 가공품 제조업체로부터의 감귤류 가공 부산물을 직접 수급하여 하는 방안을 모색하였으며, 당사의 제주공장 설립 시 관련 필요설비를 구축할 예정에 있다.
● 제품개발과 관련하여 초고압, 초임계, 아임계 및 용매추출 등 다양한 추출법을 활용한 플라보노이드 및 면역 다당체의 최적추출조건 확립연구를 통하여 실제 생산적용 가능한 저비용, 고효율 추출조건을 확립하였으며, bioconversion을 위한 상업적 효소와 식품 미생물 탐색 및 선정 연구를 통하여 최대 활성을 가지는 제품생산이 가능한 산업용 효소를 선정, 최적공정을 확립하였다.
● 최적 추출법 설정연구 수행결과, 초임계, 아임계 및 열수추출의 경우 전반적인 추출수율은 높은 반면 추출물의 flavonoids 순도가 낮은 것으로 확인되었으며, 주정추출시 추출수율은 다른 추출법의 1/2 수준으로 낮으나 추출물의 flavonoids 함량은 약 2배 내지 2.5배 증가함을 확인하였다. 반면 다당체 소재의 경우, 초임계, 아임계 및 열수추출에서 높은 수율로 추출됨이 확인되었으나 주정추출을 통해서는 추출되지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 생산수율 및 제조비용 결과를 고려하여 flavonoids 소재 및 다당체 제품 생산을 위한 최적 추출방법은 열수추출로 결정하였다.
● Bioconversion을 위한 산업용 효소 선정시험 수행결과, flavonoids 성분의 비배당체로의 전환은 Cellulase KN과 Cytolase 효소가 각각 80%, 90%의 높은 전환률을 보였으며, 다당체 소재개발의 경우에는 Rapidase, Pectinex, Cytolase PCL5 및 Pectinase 총 4종의 효소가 높은 활성의 다당체를 제조할 수 있는 효소로 확인되었다. 이들 결과를 토대로 비배당체 flavonoid 및 면역 다당체 생산을 위한 최적효소로는 Cytolase 효소를 최종 선정하였다.
● 선정된 효소를 이용한 최적 공정 개발연구를 수행한 결과, 비배당체 flavonoids 소재 및 면역 다당체 소재의 생산을 위한 최적 효소 첨가량은 0.5%, 반응온도는 50℃, pH는 4내지 7, 반응 시간은 16시간 이상으로 확인되었으며, 이를 토대로 개발제품 생산을 위한 최적공정을 확립하였다.
● Flavonoids 소재의 경우 원료, 지표성분의 함량에 따라 분말 성상의 고순도 제품과 액상형태의 저순도 제품으로 나누어 개발하였으며, 제조수율 및 공정비용 등을 고려하여 각 제품별 공정을 달리하였다. 한편, 면역 다당체 소재의 경우 원료 및 제품의 순도에 따라 제품을 다양화 하였다. 또한, flavonoids 소재와 다당체 소제를 동시에 제조할 수 있는 통합 생산공정을 확립하였다.
● 개발 소재에 대하여 다양한 제형 개발연구와 안정성평가 및 제품별 기준규격 가이드를 설정하여 품질관리기준 및 생산표준화를 확립하였으며, 제품생산을 위한 단계별 scale up test를 실시하였고, 공정별 control point & factor 설립하였다.
● 제형개발 및 가공적성 평가 결과 고순도 flavonoids 소재는 100ppm의 낮은 용해도로 인해 분말 및 과립 제형이 적합한 것으로 평가되었으며, 미립화를 통한 콜로이드 제형이 가능한 것으로 확인되었다. 한편, 저순도 flavonoids 소재는 액상제형이 적합한 것으로 평가되었으며, 다당체 소재의 경우 0.1% (w/v) 이상의 높은 용해도가 확인되었으며, 최적 제형으로는 분말 및 과립이 적합한 것으로 평가되었다.
● 안정성 평가 결과 flavonoids 소재의 경우 액상 및 건조분말 제형에서 40℃, 35일간 저장시 지표성분의 함량변화가 크지 않은 것으로 확인되었다. 면역 다당체 소재의 경우 소재의 특성상 갈변화 정도를 척도로 하여 안정성 평가를 진행하였으며, 건조분말 제형에서 60℃, 14일간 저장 시까지 안정한 것으로 평가되었다.
● 제품 별 기준 규격으로는 flavonoids 소재의 경우, 효능 및 기능지표로서 naringin, narirutin, hesperidin, naringenin 및 hesperetin 성분과 총 폴리페놀 함량을 설정하였고, 다당체 소재의 경우 rhamnose 및 arabinose의 함량과 2-methylfucose와 2-methylxylose 성분의 정성적 검출, 총 폴리페놀 함량을 지료로 설정하였다.
● 개발제품의 시생산은 제주테크노파크의 생산설비를 활용하여 실시하였으며, 감귤류과피 분말원료 150kg를 이용하여 다당체 소재 7.5kg, flavonoids 소재 72kg을 각각 생산하였다. 이후 생산된 제품을 활용하여 각 제품에 대한 규격검증을 실시한 결과 다당체 소재 및 flavonoids 소재 모두 기준 규격에 적합한 것으로 확인되었다. 생산 제품에 대한 면역 효능평가 및 항비만 효능평가를 실시한 결과 다당체 소재 및 flavonoids 소재 모두 뛰어난 생리활성이 확인되었다. 또한, 생산 제품에 대한 GLP기관을 통한 단회독성 안전성 평가를 수행한 결과 flavonoids 소재 및 다당체 소재 모두 시험동물 Sprague-Dawley(SD) 계통 랫드기준 개략의 치사량(Approximate Lethal Dose, ALD)은 2,000 ㎎/㎏ 이상 2,000mg/kg인 것으로 확인되었다.
