[보고서]비목재 자원을 활용한 바이오신소재 개발: 고온성 효모(KM) 세포공장 플랫폼 구축 및 그린바이오 신소재 생산기술 개발

보고서 정보

주관연구기관

한국생명공학연구원
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

보고서유형

최종보고서

발행국가

대한민국

언어

한국어

발행년월

2015-07

과제시작연도

2014

주관부처

농림축산식품부
Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

등록번호

TRKO201600000136

과제고유번호

1545007952

사업명

농생명산업기술개발

DB 구축일자

2016-03-19

DOI

https://doi.org/10.23000/TRKO201600000136

표 [그림. DOE fund for bioenergy]
표 그림 1-1. 기내배양 중인 돼지감자 배양시스템과 포트묘의 모습
표 그림 1-2. 돼지감자의 하우스재배 및 수확 모습
표 그림 1-3. 노지재배 및 수확기계를 사용한 수확 그리고 건조기를 사용한 건조
표 그림 1-4. 노지 재배에서 옥수수와의 수확량 비교
표 그림 1-5. 돼지감자의 재분화 사진. A) 암 배양 4주 후; B) 명 배양으로 옮긴 후 1주 후; C) 명 배양 4주 후; D),D-1) 유식물체;E),E-1) callus; F),F-1),F-2 rooting 후 pot로 이식
표 그림 1-6. 각 호르몬 유래별 식물체의 재분화 실험 사진
표 그림1-7. Agrobactrium-mediated 돼지감자 GUS 형질 전환시 agro strain 별 GUS 발현 양상
표 그림1-8. 배양일에 따른 GUS 유전자 발현 양상 비교
표 그림1-9. 돼지감자 잎으로부터 발굴된 contig들의 크기별 분포
표 그림1-10. 돼지감자 tuber로부터 발굴된 contig들의 크기별 분포
표 그림 1-11. 돼지감자 cDNA로부터 SST-1 gene 추출 실험.
표 그림 1-12. 확인된 SST-1 gene을 식물 발현 벡터 pEarleyGate103 vector로 클로닝결과
표 그림 1-13. Inulin 합성을 유도하기 위해 cv. Desiree에 형질전환 시켜 shooting 유도.
표 그림 1-14. Shooting된 개체들을 MS medium + 1 mg/L Basta + 500 mg/LCarbenicillin에서 rooting 유도 .
표 그림1-15. Rooting 유도된 개체에서 SST-1, FFT-1, SST-1/FFT-1 유전자가 들어가있는 형질전환체를 selection 하기 위해 식물체로부터 genomic DNA를 추출하여 PCR를 수행해 DNA수준에서 검정.
표 그림 1-16. RNA level 에서의 RT-PCR을 이용한 SST-1, FFT-1 발현 확인.
표 그림1-17. SST-1과 FFT-1의 발현율이 높은 개체를 selection 하기 위한 quantitative PCR (Real-time PCR)
표 그림 1-18. HPLC 분석법에 의한 SST-1 및 FFT-1 형질전환체의 fructan 분석
표 그림 1-19. SST-1+FFT-1의 공동발현을 위한 형질전환 감자 식물체 개발
표 그림 1-20. SST-1+FFT-1발현 형질전환체의 genomicPCR 검출
표 그림 1-21. RNA level 에서의 RT-PCR을 이용한 SST-1, FFT-1 발현 확인
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 <그림 2-5. Effects of ARP treatment conditions for glucose
표 <그림 2-6. Effects of ARP treatment conditions for lignin
표 기타
표 그림 2-8. 침출 전처리 장치의 모식도
표 그림 2-9. 150℃에서의 전처리 조건별 침출공정 후 성분분석
표 그림 2-10. 170℃에서의 전처리 조건별 침출공정 후 성분분석
표 그림 2-11. 190℃에서의 전처리 조건별 침출공정 후 성분분석
표 그림 2-11. 150℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 농도.
표 그림 2-12. 150℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 전환율.
표 그림 2-13. 170℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 농도.
표 그림 2-14. 170℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 전환율.
