[보고서]유전자 현장진단을 위한 비정제 DNA 증폭 기술 개발 및 제품화

유전자 현장진단을 위한 비정제 DNA 증폭 기술 개발 및 제품화 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	나노헬릭스
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2012-07
과제시작연도	2011
주관부처	중소기업청 Small and Medium Business Administration
등록번호	TRKO201500017496
과제고유번호	1425069458
사업명	창업성장기술개발사업
DB 구축일자	2015-10-31
키워드	Multiple Displacement Amplification(MDA).Isothermal DNA.Amplification.WGA.Direct WGA.Direct PCR.Post-of-Care-Testing(POCT).

초록 ▼

□ 개발목표
계획
1. Direct PCR 기술 개발 및 제품화
- 3종의 Direct PCR 시제품 제작 HelexAmp Direct PCR Kit [Blood, Animal, Plant]
2. Direct WGA 기술 개발 및 제품화
- 3 종의 Direct WGA 시제품 제작 HelixAmp Direct Genome Amplifier [Blood, Animal, Plant]
3. One-Step Direct WGA-PCR 기술 개발 및 제품화
- 1 종의 시제품 제작
실적
1. Direct PCR 기술 개발 완료 및 3 동의 시제품 제작 완료
- HelixAmp Direct PCR Kit [Blood]
- HelixAmp Direct PCR Kit [Mouse Tail]
- HelixAmp Direct PCR Kit [Plant]
2. Direct WGA 기술 개발 완료 및 4동의 시제품 제작 완료
- HelixAmp Direct WGA Kit [Blood]
- HelixAmp Direct WGA Kit [Animal]
- HelixAmp Direct WGA Kit [Plant]
- HelixAmp Direct Genome Amplifier [Rice]

□ 정량적 목표항목 및 달성도
1. Direct WGA 증폭에 사용되는 동물 시료 양 : 계획(혈액 : < 0.5 ul 동물 : ≤1 mm), 실적(혈액 : 0.025 ul, 동물 조직 : 0.2 mm)
2. Direct WGA 증폭에 사용되는 식물 시료의 양 : 계획(≤1 mm), 실적(0.2 mm)
3. Direct PCR 증폭에 사용되는 조직 시료의 양 : 계획(≤ 0.5 mm), 실적(Direct Method : 0.5 mm Buffered Method : 0.2 mm)
4. Direct PCR 증폭에 사용되는 혈액 시료의 양 : 계획(Rxn Vol의 10% 이하), 실적(0.025 ul (0.05%/50 ul rxn vol))
5. Direct WGA 증폭 시간 : 계획(혈액 : 2 시간 동,식물 2시간), 실적(혈액, 동물, 식물 : 1.5 시간)
6. 증폭효율 : 계획(혈액 : 500 배 동,식물 : 500 배), 실적(1,000 배 ~ 10,000배)
7. 테스트 시료 점수 : 계획(Dirwct WGA 동물 : 5 종 식물 : 10 종), 실적(Direct PCR 혈액 1 종 동, 식물 : 10 종 Direct WGA 혈액 : 3종, 동물 : 8종, 식물 : 14종 기타 임상관련 시료 : 5 종 Direct PCR 혈액 : 3종, 동물 : 13 종, 식물 : 15종 기타 임상 관련 시료 : 4 종)

□ 기대효과
- DNA Prep 시장 대체
- Direct PCR 및 WGA 기술의 국내 기술 확립으로 국가 경쟁력 강화, 틈새 시장 공략
- 매출 증대 및 고용 창출

□ 적용분야
- Direct PCR : 유전자 현장진단/진병원의 조기 진단/동식물 검역/
- Direct WGA : 희귀 생물 유전자원 확보/법의학적 시료의 빠른 분석/유전자형 분석