● 개발 제품의 사업화를 위해 경쟁제품과의 규격 및 가격비교를 통한 경제성 분석을 실시하였으며. 타겟 소비자 및 시장조사를 통한 판매전략을 수립하였고, 제품 홍보물을 기획, 제작하여 제품홍보를 실시하였다.
● 개발제품과 경쟁제품을 비교 평가한 결과 다당추출물 소재의 경우 경쟁제품대비 뛰어난 효능과 저렴한 가격으로 경쟁력이 높은 것으로 평가되었으며, flavonoids 소재의 경우 경쟁제품과 유사한 효능을 가지만 가격 면에서 저렴한 것으로 평가되어 충분한 경쟁력을 가지는 것으로 평가되었다.
● 타겟 소비자 및 시장조사 결과 기업체의 향후 생산, 판매를 희망하는 소재와 소비자가 선호하는 건강기능식품 소재 중 체지방감소 소재와 면역증진 소재가 포함되어 있는 것으로 확인되어 개발제품인 flavonoids 소재 및 다당체 소재가 향 후 사업화에 있어 충분한 경쟁력이 있는 것으로 평가되었다.
● 개발소재의 판매전략으로는 원료의 친숙성, 제조공정 및 제품의 안전성, 적정한 가격을 강점으로 하여 일반 소비자의 접근이 용이한 유음료 및 일반음료 제품에 우선 적용함으로써 제품의 인지도를 높여나가는 전략을 계획하였으며, 이 후 소비자 니즈에 맞는 타정, 분말 등의 다양한 최종소비제품 제형을 개발, 출시 할 예정이다.
● 제품의 사업화를 위해 개발제품에 대한 소개 및 홍보자료를 제작하여 영업 및 마케팅 자료로써 적극 활용하고 있으며, IFIA JAPAN 2014를 포함한 5곳의 국내외 식품소재 및 첨가물 관련 전시회에 참여하여 개발제품에 대한 소개 및 홍보를 실시하였다.
2. 제주산 한라봉, 천혜향, 감귤 가공부산물로부터 체지방 감소 기능의 flavonoids분획의 분리 및 기능성 소재화
● 감귤류와 감귤류의 껍질은 오랜 기간 동양의학의 약재로 사용되어왔고, 최근에는 생과일과 주스로 많이 소비되고 있다. 하지만 감귤 가공 공정 시 많은 껍질부산물이 발생하므로 활용방안이 필요하다. 감귤류의 껍질에는 flavanone이 풍부하며, 이 감귤류 flavanone은 배당체 또는 비당체의 형태로 존재한다. 배당체보다 비당체의 체내 흡수가 더 효과적이므로 비당체가 생리적 효과가 더 뛰어나다. HPLC 분석결과 cytolase를 가지고 감귤류를 bioconversion 시키면 narirutin과 naringin은 naringenin으로, hesperidin은 hesperetin으로 전환되고 총 플라보노이드의 함량은 약 23%에서 30%로 전환된다. 1차년도에서는 본 연구는 감귤류의 flavanone을 bioconversion 한 뒤 면역세포에서 항산화 및 항염증 효과를 확인하였다. Bioconversion 후에 감귤류 추출물의 전자공여능이 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인하였고, 면역세포인 RAW264.7에 200, 500 μg/ml의 감귤 bioconversion 전 (CU)·후 (CU-C) 추출물과 100, 200 μg/ml의 한라봉 bioconversion 전 (CS)·후 (CS-C) 추출물을 4시간 동안 처리한 후 lipopolysaccharide (LPS: 1 μg/ml, 8 시간)를 처리하였다. ORAC assay를 수행한 결과 500 μg/ml CU-C , 200 μg/ml CS, 100 μg/ml CS-C가 높은 항산화 능력을 보여주었다. 염증관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질과 RNA 발현을 확인한 결과, 감귤과 한라봉 bioconversion 전·후 추출물이 LPS에 의해 유도된 iNOS를 농도 의존적으로 감소시켰고, bioconversion 전보다 후 추출물의 억제효과가 더 높았다. iNOS에 의해 생성되는 NO 역시 감귤과 한라봉 bioconversion 전·후 추출물이 LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제시켰다. 그리고 500 μg/ml CU-C, 200 μg/ml CS-C가 LPS에 의해 유도된 COX-2를 감소시켰다. LPS에 의해 증가된 adhesion molcule인 ICAM-1과 cytokine인 IL-6와 IL-1β의 mRNA 발현은 CU-C와 CS-C에 의해 억제되었다. 1차년도 연구 결과에 의하면 cytolase를 이용한 bioconversion을 한 감귤과 한라봉 껍질 추출물이 bioconversion 전보다 항산화, 항염증 생리활성이 강화되었고 감귤보다는 한라봉 껍질 추출물이 훨씬 강력했으며, 이를 통해서 산화, 염증반응에 기인하는 만성질환을 위한 기능성 소재로 활용이 가능할 것을 시사하였다.
● 비만은 제 2당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화와 같은 대사증후군과 관련되어 있는 중요한 건강 문제로 여겨지고 있으며, 최근 들어 감귤류가 염증뿐 아니라 비만을 방지하는데 도움이 될 수 있다고 보고되었다. 따라서 2차년도에는 제주도에서 생산된 감귤과 한라봉의 껍질 추출물을 cytolase 효소를 이용하여 bioconversion한 물질들의 항비만 효과를 지방전구세포를 통해서 확인해 보았다. 먼저 세포독성 실험결과를 토대로 0.5 mg/ml 농도의 시료를 처리하였을 때 Sinetrol과 CU군을 제회한 모든 시트러스류 처리군에서 지방전구세포 분화억제효과가 나타났으며 특히 한라봉 처리군에서 강하게 나타났다. 지방전구세포의 전사인자인 C/EBPα, SREBP1c의 mRNA levels은 대조군에 비해서 감귤처리군은 별다른 차이를 보이지 않았으나 한라봉 처리군은 유의적으로 감소하였다. PPARγ와 C/EBPα의 단백질 발현량의 경우, 대조군에 비해서 CU-C, CS, CS-C군에서 단백질 발현량이 유의적인 감소를 나타내었다. 또한 지방분해활성을 알아볼 수 있는 glycerol release에서는 CS-C군을 제외한 CF, CFC, H, HC군에서 대조군보다 유의적으로 glycerol의 release가 증가하여 지방분해 활성의 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 연구결과는 제주산 감귤과 한라봉 껍질이 지방세포 분화 유도인자들인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1의 억제를 통해서 지방분화를 저해시키거나 지방분해는 증가시켜 항비만의 기능성을 향상시키는 것을 내포한다.