표 그림 2-15. 190℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 농도.
표 그림 2-16. 190℃에서의 전처리 조건별 침출 공정 후 효소당화 글루코스 전환율.
표 그림 2-17. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on solid remaining of pretreated Jerusalem artichoke residue by aqueous ammonia
표 그림 2-18. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on glucose recovery yield of pretreated Jerusalem artichoke residue by aqueous ammonia
표 그림 2-19. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on delignification yield of pretreated Jerusalem artichoke residue by aqueous ammonia
표 그림 2-20. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on enzymatic digestibility of pretreated Jerusalem artichoke residue by aqueous ammonia
표 그림 2-21. 암모니아수에 의한 침출 전처리의 최적 조건으로 전처리된 바이오매스의 효소당화
표 그림 2-22. Mass balance of pretreatment by 20 wt% Aqueous ammonia at 163.2℃ for 40 min
표 그림 2-23. Mass balance of pretreatment by Hot-water at 163.2℃ for 40 min
표 그림 2-24. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on solid remaining of pretreated Jerusalem artichoke residue by sulfuric acid solution
표 그림 2-25. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on glucose recovery yield of pretreated Jerusalem artichoke residue by sulfuric acid solution
표 그림 2-26. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on delignification yield of pretreated Jerusalem artichoke residue by sulfuric acid solution
표 그림 2-27. The surface response plot of the effects of concentration, temperature and reaction time on enzymatic digestibility of pretreated Jerusalem artichoke residue by sulfuric acid solution
표 그림 2-28. 황산 용액에 의한 침출 전처리의 최적 조건으로 전처리된 바이오매스의 효소당화
표 그림 2-29. Mass balance of pretreatment by 0.5 wt% Sulfuric acid solution at 169.7℃or 20 min
표 그림 2-30. Mass balance of pretreatment by Hot-water at 169.7℃or 20 min
표 그림 2-31. 2단 전처리 공정에 의해 전처리된 바이오매스의 효소당화
표 그림 2-32. Mass balance of pretreatment by 20 wt% Aqueous ammonia for 40 min and Hot-water for 40 min at 163.2℃
표 그림 2-33. Mass balance of pretreatment by Hot-water for 40 min and 20 wt% Aqueous ammonia for 40 min at 163.2℃
표 그림 2-34. Mass balance of pretreatment by 0.5 wt% Sulfuric acid solution for 20 min and Hot-water for 20 min at 169.7℃
표 그림 2-35. Mass balance of pretreatment by Hot-water for 20 min and 0.5 wt% Sulfuric acid solution for 20 min at 169.7℃