목차 Contents

표지 ... 1
중소기업 기술개발사업 최종보고서 ... 2
제출문 ... 3
요약서(초록) ... 4
목차 ... 5
제1장. 개발 기술의 개요 ... 6
제1절. 연구 개발 기술의 개요 및 개발 필요성 ... 6
1. 대상 개발 기술의 개요 ... 6
2. 연구 개발의 필요성 ... 9
3. 관련기술 현황 ... 14
제2장. 기술 개발 목표 및 개발 내용 ... 21
제1절. 기술 개발 목표 ... 21
1. 최종 기술 개발 목표 ... 21
2. 세부 개발 내용 ... 22
제2절. 기술 개발 내용 ... 23
1. Direct PCR 기술 개발 ... 23
2. Direct Whole Genome Amplification(WGA) 기술 개발 ... 55
3. One-Step Direct WGA-PCR 기술 개발 ... 82
4. 구입 연구 기자재 ... 86
제3절. 기술 개발 목표 대비 개발 실적 ... 87
1. 개발 계획 대비 실적 ... 87
2. 기술 개발 평가 항목의 달성도 ... 88
제3장. 성과 요약 및 기대효과 ... 89
제1절. 기술 개발 성과 요약 ... 89
1. Direct PCR 기술 개발 및 제품화 ... 89
2. Direct WGA 기술 개발 및 제품화 ... 89
제2절 기대효과 및 향 후 개발 제품의 활용 방안 ... 90
1. 현장 진단을 위한 분자 진단 제품 개발 파급 효과 ... 90
2. 관련 기술의 국산화 및 국가 기술 경쟁력 확보 ... 90
3. 매출 증대 및 고용 창출 효과 ... 91
부록 : 외부 기관 시제품 평가서 ... 92
끝페이지 ... 97

표/그림 (59)