● 3차년도에는 in vitro에서 확인된 감귤류의 항비만 효과를 in vivo에서 확인하였다. 즉, 감귤과피 및 bioconversion 전과 후의 감귤 과피 추출물의 고지방식이로 비만을 유도한 쥐 모델의 비만대사에 미치는 영향을 확인하였다. 감귤의 효과를 확인하기 위해서 4주령의 암컷 쥐(C57BL/6, n=76)를 일반식이(ND; Nomal Diet, 18% fat of total calories)섭취군, 고지방식이(HFD; High Fat Diet, 60% fat of total calories)섭취군으로 나누고 고지방식이 섭취군은 다시 대조군 1군과 실험군 3군으로 나누어 감귤과피분말(Powder), bioconversion하기 전의 감귤과피추출물(CU), bioconversion 후의 감귤과피추출물(CU-C)을 150 mg/kg/d씩 경구투여 하였다. 한라봉의 효과를 확인하기 위해서 4주령의 수컷 쥐(C57BL/6, n=86)를 ND 섭취군, HFD 섭취군으로 나누고 고지방식이 섭취에게 8주 동안 HFD를 먹여 비만을 유도한 뒤 다시 대조군 1군과 실험군 4군으로 나누어 Sinetrol, 한라봉과피분말(Powder), bioconversion하기 전의 한라봉과피추출물(CS), bioconversion 후의 한라봉과피추출물(CS-C)을 100 mg/kg/d 경구투여 하였다. 6주 또는 10주 동안 실험을 진행한 결과, HFD군에서 유의적으로 증가한 체중과 간 및 지방조직의 무게가 감귤류 처리군들에서 유의적으로 감소하였다. 이들 군에서는 간 및 지방조직의 조직학적 분석 결과 간과 지방조직 내의 지방 소구체의 크기 및 수의 감소를 볼 수 있었다. 또한 혈청의 생화학적 분석 결과 일부지표들에는 별다른 영향이 없었으나 total cholesterol, LDL, AST 등의 지표를 개선시켰으며 이는 6주차 보다 10주 처리한 군들에서 더 효과가 컸다. 이에 따라 체내 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPα, SREBP1c와 지방세포에서 분비되는 leptin, adiponectin의 mRNA발현을 확인한 결과, 감귤류군에서 PPARγ, SREBP1c, leptin, adiponectin의 발현량이 유의적이지 않지만 전반적으로 감소되었다. 이상의 결과들은 bioconversion한 감귤과피추출물이 체중증가와 지방조직의 축적을 억제하고 혈액 내의 지질을 개선하며 비만대사와 관련된 유전자들의 발현을 조절함으로써 비만 예방 및 개선에 긍정적인 효과를 줄 수 있음을 시사한다.
3. 제주산 한라봉 가공부산물로부터 면역활성이 우수한 다당체의 분리 및 소재화
● 본 연구에서는 현재 대부분 비료화 형태로 폐기 처리되고 있는 한라봉 및 천혜향 과피의 새로운 활용방안을 모색하고자, 제주산 한라봉 및 천혜향을 대상으로 pectinase로 처리하여 활성 다당체를 분리하였으며 이들이 갖는 각종 면역활성에 대해 검토하였다. 한라봉 및 천혜향의 단순 열수추출물로부터 분리한 조다당 획분(HBW-0와 CHW-0)과 한라봉 및 천혜향의 pectinase 처리 추출물에서 획득한 조다당 획분(HBE-0와 CHE-0)을 각각 조제하고 그들의 면역증진 활성을 비교하였다. HBE-0와 CHE-0는 각각 Sephadex G75을 이용하여 정제한 결과, 분자량이 상이한 4개의 한라봉 과피 유래 정제 다당획분(HBE-I, II, III 및 IV)과 3개의 천혜향 과피 유래 정제 다당획분(CHE-I, II 및 III)을 분리하였다. 한라봉 및 천혜향 과피 유래 정제 다당획분은 Superdex 75 컬럼이 장착된 HPLC에서 분자량을 확인한 결과, 한라봉의 경우 HBE-I, II 및 II는 각각 50, 25 및 10 kDa이었으며, 천혜향은 CHE-I, II 및 Ⅲ가 각각 19, 9 및 3 kDa으로 확인되었다. 특히, HBE-III와 CHE-II는 좌우대칭의 단일 peak를 나타내어 비교적 순수하게 정제되었음을 재차 확인하였다. 수율은 HBE-I(3.6%), HBE-II(9.6%) 및 HBE-IV(9.4%)에 비해 HBE-III(40.4%)가 가장 높게 나타났다.