표 그림 2-36. Mass balance of pretreatment by 20 wt% Aqueous ammonia for 40 min at 163.2 ℃ and 0.5 wt% Sulfuric acid solution for 20 min at 169.7℃
표 그림 2-37. Mass balance of pretreatment by 0.5 wt% Sulfuric acid solution for 20 min at 169. 7℃and 20 wt% Aqueous ammonia for 40 min at 163.2 ℃
표 그림 2-38. Schematic design for twin screw extrusion process.
표 그림 3-1. 일루미나 플랫폼을 이용한 일반적인 de novo assembly 방법.
표 그림 3-2. 라이브러리 제작을 위한 두 종류의 insert DNA의 크기 분포. A, short insert library. B, long insert mate-pair library.
표 그림 3-3. Per base quality.
표 그림 3-4. CLC Genomics Workbench ver. 4.0.3로 획득한 de novo assembly의 contig 길이 분포.
표 그림 3-5. KM01 draft sequence에 mapping한 5 kb mate-library read(paired end sequencing)의 실제 mate간 거리.
표 그림 3-6. SOAPdenovo를 이용한 조립 결과. 컬럼에 대한 설명
표 그림 3-6. Short insert library read로만 구성한 SOAPdenovo 스캐폴드에 5 kb mate-pair library read를 매핑하였을 때 나타난 paired end distance 분포.
표 그림 3-7. Overlapping pseudoread를 이용한 가상적인 assembly 구조의 작성. A,개념도. B, ace 파일 로 전환한 pseudoassembly를 consed에서 연 모습.
표 그림 3-6. Optical mapping 결과.
표 그림 3-7. Fosmid end read의 수동 편집.
표 그림 3-8. Fosmid end read에서 발견된 telomeric repeat의 예.시작 부분은 빨강색 서열은 fosmid 벡터의 클로닝 사이트 일부이며, 파랑색 문자열(25 bp)은 맨 앞과 끝에 위치한 반복 단위를 표시한 것임.
표 그림 3-9. A, telomeric tandem repeat을 포함하는 fosmid end read pair가 상당한 크기의 sequence gap을 사이에 두고 contig 말단에 매핑된 모습. B, fosmid clone을 임의로 선정하여 full length shotgun sequencing을 실시한 결과 NGS로 구성된 기존의 assembly가 대단히 정확 함을 입증하였음(26-kb 구간에 대해 단 하나의 오류).
표 그림 3-10. Ribosomal RNA gene의 구조.
표 그림 3-11. Assembly validation. A, KM02 assembly(가로축)과 SOAPdenovo assembly의 비교. B, 불일치가 관찰되는 3번 scaffold의 fosmid end read mapping 현황, C, optical mapping 결과.
표 그림 3-12. 최종 assembly인 KM02r2. 파랑색 삼각형은 telomeric repeat이 있는 곳.
표 그림 3-13. KM01 버전에 대한 유전체 주석화 과정.
표 그림 3-14. AutoFACT가 제공하는 html 결과 파일.
표 그림 3-15. 임시로 구축한 GBrowse 기반의 K. marxianus 유전체 브라우저.
표 그림 3-16. ERGO web site의 스크린샷.
표 그림 3-17. A, RATT의 실행 순서(출처: http://ratt.sourceforge.net/). B. 실제 KM 유전체 서열에 대한 RATT 실행 로그
표 그림 3-18. YGOB에서 출력한 효모 염색체 CEN 주변의 유전자 분포.
표 그림 3-18. A, RNA-seq alignment와 de novo assembly를 이용한 전사체 조립. B, Broad Institute의 유전체 주석화 과정. 자료 출처: Haas et al., 2011)
표 그림 3-19. Evidence gene model의 구축
표 그림 3-20. Gene model의 집계
표 그림 3-21. JBrowse 스크린샷.
표 그림 3-22. KM01 version의 whole-genome alignment plot(MUMmer).
표 그림 3-23. DMKU 3-1042와 KM(scaffolds only)의 MUMmer alignment.