표 Direct PCR을 위한 최적 PCR 효소 선별. Human whole blood 시료와 human beta-actin gene -specific primer를 이용하여 테스트.
표 Direct PCR을 위한 최적 PCR 효소 선별. 2 가지의 쌀 품종 (일미, 운두) 와 2쌀 품종 검정에 사용되는 프라이머를 이용하여 테스트.
표 Direct PCR을 위한 최적 PCR 반응 조건 set-up. Reaction buffer의 KCl 농도에 따른 Direct PCR 효율을 1 μl의 사람 전혈과 0.5 mm 크기의 담배 잎 조직을 사용하여 테스트.
표 Direct PCR을 위한 최적 PCR 반응 조건 set-up. Reaction buffer의 Mg2+ 농도에 따른 Direct PCR 효율을 1 μl의 사람 전혈을 사용하여 테스트.
표 Direct PCR을 위한 최적 방법 set-up. 조직 시료의 효과적인 Direct PCR을 수행하기 위하여 Dilution Buffer를 이용하여 테스트. Figure
표 Direct PCR을 위한 최적 방법 set-up. Dilution Buffer 처리조건 테스트.
표 Direct PCR을 위한 최적 방법 set-up. (A) 동물 조직 시료로부터 Buffer method의 최적 방법 테스트. (B) Dilution Buffer처리 과정에서 Proteinase K의 효과 테스트.
표 Buffer Method로 준비된 Lysate의 안정성 테스트.
표 Premix 형태의 Direct PCR Mix 제조 및 테스트.
표 혈액 시료로부터 Direct PCR 테스트. 혈액 시료의 양에 따른 Direct PCR의 증폭 효율을 비교하기 위하여 혈액으로부터 분리/정제된 gDNA를 대조군으로 비교 테스트함.
표 혈액 시료로부터 다양한 프라이머를 사용하여 Direct PCR 테스트. 사람의 혈액 시료로부터 human actin 유전자 특이적인 프라이머와 human estrogen receptor(ER) 유전자 특이적인 프라이머로 Direct PCR 테스트.
표 다양한 동물 혈액 시료로부터 Direct PCR 테스트. 각각 1 μl의 사람(Human), 돼지(Pig), 그리고 생쥐 (Mouse)의 혈액 시료로부터 Direct PCR 테스트.
표 혈액 시료가 흡착된 FTA Card (Whatman, USA)로부터 Direct PCR 테스트. 혈액이 흡착된 FTA card로부터 0.5 mm 크기의 membrane 조각을 punch하여 washing 여부에 따른 Direct PCR 테스트.
표 동물 근육 조직으로부터 Direct PCR 테스트. 돼지와 소의 근육 조직이 Direct Method (0.5 mm 크기의 조직 사용)와 Buffered Method를 이용하여 테스트 됨.
표 동물 근육 조직으로부터 Direct PCR 테스트. Rat와 mouse tail 시료가 Direct Method (0.5 mm 크기의 tail 사용)와 Buffered Method를 이용하여 테스트 됨. Buffered Method에서 dilution buffer와 혼합 후, incubation 시간 (5 min 또는 3 hours)에 따른 증폭 효율 비교.
표 Mouse tail 크기에 따른 Direct PCR 테스트.
표 Mouse의 각 기관 조직(organ tissue)로부터 Buffered Method를 통한 Direct PCR 테스트.
표 Direct PCR을 활용한 비만 유전자 돌연변이 mouse의 genotyping 테스트.
표 Direct PCR을 활용한 VDUP1-deficient mouse의 selection 테스트.
표 Direct PCR을 활용한 B6(c)-Mir150 tm1Rsky/J knock-out mouse의 selection 테스트.
표 Paraffin-embedded tissue로부터 Direct PCR 테스트.
표 타액 시료의 양에 따른 Direct PCR 테스트.
표 머리카락 시료에서 Direct PCR 테스트. Target DNA의 증폭은 모근 부분(Hair root)에서만 확인 됨.
표 분변 시료로부터 Direct PCR 테스트. 분변 시료는 Buffered Method에서만 Target DNA를 증폭하였으며, 특히 다른 시료들과는 다르게 많은 양의 Dilution Buffer를 사용하면서 상대적으로 더 적은 양의 Lysate를 사용할 경우, 더 효율적인 Direct PCR 증폭 결과를 얻을 수 있음이 확인됨.
표 11종의 식물 잎 조직 시료로부터 Direct PCR 테스트 - 1차 Direct PCR 테스트. Direct Method에서 일부 증폭 효율이 낮은 시료에 대하여 Buffered Method로 Target DNA의 증폭을 확인함.
표 7종의 식물 잎 조직 시료로부터 Direct PCR 테스트 - 2차 Direct PCR 테스트.
표 5 종의 식물 잎 조직 시료로부터 Direct PCR 테스트. 식물 종자 시료도 Direct Method에서 모두 Target DNA의 증폭이 확인되었고, 일부 증폭 효율이 낮은 시료의 경우 Buffered Method에서 효율적인 증폭을 확인함.
표 Direct PCR을 통한 유전자 변형 식물 종자의 검정. 유전자 변형 식물에 외부 DNA로 도입되는 CaMV 35S Promoter 부분의염기서열에 특이적으로 디자인된 프라이머를 이용하여 유전자 변형 종자를 검정.
표 3 종의 Direct PCR 시제품
표 HelixAmp(TM) Direct PCR Kit [Blood] 시제품의 구성
표 HelixAmp(TM) Direct PCR Kit [Mouse Tail] 시제품의 구성
표 HelixAmp(TM) Direct PCR Kit [Plants] 시제품의 구성
표 시료 형태에 따라 적용될 Direct WGA 프로토콜 확립.
표 사람의 혈액시료로부터 Direct WGA 테스트. 0.025 μl 전혈에서도 효과적인 Direct WGA 산물이 증폭되었고, 증폭된 Direct WGA 산물로 Target DNA를 PCR detection한 결과 100 배 희석한 WGA 산물에서도 Target DNA가 검출됨.
표 서로 다른 동물 혈액시료로부터 Direct WGA 테스트. 0.5 μl 또는 1 μl 전혈에서 모두 효과적인 Direct WGA 산물이 증폭됨.