● 이들을 대상으로 인체 초기 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하는 보체계에 대한 활성은 한라봉의 경우 1,000 μg/mL의 농도에서 HBE-0와 HBE-II는 동일농도를 가한 양성대조군(PSK)과 거의 동일한 활성을 나타냈지만, 천혜향의 경우 모든 다당 시료에서 낮은 활성을 나타내었다. 한라봉 및 천혜향 과피에서 조제한 정제 다당획분은 모두 Balb/c 마우스 유래 macrophage 또는 암세포인 Colon 26-M3.1 carcinoma cell line에 대하여 세포독성을 나타내지 않았으며, 비장세포에 대해서는 HBE-I만이 1,000 μg/mL의 농도에서 높은 증식능을 보여주었다. 한라봉 및 천혜향 과피 유래 정제 다당획분은 macrophage를 자극하여 IL6 및 IL12 생성 증가능을 보였다. IL-6의 경우 모두 한라봉 및 천혜향 과피 유래 조다당획분(HBW-0 및 CHW-0)에 비해서 효소처리한 조다당 또는 이들의 정제획분에서 생성능이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 하지만 IL-12의 경우에는 한라봉 과피 유래 조다당획분 및 이들의 정제 획분들은 높은 생성능을 나타내었으나, 천혜향 과피 유래 조다당획분 및 이들의 획분에서는 낮은 활성을 나타내었다.
● 종양세포에 대한 직접적인 살해능을 갖는 NK 세포에 대한 활성을 측정하기 위해 한라봉 유래 다당을 정맥주사하고, 활성화된 NK 세포의 Yac-1 종양주에 대한 살해능을 조사한 결과, HBE-I이 가장 높은 활성을 나타내었고 모두 농도 의존적으로 살해능이 증가됨을 확인할 수 있었다. 한편, 천혜향 과피 유래 조다당획분 및 이들의 획분분획들은 NK 세포 활성능은 무투여 대조군에 비해서 유의적으로 높았지만, 한라봉 획분들에 비해서는 낮은 수준으로 나타났다. 이상의 결과로부터 제주산 한라봉 및 천혜향 과피 유래 다당의 면역활성은 전반적으로 한라봉 다당이 더 우수한 것으로 평가되었으며, 재료의 확보 측면, 활성 다당의 수율 및 면역활성의 강도, 개발 가능성 측면에서 한라봉 부산물을 이용한 면역 소재 개발이 천혜향보다 유리하다고 판단되어 이후 실험에서는 한라봉 시료만을 이용하여 in vivo 실험을 진행하기로 하였다.
● 폐전이 종양세포주인 Colon 26-M3.1 carcinoma cell을 이용한 실험동물 모델에서 한라봉 과피 유래 다당은 모든 획분에서 농도의존적인 항전이 활성을 보여주었다. 특히, HBE-I과 HBE-III는 1,000 μg/mL의 농도에서 91.9%과 89.98%로 가장 높은 항전이 활성을 나타내었다. Antiasialo GM1에 의해 NK 세포 활성이 억제된 마우스를 이용한 실험 결과, NK 세포활성이 억제되어 있음에도 불구하고 HBE-0를 처리한 군에서는 암전이 억제 활성을 나타냈으며, HBW-0의 경우에는 NK 세포활성이 억제된 마우스에서는 전이 억제 효과가 나타나지 않았다. 이를 통해 암전이 억제 기전에서 NK 세포의 활성화와 함께 알려지지 않은 다른 면역계가 관여하고 있다는 것을 알 수 있었다. 한편, 마우스에 10일간 HBW-0 및 HBE-0를 총 20회 경구 투여한 결과, 두 시료 모두 농도 의존적으로 높은 NK 세포 활성화를 보였으며, HBE-0가 HBW-0보다 높은 활성을 나타내었다. 또한 HBW-0와 HBE-0의 경구투여에 의한 Colon 26-M3.1 carcinoma 세포의 전이 억제 실험 결과, 두 획분에서 우수한 항전이 활성을 보였지만, 100 μg/mL의 저농도에서는 HBE-0 경구 투여군에서 더 우수한 항전이 활성이 나타났다. HBE-0는 NK cell을 경유한 종양의 예방이나 치료에 효과적일 것으로 예견되었지만, 항전이활성에 대한 작용 기전을 밝히고 이를 새로운 기능성 식품소재로 개발하기 위해선 더 많은 후속연구가 필요할 것으로 판단된다. 이상의 결과를 종합할 때, 한라봉 과피에는 이제까지 알려진 건강에 유익한 성분 이외에도 활성 다당체가 존재하며 이들이 인체의 건강에 유익한 면역 증진활성 및 항전이 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 한라봉 과피을 이용, 건강기능식품의 소재로 개발하기 위해선 재료에 대한 효소처리 공정의 도입이 필수적임을 확인하였다.
● 지금까지의 연구결과를 종합해볼 때, 수율과 정제도가 우수했으며 면역활성 실험에서 강력한 NK 세포 활성과 항전이 활성이 확인된 한라봉 과피 유래 다당 HBE-III를 대상으로 그 구조적 특성에 대해 조사하였다. HBE-III는 구성당 분석을 행한 결과, 자연계에서는 드물게 관찰되는 2-methylfucose, 2-methylxylose, apiose, aceric acid, Kdo 및 Dha를 포함한 총 15종의 당류로 구성되어 있었으며, methylation 분석을 통해 2,3,4linked rhamnose, 3,4linked fucose 및 3-linked apiose 등의 특징적인 결합을 포함한 22종의 당쇄 결합이 확인됨으로서 pectin 유래의 rhamnogalacturonan-II(RG-II)와 유사 구조를 갖는 다당체임을 추정할 수 있었다. HBE-III를 산 가수분해 및 효소처리 후 GC, GC-MS 및 ESI-MS/MS를 통해 전체 구조를 해명한 결과, α-(1→4)-galacturono-oligosaccharide 주쇄에 Rhap-(1→5)-Kdo, Araf-(1→5)-Dha, AceA containing nonasaccharide 및 uronic acid rich oligosaccharide 분지를 갖고 있는 RG-II와 유사한 구조로 존재함을 확인할 수 있었다. 또한, pH 변화에 따른 HBE-III의 분자량 변화를 관찰한 결과 pH 1.6 이하의 조건에서 분자량 10 kDa의 주 peak가 분자량이 약 절반인 5.5 kDa의 peak로 이동하는 현상을 보였다. 이상의 결과로 한라봉 과피로부터 유래한 면역 활성 다당 HBE-III는 동일 크기의 2개의 subunit로 존재하는 RG-II dimer 구조임을 규명하였다.