표 그림 3-24. K. marxianus DMKU 3-1042의 미토콘드리아 게놈 서열(AP012221)에 대한 reference mapping 결과. CLC Genomics Workbench ver. 8.0의 스크린 샷.
표 그림 3-25. RNA-seq 결과의 per base quality.
표 그림 3-26. 각 배양 조건에 따른 유전자의 발현 수치 비교.
표 그림 3-27. Agilent genome tiling array 설계에 사용한 어셈블리의 오류.
표 그림 3-28. KM 표준균주(KCTC 17555)에 대한 MA plot.
표 그림 3-28. KM 표준균주(KCTC 17555)에 대한 MA plot.
표 그림 3-29. 산출된 significant probe의 사례(일부).
표 그림 3-30. A, Nuclear rRNA gene의 반복 구조.
표 그림 3-31. PCR 증폭에 사용한 프라이머의 위치와 방향 정보
표 그림 3-32. rRNA gene 영역을 이용하여 작성한 계통수, A, maximum likelihood. B, maximum parsimomy. 노랑색 원은 유전체 해독 대상 균주이고 별표는 1-3차년도에 집중적으로 유전체를 해독하여 완성 수준까지 진행한 KCTC 17555
표 그림 3-33. rRNA gene 영역을 이용하여 작성한 neighborNet 계통수.
표 그림 3-34. Ion Torrent PGM 시퀀싱 결과의 QC(CLC Genomics Workbench). A, read의 길이 분포. B, per base quality (FastQC).
표 그림 3-35. 1차 시퀀싱 결과의 per base quality.
표 그림 3-36. Contig의 길이 구간에 대한 수-합계 분포.
표 그림 3-36. 2차 시퀀싱 결과의 per base quality.
표 그림 3-37. BY25571을 일루미나 시퀀싱 데이터만으로 de novo assembly 한 결과(위)와 Ion Torrent PGM 데이터를 혼합하여 처리한 결과(아래)의 비교
표 그림 3-38. Illumina Hiseq 2000(A)과 Ion Torrent PGM(B)의 quality distribution 비교.
표 그림 3-39. De novo assembly 결과가 양호한 KM 관련 균주 4종을 1-3차년도 주력 해독 균주인 KCTC 17555 및 2종의 완성된 참조 서열(DMKU 3-1042 및 K. lactis ) 비교하였음.
표 그림 3-40. KM 미토콘드리아 게놈 서열의 비교. A, DMKU 3-1042를 기준으로 한 MUMmer plot. B, complete linkage 방법으로 작성한 average nucleotide identity 기반의 cluster dendrogram.
표 그림 4-1. 각 균주들의 고온내성 확인
표 그림 4-2. Zeocin cassette를 이용한 URA3 gene disruption 과정
표 그림 4-3. G418 cassette를 이용한 URA3 gene disruption 과정
표 그림 4-4. pBlue-KmURA3 및 pBlue-KmURA3-library vector
표 그림 4-5. pBlue-FR A, pBlue-FR B vector
표 그림 4-6. 5종의 ARS 염기서열 분석
표 그림 4-7. K. marxianus ARS를 포함한 CalB14 발현 vector의 제조 과정
표 표 4-4 B. Km25571 형질전환체들의 리파제 활성 분석
표 그림 4-8. Lipase 유전자 초고속 개량을 위한 발현 vector의 제조 과정과 고활성 lipase의 선별과정
표 그림 4-9. 각 변이주들의 lipase 활성 분석
표 표 4-5. 각 변이주들의 염기서열 분석
표 그림 4-10. pYG418-F1, F2 및 F3 및 K. marxianus 유전자 library 제조과정
표 그림 4-11. URA3 cassette를 이용한 ADH gene disruption 과정
표 그림 4-12. ST3-CalB14 유전자 도입을 위한 효모 integration
표 그림 4-13. 18s rDNA에 도입된 리파제 활성 비교
표 그림 4-14. 2 copy로 도입된 균주의 lipase 활성 비교
표 그림 4-15. 4 copy로 도입된 균주 리파제 활성 비교
표 그림 4-16. 선별된 multicopy 균주들의 southern hybridization 분석
표 그림 4-17. KM 유래 lipase homology 비교
표 그림 4-18. K. maxianus 25571의 YPD 액체 배지에서의 성장곡선
표 그림 4-19. KM 17555의 intra & extra cellular protein에 대한 SDS-PAGE
표 그림 4-20. 분비단백질에 대한 상위 20개 단백질의 양(mol%)과 누적 단백질 비중(%)
표 그림 4-21. KM 유전자 library 제조과정