표 혈액 시료에서 Direct WGA의 효율 테스트. 104 배 까지 희석된 돼지, 생쥐, 사람의 전혈에 대한 Direct WGA 산물과 SOX21 유전자 특이적인 프라이머(product size : 237 bp)를 이용하여 테스트.
표 다양한 동물조직 시료로부터 Direct WGA 테스트.
표 다양한 동물 조직 시료에서 Direct WGA의 효율 테스트. 동물 조직에서는 103 이상의 효율로 전체 genomic DNA를 증폭함. 104 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 mouse GAPDH 유전자 특이적인 프라이를 이용하여 644 bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 다양한 식물 잎조직 시료에서 Direct WGA 테스트. 5 mm 크기의 잎 조직을 50 ul DM buffer와혼합 후 2 ul 의 lysate(0.2 mm 크기의 조직을 사용한 것과 동일)로부터 30 ℃, 1시간 30분 동안 반응.
표 다양한 식물 잎조직 시료로부터 증폭된 Direct WGA 산물의 PCR 테스트. 103 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 Chloroplast tRNA-Val 특이적인 프라이를 이용하여 297 bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 다양한 식물 잎조직 시료로부터 증폭된 Direct WGA 산물의 PCR 테스트. 103 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 RbcL 유전자에 특이적인 프라이를 이용하여 670 bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 다양한 식물 종자로부터 Direct WGA 테스트. 5 mm 크기의 분쇄된 종자를 50 ul DM buffer와 혼합 후 2 ul 의 lysate(0.2 mm 크기의 조직을 사용한 것과 동일)로부터 30 ℃, 1시간 30분 동안 반응.
표 다양한 식물 종자로부터 증폭된 Direct WGA 산물의 PCR 테스트. 103 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 Chloroplast tRNA-Val 특이적인 프라이를 이용하여 297 bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 다양한 식물 종자로부터 증폭된 Direct WGA 산물의 PCR 테스트. 103 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 RbcL 유전자에 특이적인 프라이를 이용하여 670bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 쌀로부터 Direct WGA에 의하여 합성되는 전체 DNA의 정량. 30분 간격으로 증폭되는 DNA 양을 Quant-iT™ Assay Kit와 Qubit fluorometer (Invitrogen, USA)를 이용하여 측정.
표 일반미 품종 쌀시료에 대한 Direct WGA 테스트. 12 종의 일반미 쌀 품종에 대하여 테스트 됨.
표 일반미 품종 쌀시료로부터 증폭된 Direct WGA 산물에 대한 쌀 품종 검정용 Allele-specific Multiplex PCR. Multiplex PCR에서 증폭된 산물의 pattern을 공시된 각 품종의 코드번호와 확인하여 쌀 품종에 대한 Direct WGA 증폭 효율 및 정확도를 평가하였다.
표 찹쌀 품종 쌀시료에 대한 Direct WGA 테스트. 11의 일반미 쌀 품종에 대하여 테스트 됨.
표 찹쌀 품종 쌀시료로부터 증폭된 Direct WGA 산물에 대한 쌀 품종 검정용 Allele-specific Multiplex PCR. Multiplex PCR에서 증폭된 산물의 pattern을 공시된 각 품종의 코드 번호와 확인하여 쌀 품종에 대한 Direct WGA 증폭 효율 및 정확도를 평가하였다.
표 임상 및 법의학 관련 유사 시료에 대한 Direct WGA 테스트.
표 임상 및 법의학 관련 유사 시료로부터 증폭된 Direct WGA 산물의 PCR 테스트. 104 배까지 연차 희석한 Direct WGA 산물에 대하여 human beta-globin 유전자에 특이적인 프라이를 이용하여 546 bp 크기의 PCR 산물에 대한 증폭 민감도를 테스트함.
표 4 종의 Direct WGA 시제품
표 HelixAmp(TM) Direct PCR Kit [Blood] 시제품의 구성
표 HelixAmp(TM) Direct WGA Kit [Animal] 시제품의 구성
표 HelixAmp(TM) Direct WGA Kit [Plants] 시제품의 구성
표 HelixAmp(TM) Direct Genome Amplifier [Rice] 시제품의 구성
표 One-Step Direct WGA-PCR 기술 개발의 위한 조건 set-up. WGA Buffer 시스템에서 target DNA의 PCR 증폭 여부 테스트. 담배 잎으로부터 분리/정제된 10 ng의 gDNA와 담배 actin 유전자 특이적인 프라이머가 본 테스트에 사용되었다.
표 One-Step Direct WGA-PCR 기술 개발의 위한 조건 set-up. 담배 잎으로부터 분리/정제된 10 ng의 gDNA와 담배 actin 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 One-Step WGA-PCR 반응의 set-up.
표 One-Step Direct WGA-PCR 기술 개발의 위한 조건 set-up. 담배 잎 조직을 직접 사용하여 담배 actin 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 One-Step Direct WGA-PCR 반응의 set-up.

과제명(ProjectTitle) :	-
연구책임자(Manager) :	-
과제기간(DetailSeriesProject) :	-
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