4. 제주산 시트러스류(한라봉, 천해향, 감귤)를 소재로한 기능성 유제품 및 음료의 개발
● 본 연구에서는 제주산 농상가공부산물로부터 추출한 체지방 감소 및 면역 증강 기능의 신규 식품소재를 활용한 제품의 개발 및 산업화를 위한 실험을 진행하였다. 본 과제의 공동연구기관을 통해 얻어진 신소재는 두가지로서 첫 번째, 한라봉 및 천혜향 과피로부터 추출한 활성 다당체 소재와 두 번째, 감귤 및 한라봉 과피로 부터 추출한 플라보노이드 소재이다.
● 활성 다당체 소재의 제품화 적용 연구는 면역 기능의 시너지 효과를 기대한 발효유에 첨가하는 실험으로 2가지 품목을 개발하였다. 다당체를 첨가하여 발효유의 풍부한 식감을 강조할 수 있는 유산균주의 선정 및 제조 공정 중 균질 공정을 생략함으로써 홈메이드 타입의 높은 점성을 가지고 있는 감귤맛 발효유A와 면역력 기능을 활용한 건강기능식품 발효유B 두 종류의 제품을 개발하였고 이 중 건강기능식품 발효유B 제품의 경우 현재 제품출시를 목적으로 한 개별인정형 소재로의 인증을 위해 임상실험을 진행하고 있다. 두 종류의 활성다당체 첨가 발효유의 관능비교 결과 홈메이드 타입의 발효유A가 선호도가 우수하게 나왔으며, 건강기능식품 발효유B의 경우 약리적인 느낌의 관능적 특성이 강한 것으로 나타났으며 기능성을 고려한 맛의 특성 역시 만족도를 보이는 것으로 확인하였다.
● 플라보노이드 소재를 활용한 연구는 주스, 음료 및 두유 제품 3가지 품목을 개발하였다. 주스의 경우 감귤과즙 100% 함량을 기본으로 하여 플라보노이드 특유의 쓴맛을 개선하기 위한 보조 소재가 첨가된 형식으로 개발 되었다. 플라보노이드 첨가 음료의 경우 과채주스, 음료의 시장 진입을 위한 가격경쟁력을 위한 저가형 제품으로 개발되었으며 감귤과즙과 오렌지 과즙이 혼합된 제품으로 개발 되었다. 주스와 음료의 경우 음료 제품이 당류와 향료가 첨가된 특성 상 관능선호도가 높게 나왔으며, 전반적으로 플라보노이드의 첨가로부터 오는 쓴맛이 시트러스 특유의 쓴맛과 어울릴 수 있다는 결과를 확인 할 수 있었다.
● 플라보노이드 소재의 두유제품 첨가를 위한 연구는 체지방 조절 기능을 강조하기 위한 식이섬유가 풍부한 건강식 두유 제품으로 개발하였다. 대두의 비지성분까지 그대로 갈아서 플라보노이드 소재와 두유액을 제외한 어떠한 첨가물도 사용하지 않은 무첨가 두유제품으로서 시제품 제작을 통한 제조공정을 확립하였으며 유통기한 설정 실험결과 냉장 조건에서 11일간의 안정성이 확보됨을 확인하였다.
● 본 연구과제를 통해 활성 다당체 첨가 제품 2종, 플라보노이드 첨가 제품 3종, 총 5가지 제품을 개발 완료 하였다. 이중 신체 면역 증진을 기능으로 하는 활성 다당체 소재를 개별인 정형 소재로서 인증을 추진 중에 있으며, 최종적인 건강기능식품 발효유로 출시할 계획에 있다. 플라보노이드 첨가 제품의 최종 출시를 위한 방안은 본 과제를 통해 개발된 주스, 음료, 두유 제품을 바탕으로 검토 중에 있다.

Abstract ▼

Ⅳ. Result of Project
1. Build the extraction & separation and industrial technique of functional ingredients from Jeju citrus byproducts (juice waste and peel) with the bioconversion
● In this study, the secure by-product obtained in Jeju Agricultural, and agricultural raw materials, the econo

Ⅳ. Result of Project
1. Build the extraction & separation and industrial technique of functional ingredients from Jeju citrus byproducts (juice waste and peel) with the bioconversion
● In this study, the secure by-product obtained in Jeju Agricultural, and agricultural raw materials, the economic analysis of them, the optimum obtained methods by various extraction conditions research, the screening microorganisms and commercial enzymes for bioconversion, process optimization in laboratory research, commercial development studies as pilot plant designed for the optimal production were performed.
● Realted to the secure the raw materials supply, we found the direct supply process from the major citrus manufacturers such as Lotte Chilseong, Jeju Province Development Corporation, and Ilhae worked in relation to supply materials and methods, planned to build a facility at our factory established in Jeju.
● For product development, low-cost, high-efficiency extraction conditions were established with a variety of extraction, such as ultra-high pressure, supercritical, subcritical solvent extraction and immune polysaccharides and flavonoids applicable actual production. The commercial enzymes and microorganisms were selected for the Bioconversion, and the optimum method for the functional components was acquired with various extraction. Using selected process, the maximum manufacturing process was established.
● As the results of optimum extraction experiments, in the supercritical, subcritical, and the hot water extraction, the overall extraction yield was generally high, while the purity of the extracts was low in flavonoids, however, the yield of ethanol extracts was low, but the purity of the ethanol extracts was about 2 to 2.5-fold increase in the content of flavonoids. The polysaccharide material was found to be high yield in the supercritical, subcritical extraction and hot water extraction, but the polysaccharides was not extracted in ethanol extracts. From these results, hot-water extraction method for extracting the optimum materials was determined in flavonoids and polysaccharide production.