표 그림 4-22. 분비단백질 아미노말단 서열분석 결과
표 그림 4-23. CalB14 발현을 위한 K. marxianus vector
표 기타
표 표 4-13. 선별된 7종의 분비 융합인자
표 그림 4-25. hGH 또는 hIL2 발현을 위한 K. marxianus vector
표 그림 4-26. 형질전환체들의 SDS-PAGE 분석
표 그림 4-27. Endopolygalacturonase의 분비 발현 및 활성분석
표 그림 4-28. EPG1 유전자의 효모 TFP 벡터 도입을 위한 과정
표 그림 4-29. EPG1의 분비 발현 확인
표 그림 4-30. EPG1 발현을 위한 K. marxianus vector
표 그림 4-31. EPG1의 분비 발현 & 활성분석
표 그림 4-32. S. cerevisiae에서 EPG1의 분비 발현 및 활성분석
표 그림 4-33. K. marxianus에서 EPG1의 분비 발현 및 활성분석
표 그림 4-34. pH와 온도에 따른 효소 활성 확인
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 pckA, mdh, fumC, pckA-CBD, mdh-CBD 그리고 fumC-CBD의 His-tag 정제후 SDS-PAGE gel 그림
표 기타
표 기타
표 그림 5-18 대장균내에서 CBD 를 이용하여 숙신산 생산.
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 기타
표 그림 5-32 C. fimi유래 재조합섬유소분해효소의 대장균내 발현율 확인.
표 그림 5-33. C. fimi유래 재조합 섬유소 분해효소의 대장균 내 효소활성 확인.
표 기타
표 기타
표 기타
표 그림 6-1. 5종의 exo-cellulase 고발현 균주의 선별을 위한 SDS-PAGE 분석
표 그림 6-3. SfBGL1 발현을 위한 K. marxianus vector
표 그림 6-4. Esculin이 포함된 EGDA 평판배지에서 β-glucosidase 활성 분석
표 그림 6-5. Exo-cellulase 생산 효모균주의 유가식 발효배양 및 분비단백질 분석
표 그림 6-6 CfCex 고발현 균주의 선별을 위한 SDS-PAGE 분석 및 선별 벡터
표 그림 6-7. Deglycosylation을 통한 목적 단백질의 발현 확인
표 그림 6-8. Exoglucanase 생산 효모균주 Y2805-ST13-CfCex의 유가식 발효배양 및 분비단백질 분석
표 그림 6-9. 효모 TFP기술을 이용한 GH61E의 과발현 확인 및 최종 균주 선별
표 그림 6-9. 효모 TFP기술을 이용한 GH61E의 과발현 확인 및 최종 균주 선별
표 그림 6-10. 효모균주 Y2805-ST8-GH61E의 유가식 발효배양 및 세포 성장
표 그림 6-11. 24 종류 TFP를 이용한 CBM33 과발현 확인 및 최종 균주 선별
표 그림 6-12. 효모균주 Y2805Δgal80-ST19-CBM33의 유가식 발효배양 및 세포 성장
표 그림 6-13. 24 종류 TFP를 이용한 HiCDH 과발현 및 단일 균주 선별
표 표 6-9. 30분 동안의 OD 변화량을 분석하여 HiCDH의 Cellobiose 분해활성 비교
표 그림 6-14. 효모균주 Y2805-ST8-HiCDH의 유가식 발효배양 및 세포 성장
표 그림 6-15. Avicel을 이용한 KCC3 효소 칵테일과 보조 효소 GH61E, HiCDH,CBM과의 당화 시너지 효과
표 그림 6-16. 전처리 볏짚을 이용한 KCC3 효소 칵테일과 보조 효소 GH61E, HiCDH,CBM33, Cu(Ⅱ)과의 당화 시너지 효과
표 그림 6-17. Celluclast 1.5L과 KCC의 혼합 후 바이오매스의 당화
표 그림 6-18. 섬유소 바이오매스 돼지감자대의 산과 알칼리로 전처리 후 당화 (10% 고액비)
표 그림 4-21. lipase 표면발현 시스템
표 그림 6-20. 효모 세포 표면의 CalB 발현을 위한 발현 벡터 구축도
표 그림 6-21. 효모 세포 표면에 발현 된 CalB lipase-FITC의 immunofluorescencemicroscopy 분석
표 그림 6-22. 효모 세포 표면에 발현 된 CalB lipase-FITC의 flow cytometer 분석
표 그림 6-23. 효모 세포 표면의 minicellulosome 발현을 위한 발현 벡터 구축도
표 그림 6-24. Dockerin fused lipase의 평판 활성 확인 (C (control): Y2805-ST3-CalB)
표 그림 6-25. 유전체 정보 기반 표면발현 anchor 발굴
표 그림 6-26. 분리된 효모 Y-2의 YPD배지 내에서의 콜로니 모양 사진
표 그림 6-27. Pichia guilliermondii Y-2의 Phylogenetic tree
표 그림 6-28. 분리균주 Y-2의 cellulosic biomass로부터 유래하는 당들의 이용
표 그림 6-29. 분리균주의 glucose를 이용한 에탄올 발효
표 그림 6-30. Y-2 균주의 xylose를 이용한 세포생장과 xylose소모율
표 그림 6-31. Y-2균주의 xylose를 이용한 xylitol 생산
표 그림 6-32. 균주 Y-2 의 C5/C6 동시 발효를 통한 에탄올과 xylitol 생산
표 그림 6-33. 균주 Y-2 의 발효 폐액을 이용한 xylitol 의 생산
표 그림 6-34. Xylose 이용을 위한 metabolic pathway
표 그림 6-35. Xylose isomerase 유전자의 효모 TFP 벡터 도입을 위한 과정
표 그림 6-36. Xylose isomerase의 분비 발현 확인
표 그림 6-37. Single로 분리된 XI 분비발현 균주의 SDS-PAGE 분석과 xylose 소모 확인
표 그림 6-38. Y2805Δgal80 균주에 도입된 XI 분비발현 균주의 SDS-PAGE 분석 및 xylose 소모량 확인
표 그림 6-39. 유가식 발효를 통한 xylose isomerase의 대량 생산
표 그림 6-40. 발효 생산된 xylose isomerase 단백질을 Ni-NTA 칼럼을 이용한 정제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석
표 그림 6-41. 온도, pH 및 금속이온 종류에 따른 xylose isomerase의 상대적 효소 활성
표 그림 6-42. XI를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/T3-XI·H6)의 마그네슘함유 배지에서의 세포성장 및 xylose 소모량 분석
표 그림 6-43. XI를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/T3-XI·H6)의 망간 함유배지에서의 세포성장 및 xylose 소모량 분석
표 그림 6-44. XI를 발현하는 재조합 효모균주(Y2805Δgal80/T3-XI·H6)의 망간과 마그네슘 함유 배지에서의 세포성장 및 xylose 소모량 분석
표 그림 6-45. Xylose isomerase의 intracellular, extracellular 발현균주의 xylose 소모
표 그림 6-46. Xylose isomerase의 세포내/외 동시발현 균주의 단백질 발현과 xylose 소모 확인
표 그림 6-47. Xylose isomerase의 세포내/외 동시발현 균주의 xylose 소모 및 에탄올생산 확인
표 그림 6-48. XR, XDH 및 XK 유전자 도입을 위한 효모 integration 벡터
표 그림 6-49. 재조합 균주별 Glucose와 xylose 혼합 기질에서의 에탄올 생산 비교
표 그림 7-1. L-LDH 또는 D-LDH 발현을 위한 K. marxianus vector
표 그림 7-2. 형질전환체들의 SDS-PAGE 분석
표 그림 7-3. Glucose로부터 고농도의 lactic acid 생산
표 그림 7-4. Inulin 농도에 따른 lactic acid 생산량 분석>
표 그림 7-5. 돼지감자 전분으로부터 고농도의 lactic acid 생산
표 그림 7-6. 유가식 발효를 통한 고농도의 lactic acid 생산
표 그림 7-7. pH에 따른 세포 성장 확인
표 그림 7-8. 효모 이용 lactic acid 생산을 위한 대사경로 및 대사공학
표 그림 7-9. URA3 cassette를 이용한 KmCYB2 gene disruption 과정
표 그림 7-10. URA3 cassette를 이용한 KmDLD1 gene disruption 과정
표 그림 7-11. L-LDH 또는 D-LDH 발현을 위한 K. marxianus vector
표 그림 7-12. Glucose로부터 고농도의 lactic acid 생산
표 그림 7-13. 돼지감자 전분으로부터 고농도의 lactic acid 생산. A: L-LA, B :D-LA
표 그림 7-14. PKM 균주의 lactate에 대한 저항성 확인
표 그림 7-15. Zeocin cassette를 이용한 URA3 gene disruption 과정
표 그림 7-16. NTC cassette를 이용한 URA3 gene disruption 과정
표 그림 7-17. Zeocin, NTC, Uracil 배지에서 성장여부 확인
표 그림 7-18. Haploid 균주 선별 및 ploidy 확인
표 그림 7-19. URA3 cassette를 이용한 PDC1 유전자 disruption 과정
표 그림 7-20. PDC1 결실 균주의 세포상장에 따른 에탄올 발효