● Cellulase KN and Cytolase were selected for industrial enzymes for Bioconversion in the transition to the non-flavonoids glycosides component with a high conversion rate of 80%, 90% respectively, however, Rapidase, Pectinex, Cytolase PCL5, and Pectinase were confirmed in enzyme producing a polysaccharide. Based on these results, we selected Cytolase as the optimal enzyme for flavonoid glycosides and non-immune polysaccharide production.
● Developmental results of an optimal process performed using the selected enzyme were that the optimum enzyme addition for the production of non-glycoside flavonoids material and immune polysaccharide material was 0.5%, the reaction temperature is 50℃, pH is 4 to 7, the reaction time was 16 hrs , and the optimal process was established for the development of products
● In Flavonoids resouces, products were developed dividing into two food categories, a high purity powder, and low purity liquid. The process was dependent with proucts in consideratipn with the producing yields and operating costs. On the other hand, in the immune polysaccharide material, products was diversed according to the purity of the starting materials and products. Also, we established a integrated process to produce a polysaccharide material and flavonoids at the same time.
● The quality control standards and production standards was established by setting the various formulations research and development of product specifications. By reliability assessment guide, a step-by-step scale up test was performed for the production, process-specific control point & factor was established.
● With formulation development and processing suitability assessment, high purity materials was assessed that the powder and granule formulations were appropriate because of the low solubility of 100ppm flavonoids. and was confirmed as the colloidal formulations. In the low pure flavanoids material, a liquid dosage form was evaluated as suitable. The polysaccharide material have high solubility than 0.1% (w / v), powders and granules was evaluated as suitable formulation.
● As stability assessment, flavonoids material was found that change the content of the key component was not greater stored at 40 ℃, for 35 days in liquid phase and the dry powder formulation. In immune polysaccharide material, for a measure for the stability of the material, the browing reaction was used as the indicator, the dry powder formulation was evaluated to be stable at 60 ℃, until 14 days storage.
● For product specifications, naringin, narirutin, hesperidin, naringenin and hesperetin, and total polyphenol content were set to be function indicators in flavonoids, content of rhamnose and arabinose, qualitative detection of 2-methylfucose, and 2—methylxylose, and total polyphenol content were set to be ket components in polysaccharides materials.
● Production of goods was carried out by utilizing facilities of Jeju Technopark, polysaccharide production material and flavonoids were produced 7.5kg, and 72kg, repectively with 150Kg citrus peel powder raw material. As the results of conducting by the verification of the specifications for each goods produced by utilizing these result, the material of polysaccharides and flavonoids were suitable for both the reference standard. In the results of evaluation the immune effects and anti-obesity effect, both polysaccharides and flavonoids were confirmed highly bioactive material. In addition, a single dose toxicity safety evaluations conducted by GLP Authority organization showed that flavonoids and polysaccharides both showed rats grid reference schematic (Approximate Lethal Dose, ALD) of the test animals Sprague-Dawley (SD) were more than a 2,000 ㎎ / ㎏, and a 2,000mg / kg. repectively.
● The economic analysis was conducted by the comparisos with specifications and prices of competitive products. The sales strategy with the target consumer and market research was established and a products promotional trial was conducted by design promotional literatures.
● The comparisions with developed material and competitive material showed the polysaccharide extract material had quality service at a competitive price with high efficiency compared to competing products, and the material flavonoids was estimated to be sufficient competition thing similar efficacy and cheap in price.
● During the target consumer surveys and market analysis, fat reduction materials and immune enhancement using flavonoids and polysaccharide material were assessed as being competitive enough in commercialization.
● Sales strategy was that the develope material was first applied to drink products like dairy drinks and regular drinks with the manufacturing and product safety, the familiarity of the material, reasonable price for the increase the awareness of the product . After then various end-use products were develpoed for the formulation to meet consumer needs such as tableting, and powder.
● For the leverages as sales and marketing material to manufacture and introduce products, the promotional material was produced and use actively. The promotional trial were to join in exhibitions of five IFIA JAPAN 2014 for the commercialization of products, introduction of products involved in the development of domestic and foreign food ingredients and additives.
2. Functional analysis of anti-oxidant and anti-inflammation from agricultural by-products (Camkyul and Hallabong) in Jeju-do
● Citrus and its peels have been used in Asian folk medicine and it may be good strategy to utilize citrus peels, which are by-products from juice and/or jam processing. Citrus peels are abundant in a variety of flavanones and these flavanones have glycones and aglycones forms. Aglycones are more potent than glycones in a variety of physiological functions because aglycone absorption is more efficient than glycones. Bioconversion with cytolase converted narirutin and naringin into naringenin and hesperidin into hesperetin, respectively.
● HPLC chromatograms showed that citrus and Citrus peel extracts with cytolase have about 23% and 30% of total flavonoids, respectively. There were substantial bioconversions of narirutin to naringenin and of hesperidin to hesperetin, respectively. The study of 1st year was aimed to investigate anti-oxidant and anti-inflammatory effects of bioconversion of Citrus unshiu (CU; Camkyul) and Citrus sphaerocarpa (CS; Hanllabong) peel extracts with cytolase (CU-C) in RAW264.7 cells. All of citrus peel extracts had DPPH scavenging activities in a dose dependent manner and bioconversion group with cytolase were more potent than intact citrus peel extract. RAW264.7 cells were pre-treated with different concentrations of citrus peel extracts (CU & CU-C: 0∼500 μg/mL, CS & CS-C: 0∼200 μg/mL) for 4 hr and then stimulated by 1 μg/mL liopolysaccharide (LPS) for 8 hr. 500 μg/ml CU-C, 200 μg/ml CS and 100 μg/ml CS-c showed strong antioxidant effect with high ORAC value. All of citrus peel extracts decreased mRNA levels and protein expression of LPS-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in a dose-dependent manner. Especially, CU-C and CS-C markedly inhibited mRNA and protein expression of iNOS and COX-2 than those of intact citrus peel extracts. All of citrus peel extracts decreased NO production by iNOS activity. This result suggests that bioconversion of citrus peel extracts with cytolase may be more potent functional food materials for prevention of chronic diseases attributable to oxidation and inflammation by boosting the anti-inflammatory effects of citrus peels.