표 그림 7-21. D-LDH 유전자 발현 벡터 도입여부 확인
표 그림 7-22. PKM 균주의 젖산 생산 확인
표 그림 7-23. 균주 성장에 따른 젖산 생산
표 그림 7-24. 2단계 배양을 통한 lactic acid 발효
표 그림 7-25. 2단계 배양을 통한 lactic acid 발효
표 그림 7-26. 돼지감자 이눌린으로부터 고농도의 D-lactic acid 생산
표 그림 7-27. Ergosterol 농도에 따른 lactic acid 생산량 분석
표 그림 7-28. 글리세롤 농도에 따른 lactic acid 생산량 분석
표 그림 7-29. URA3 cassette를 이용한 PDC1 gene disruption 과정
표 그림 7-30. 세포성장에 따른 에탄올 생산량
표 그림 7-31. 형질전환체들의 SDS-PAGE 및 western blot 분석
표 그림 7-32. lactic acid 생산량 분석
표 그림 7-33. 효모 균주들의 lactate 저항성 확인
표 그림 7-34. D-LDH 발현을 위한 S. cerevisiae vector
표 그림 7-35. 형질전환체들의 SDS-PAGE(좌) 및 western blot 분석(우)
표 그림 7-36. 세포성장에 따른 D-LDH 활성비교
표 그림 7-37. 배양시간에 따른 D-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-38. URA3 cassette를 이용한 PDC1 유전자 결실 과정
표 그림 7-39. 세포성장에 따른 D-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-40. URA3 cassette를 이용한 PDC5 유전자 결실 과정
표 그림 7-41. PDC1, PDC5 유전자 결실 균주의 glucose와 ethanol 농도에 따른 cell growth확인
표 그림 7-42. 세포성장에 따른 L-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-43. KEGG 데이터베이스를 활용한 전사체 결과의 대사회로 맵핑분석-steroid대사회로
표 그림 7-44. UPC2 발현을 위한 S. cerevisiae vector
표 그림 7-45. UPC2 과발현에 의한 ergosterol 생합성 관련 유전자의 transcript 변화
표 그림 7-46. UPC2 유전자 과발현에 따른 lactic acid 내성 테스트
표 그림 7-47. UPC2 유전자 과발현 효모와 모균주의 lactic acid 액체배지에서 세포성장 비교
표 그림 7-48. UPC2 과발현 균주의 D-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-49. UPC2 과발현 균주의 L-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-50. 배지조성 변화를 통한 UPC2 과발현 균주의 L-lactic acid 및 에탄올 생산량분석
표 그림 7-51. 분비발현된 β-glucosidase의 활성 비교 및 SDS-PAGE 분석
표 그림 7-52. 세포성장에 따른 탄소원 소비량 및 D-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-53. 형질전환체들의 SDS-PAGE 분석
표 그림 7-54. 배양상등액의 cellulase 단백질 CBH1과 CBH2의 섬유소 분해산물 농도분석 및 EGL에 의한 CMC 분해에 따른 halo형성분석
표 그림 7-55. 배양시간에 따른 D-lactic acid와 에탄올 생산량 분석
표 그림 7-56. XYN의 단백질 활성 분석 및 SDS-PAGE 분석
표 그림 7-57. 분비발현된 XylA 단백질에 의한 xylose 소모량 비교 및 SDS-PAGE
표 그림 7-58. 분비발현된 bXYL 단백질의 활성비교 및 SDS-PAGE 결과
표 그림 7-59. Xylan 분해에 따른 xylose 및 lactic acid생산량 비교 분석
표 그림 7-60. URA3 cassette를 이용한 GAL80 유전자 결실 과정
표 그림 7-61. CalB1422와 IL2 단백질 발현율 분석
표 그림 7-62. 형질전환체들의 SDS-PAGE 분석
표 그림 7-63. 여러 샘플에서 분리된 효모들
표 그림 7-64. 분리된 효모들의 ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA PCR 사진
표 그림 7-65. 분리균주의 pH에 따른 성장곡선
표 그림 7-65. 분리균주의 pH에 따른 성장곡선(계속
표 그림 7-66. 선별균주의 2차 배양
표 그림 7-67. Lactate에 대한 저항성 확인

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