● Since citrus flavonoids have a variety of physiological properties such as anti-oxidant, anti-inflammation, anti-cancer, and anti-obesity, we investigated whether bioconversion of Citrus unshiu (CU) and Citrus sphaerocarpa (CS) with cytolase (CU-C and CS-C) ameliorates the anti-obesity effects by modulation of adipocyte differentiation and lipid metabolism in 3T3-L1 cells for 2nd year. As described before, treatment with cytolase decreased flavanone rutinoside forms (narirutin and hesperidin) and instead, increased flavanone aglycone forms (naringenin and hesperetin). During adipocyte differentiation, 3T3-L1 cells were treated with 0.5 mg/ml of Sinetrol (a positive control), 0.5 mg/ml of citrus peel extracts. Adipocyte differentiation was inhibited in CU-C, CS, and CS-C groups, but not in CU and Sinetrol groups. Citrus peel extracts with cytolase markedly suppressed the insulin-induced protein expression of CCAAT/enhancer-binding protein α(C/EBPα) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) as well as the mRNA levels of CEBPα, PPARγ, and SREBP1c. All groups but CS-C significantly increased the adipolytic activity with the higher release of free glycerol than control group in differentiated 3T3-L1 adipocytes. Whereas CU-C and CS-C are particularly superior in suppression of adipogenesis, CS-C was less effect on stimulation of lipolysis. These results suggest that bioconversion of citrus peel extracts with cytolase enhances aglycone flavonoids and improve the anti-obesity metabolism, which may contribute to preventing obesity through both inhibition of key adipogenic transcription factors and, in part, induction of adipolytic activity.
● The 3rd year study was aimed to investigate effects of citrus peel extracts with cytolase on high fat diet-induced obesity metabolism in mouse models. For Citrus unshiu (CU; Camkyul) study, female C57BL/6 mice (n=76) were fed a chow diet (ND; Nomal Diet, 18% fat of total calories) or a high fat diet (HFD; 60% fat of total calories) with/without supplementation of 150 mg/kg/d of CU peel powder (Powder), CU and CU-C by oral gavage for 6 to 10 weeks. For Citrus sphaerocarpa (CS; Hanllabong) study, HFD diet in four HFD diet groups was fed to induce obesity for the initial 8 weeks and then male C57BL/6 mice (n=86) were fed a chow diet (ND; Nomal Diet, 18% fat of total calories) or a high fat diet (HFD; 60% fat of total calories) with/without supplementation of 100 mg/kg/d of Sinetrol, CS peel powder (Powder), CS and CS-C by oral gavage for 6 to 10 weeks. We found that weight of body, liver and adipose tissue in HFD+all citrus peel extracts were significantly less than those in HFD. In histological analysis, CU-C and CS-C reduced the number of lipid globule in liver and the size of adipose tissue. They also reduced levels of free fatty acid, total cholesterol and triglyceride in serum, compare to HFD. CU-C and CS-C reduced mRNA levels of PPARγ, SREBP1c, leptin and/or adiponectin. They improved some biochemical markers, total cholesterol, LDL, and AST, which was more effect in 10 weeks than in 6 weeks. These results suggest that bioconversion of citrus peel extracts with cytolase may ameliorate body weight gain, accumulation of fat and lipids through regulation of genes expression related to obesity metabolism.
3. Isolation and application of immuno-stimulating polysaccharides from agricultural by-products(Hallabong and Cheonhyehyang) in Jeju-do
● In order to develop the new industrial application from agricultural by-products, the peels of Korean citrus Hallabong and Cheonhyehyang, the crude polysaccharides (HBW-0 and CHW-0) from hot water extracts and the enzyme-treated crude polysaccharides (HBE-0 and CHE-0) from pectinase digestsed were prepared, and their immuno-stimulating activities were estimated. The polysaccharide fractions in pectinase digest from peels of Hallabong and Cheonhyehyang(HBE-E and CHE-E) were further fractionated by column chromatography on Sephadex G75 to give the four subfractions from Hallabong(HBE-I, II, III and Ⅳ) and three subfractions from Cheonhyehyang(CHE-I, II and Ⅲ) with different molecular weight. HBE-I, II and III were eluted as almost single HPLC peaks and their molecular weights were estimated to be 50 kDa, 25 kDA and 10 kDa, whereas CHE-I and II were 19 kDa and 9 kDa, respectively. Especially, HBE-III and CHE-II subfractions were eluted mainly as a single peak, regarding high purity. The yield of HBE-III(40.4%) was higher than that of HBE-I(3.6%), HBE-II(9.6%), and HBE-IV(9.4%).
● The enzyme-catalyzed polysaccharide from Hallabong peels(HBE-0) and its subfraction, HBE-II showed the highest anti-complementary activity at 1,000 μg/mL that similar effect with positive control(PSK), whereas all polysaccharide fractions from Cheonhyehyang did not show anti-complementary activity. In an in vitro cytotoxicity analysis, all polysaccharides from Hallabong and Cheonhyehyang peels did not affect the growth of murine macrophages from Balb/c mice and Colon 26-M3.1 colon carcinoma cell line, whereas HBE-I showed high splenocyte proliferating activity at 1,000 μg/mL. Peritoneal macrophages stimulated with pectinase-catalyzed polysaccharide fractions from HBE-0 or CHE-0 produced various cytokines such as IL-6 and IL-12. For IL-6 producing activity, the subfrctions purified from pectinase-treated samples were higher than those of crude polysaccharides(HBW-0 or CHW-0). However, in IL-12, HBE-0 and their subfractions showed higher production than HBW-0, whereas CHE-0 and their subfractions did not show enhanced activity in comparison with CHW-0. In estimation of NK cell cytolytic activity against tumor cells, intravenous(i.v) administration of HBE-I showed the highest NK cell cytolytic activity against Yac1 tumor cells in dose dependent manners in HBE-0 and other subfractions. However, the CHE-0 and its subfractions showed significantly higher NK cell activity than non-treated control, but their activities were lower than those of Hallabong. In these results, immuno-stimulating activities of polysaccharide isolated from Korean citrus Hallabong peels were more effective than those of Cheonhyehyang peels.
● In experimental lung metastasis of Colon26-M3.1 carcinoma cell, prophylactically intravenous (i.v.) administration of polysaccharides from the pectinase digest of Hallabong peels, significantly inhibited lung metastasis in dose dependent manners. Especially, HBE-I and III showed high activity of anti-metastasis at a dose 1,000 μg/mouse(91.3 and 89.8% inhibition of control group). In experimental pretreatment with anti-asialo GM1 serum which selectively eliminates NK cells, the removal of NK cells partially appeared the antitumor effect of HBE-0 on lung metastasis of Colon26-M3.1 carcinoma cells, whereas HBW-0 did not showed inhibitory effect of lung metastasis. These results indicated that the inhibitory effect of HBE-0 on tumor metastasis was mediated by NK cell activation and another unknown immune functions. Meanwhile, 20 times oral administration of HBE-0 or HBE-0 for 10 days induced the activation of NK cells in dose dependent manners, but HBE-0 had higher NK cell activity than HBW-0. Also, Prophylactic oral administration (p.o.) of HBE-0 and HBE-0 significantly inhibited metastasis in experimental lung metastasis of Colon26-M3.1 cells. However, oral administration of HBE-0 was more effective than that of HBW-0 at a dose 100 μg/mouse. Therefore, we suggest that the administration of HBE-0 may be effective for preventing and/or treating cancer through NK cell activation. However, further studies are needed to elucidate the possible mechanisms of the anti-metastatic activity and to investigate the other beneficial effects of HBE-0 for the development of a new biological response modifier. From these results, the peels of Hallabong contain the biologically active polysaccharides which promote immune enhancement and anti-metastatic activity in addition to other health-beneficial ingradients ever known. Moreover, the enzyme treated process might be necessary to prepare functional food materials from Korean citrus Hallabong peels.
● In comprehensive results, HBE-III showed high yield and purity in addition to potent NK cell activity and anti-metastatic activity. Therfore we tried to characterize the micro-structure of HBE-III. HBE-III consisted of 15 different monosaccharides which included rarely observed sugars, such as 2-O-methyl-fucose, 2-O-methyl-xylose, apiose, aceric acid, 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(Kdo), and 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid(Dha). Methylation analysis indicated that HBE-III comprised 22 different glycosyl linkages such as 2,3,4linked Rhamnose, 3,4linked Fucose and 3'linked Apiose, being characteristic of rhamnogalacturonan-II(RG-II). The primary structure of HBE-III was elucidated by sugar composition, methylation analysis and oligosaccharide sequence analyses using GC, GCMS, ESIMS and ESIMS/MS after sequential degradation using partial acid hydrolysis and enzymatic treatment. The results indicated that HBE-III contained four differenet chains such as Rhap(1→5)Kdo and Araf(1→5)Dha structural elements, aceric acid-containing nonasaccharide and uronic acid-rich oligosaccharide chains in addition to an α-(1→4)-galacturono-oligosaccharide main backbone. HPSEC indicated that HBE-III mainly comprised RG-II of higher molecular mass(10 kDa) and that the changes of molecular mass to apparent 5.5 kDa under less than pH 1.6 were occurred. From above results, it was inferred that the immuno-stimulating polysaccharide from Korean citrus Hallabong peels, HBE-III was mainly present as a RG-II dimer.
4. Using the immune polysaccharides and the flavonoid chibang controlled product development and industrialization
● In this study, we conducted an experiment for the development and industrialization of the food products using materials for body fat loss and immune function extracted from Jeju by-products. The material of this study, the two types. First, it is extracted from the rind Hallabong and cheonhyehyang active polysaccharide material. Second, extracted from citrus peel flavonoids Hallabong material.
● We developed two items to be added to the yogurt with experimental studies of the active material is polysaccharide. The home-made type of viscosity is a strong feature A citrus yogurt. Another type yogurtB can be sold as a functional food yogurt. The progress of a clinical trial with the purpose of the yogurt product B is released.
● In order to using a flavonoid product research material, we developed juice, beverages, and soymilk. The citrus juice of 100%, has been developed by the addition of materials to improve the bitter taste of the unique flavonoids auxiliary form juice. We developed a low-cost product for a competitive price for market entry juice flavonoids added beverages. (The citrus beverage is mixed with cirus and orange concentrate.) Sensory test result of the juice and beverage, high affinity drink products. And it was confirmed that the bitterness of citrus juice flavonoids compatible. In order to using a flavonoid for soymilk, we developed a fiber-rich diet healthy soy products to emphasize the fat control. Any material and soy flavonoid ingredients except soy liquid additive is not used to establish the manufacturing process was the production prototype was set up with 11 days shelf life.
● The product was added to two kinds of polysaccharides, flavonoids added three kinds of products developed through this research project completed.
● Standing into clinical trials, and plans to launch a dietary supplement fermented finally polysaccharide material. The product is added to the Review Release of flavonoids.